專利名稱：基于生物酶技術的低聚半乳糖檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種食品工程技術領域的方法，具體是一種基于生物酶技術的低聚半乳糖檢測方法。
背景技術：
低聚半乳糖(feilacto-oligosaccharide，G0S)是以乳糖為底物，在具有半乳糖基轉移活性的酶半乳糖苷酶(EC3. 2. 1. 2 的作用下，首先將乳糖水解成半乳糖和葡萄糖，然后再將半乳糖轉移到乳糖的半乳糖基上生成的一類含有2 5個單糖分子的低聚糖， 分子式為(Gal)n-Glu, η = 2 4。低聚半乳糖的生物酶法生成過程見

圖1所示。在自然界，動物的乳汁中存在微量的低聚半乳糖，母乳中含量稍多。已證實的低聚半乳糖有幾十種，結構主要包括二糖(β-D-Gal-d — 6)-D-Glc、β-D-GaKl — 6)-D-Gal, β -D-Gal (1 — 3)-D-Gal, β -D-Gal (1 — 3)-D-Glc)；三塘(β -D-Gal (1 — 6) β -D-Gal (1 — 4) -D-Glc、β -D-Galp (1 — 3) - β -D-Gal (1 — 4) -D-Glc 、β -D-Galp (1 — 6 )-β -D-Glc (1 — 2-D-Gal 、β -D-Gal (1 — 3) - β -D-Gal (1 — 6) -D-Glc)；四糖(β -D-Gal ( 1 — 6) - β -D-Gal (1 — 6) - β -D-Gal (1 — 4) -D-Glc, β -D-Gal (1 — 6) - β -D-Gal (1 — 3) - β -D-G al (1 — 4) -D-Glc)和五糖(β -D-Gal (1 — 6) - β -D-Gal (1 — 6) - β -D-Gal (1 — 4) - β -D-Gal (1 —4) -D-Glc)等。低聚半乳糖具有許多獨特生理功能，例如1)促使雙歧桿菌的增殖，從而抑制有害細菌；2)減少有毒發(fā)酵產物及有害細菌酶的產生、抑制病原菌和腹瀉，攝入低聚半乳糖， 可有效地減少有毒發(fā)酵產物及有害細菌酶的產生。3)防止便秘；4)增強免疫力、抗腫瘤；5) 保護肝功能；6)合成維生素、促進鈣的消化吸收；7)低能量、不會引起齲齒。近年來，由于低聚半乳糖具有的獨特功能而成為一個新的研究熱點，作為一種食物配料被廣泛應用于乳制品、乳酸菌飲料、雙歧桿菌酸奶、谷物食品和保健食品中，尤其是應用于嬰幼兒和老年人的食品中。各種低聚半乳糖之間結構、性質相似，尤其是在其制備過程中，不免要生成葡萄糖、半乳糖以及殘留部分乳糖，且相同分子量的半乳糖之間不易分離純化，因此作為功能性成分而添加的GOS是一個單糖、乳糖及多種GOS的混合物。通過普通的分離和檢測方法很難實現(xiàn)對這些物質的進行分離和檢測，那么也就不能確定添加量和主要功能成分。迄今為止，專一性的分離和檢測低聚半乳糖的方法未見報道。通常都是參考低聚糖的分離檢測方法，主要有毛細管電泳法、高效液相色譜法、分光光度法、連續(xù)流動分析和氣相色譜分析。離子色譜法是分離和檢測低聚半乳糖的一個選擇。其檢測器一般采用電化學檢測器，其原理在于在堿性條件下，糖類的羥基帶電荷。羥基的數(shù)量、位置的不同而帶電性不同。因此可以通過離子交換，檢測其帶電性來分離和檢測不同的糖類。早在1986年，就有采用脈沖安培檢測技術，將普通的安培檢測器改進成三電位的脈沖安培檢測器，檢測樣的信號僅為第一個脈沖電勢(糖的氧化檢測)，而第二、三個電位分別是清洗電位(使電極表面吸附的氧化產物脫離電極表面)和再活化電位(使電極表面還原為原初狀態(tài))，通過三個電位的循環(huán)，維持電極的活性，使之成為較好的糖分析方法。早期的三電位檢測法很快被美國戴安公司(Dionex)采用，并推出了三電位安培檢測器和專門進行糖分析的陰離子色譜柱等專利產品。但該方法也并不完美，清洗電位的使用容易導致電極表面發(fā)生化學腐蝕和金電極表面凹陷，從而使靈敏度下降。近年來，戴安公司又推出了四電位積分脈沖安培檢測法，即在實驗過程中使用四個不同的電位，即糖的氧化(糖的檢測)、電極還原清洗(使電極表面吸附的氧化產物脫離電極表面)、電極氧化清洗(使電極表面氧化)和電極表面活化電位(使電極表面還原為原初狀態(tài))。該點位具有靈敏度高、 重現(xiàn)性好的優(yōu)點，基本上消除了電化學腐蝕和金電極表面的凹陷現(xiàn)象。該方法靈敏度高，如果所用的流動相和檢驗樣品不是特別純，微小的雜質也能夠被分離和檢測到，進而盡可能地消除了干擾。實驗結果證明該方法可靠，能夠將低聚糖混合物中各種低聚半乳糖有效地分離并準確地檢測含量，為具有生物活性的低聚半乳糖產品的應用奠定了基礎。經過對現(xiàn)有技術的檢索發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有文獻多是參考糖的檢測方法，主要使用高效液相色譜法、分光光度法和氣相色譜法。這些方法能夠檢測葡萄糖、果糖、蔗糖和總糖量。但是該現(xiàn)有技術不能夠將生物酶法制備過程中生成的各種低聚半乳糖分離并檢測含量。因為生物酶法制備過程中生成的各種低聚半乳糖之間結構相似，性質相近。近尤其是在其制備過程中，生成的半乳糖以及殘留部分乳糖很容易相互結合生成新的低聚半乳糖。因此作為功能性成分的低聚半乳糖是一多種糖的混合物。通過普通的檢測方法很難實現(xiàn)對這些物質的進行分離和檢測，那么也就不能確定量和主要功能成分。經過檢索國家知識產權局數(shù)據(jù)中心(www. sipo. gov. cn)、世界產權組織(www. wipo. int)、歐洲專禾丨J局(www. espacenet. com) 和美國專利商標局(www.uspto. gov)沒有發(fā)現(xiàn)與專利申請文件相同的專利授權。李建文、王竹和楊月欣2006年發(fā)表的“高效離子色譜法測定糖漿中低聚半乳糖含量”(“衛(wèi)生研究” 2006年第5期)記載了一種在A0AC2001.02方法基礎上以高效離子色譜-脈沖安培檢測可溶性膳食纖維糖漿中的低聚半乳糖的方法。該技術能夠測定可溶性膳食纖維糖漿中的半乳糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖和果糖和低聚半乳糖總量。但是還不能將結構相似、性質相的各種低聚半乳糖進行有效分離并檢測各個低聚半乳糖的含量。文章中未見實際的分析圖譜，只是標準品檢測圖譜。而且分子量相同的半乳糖和葡萄糖分離效果欠佳。

發(fā)明內容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術存在的上述不足，提供一種基于生物酶技術的低聚半乳糖檢測方法，適用于含低聚半乳糖的牛乳及低聚半乳糖溶液體系(即不含蛋白質、脂肪、礦物質等，只含低聚半乳糖)中各種低聚半乳糖成分的分離和檢測。能夠減少或避免前面所提到的生物活性低聚半乳糖產品難以確定功能性成分及其添加量的問題，本發(fā)明采用離子色譜法，利用離子交換和梯度洗脫的方法對低聚半乳糖進行分離，配合四電位脈沖安培檢測器進行檢測，能夠除掉樣品中的蛋白質、脂肪以及可能存在的乳化劑等大分子物質對分析柱、 檢測器等的污染和干擾，使檢測精準、快速。本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的，本發(fā)明首先采用三氯乙酸及乙酸鉛脫蛋白質法對待測對象進行預處理后通過膜過濾去掉雜質獲得待測樣品，然后用不同濃度的氫氧化鈉和乙酸鈉進行離子交換和梯度洗脫，最后用四電位脈沖安培檢測器進行檢測。所述的待測對象是指只含低聚半乳糖的牛乳及低聚半乳糖溶液體系。所述的預處理是指對待測對象中加入濃度為wt.的三氯乙酸溶液5毫升及 2% wt.的乙酸鉛溶液，搖勻，超聲20min，4°C，15000rpm，離心lOmin，取上清液。所述的膜過濾是指通過0. 22 μ m纖維素膜進行過濾后采用2. 5cc,已經過IOmL 甲醇、15mL水活化的OnGuard II RP柱并棄去初始6mL樣品后收集2mL待測樣品。所述的離子交換是指使用配有GP50梯度泵、ED50電化學檢測器Chromeleon 色譜工作站的DX-600型離子色譜儀，采用4mm X 250mm的CarboPacTMPA20分析柱和 4mmX 50mm的Carbc^ac PA20保護柱對低聚半乳糖進行分離。所述的離子交換使用的流動相包括色譜級超純水、125mmol/L NaOH和2mol/L乙酸鈉。所述的離子交換和梯度洗脫的條件為洗脫時間90分鐘，流速為lmL/min，流動相依依次為7-90% wt.的125mmol/L NaOH,9. 8-93. 1% wt.的色譜級超純水以及0. 1-0. 5% wt.的2mol/L乙酸鈉。所述的離子交換和梯度洗脫的條件具體為
權利要求
1.一種基于生物酶技術的低聚半乳糖檢測方法，其特征在于，首先采用三氯乙酸及乙酸鉛脫蛋白質法對待測對象進行預處理后通過膜過濾去掉雜質獲得待測樣品，然后用不同濃度的氫氧化鈉和乙酸鈉進行離子交換和梯度洗脫，最后用四電位脈沖安培檢測器進行檢測。
2.根據(jù)權利要求1所述的基于生物酶技術的低聚半乳糖檢測方法，其特征是，所述的預處理是指對待測對象中加入濃度為wt.的三氯乙酸溶液5毫升及2% wt.的乙酸鉛溶液，搖勻，超聲20min，4°C，15000rpm,離心lOmin，取上清液。
3.根據(jù)權利要求1所述的基于生物酶技術的低聚半乳糖檢測方法，其特征是，所述的膜過濾是指通過0. 22 μ m纖維素膜進行過濾后采用2. 5cc,已經過IOmL甲醇、15mL水活化的OnGuard II RP柱并棄去初始6mL樣品后收集2mL待測樣品。
4.根據(jù)權利要求1所述的基于生物酶技術的低聚半乳糖檢測方法，其特征是，所述的離子交換是指使用配有GP50梯度泵、ED50電化學檢測器Chrome 1 eon色譜工作站的DX-600型離子色譜儀，采用4mmX250mm的CarboPacTMPA20分析柱和4mmX50mm的 Carbc^acTMPA2()保護柱對低聚半乳糖進行分離。
5.根據(jù)權利要求1所述的基于生物酶技術的低聚半乳糖檢測方法，其特征是，所述的離子交換使用的流動相包括色譜級超純水、125mmol/L NaOH和2mol/L乙酸鈉。
6.根據(jù)權利要求1或5所述的基于生物酶技術的低聚半乳糖檢測方法，其特征是，所述的離子交換和梯度洗脫的條件為洗脫時間90分鐘，流速為lmL/min，流動相依依次為 7-90% wt.的 125mmol/LNa0H，9. 8-93. l%wt.的色譜級超純水以及0. 1-0. 5%wt.的 2mol/ L乙酸鈉。
7.根據(jù)權利要求6所述的基于生物酶技術的低聚半乳糖檢測方法，其特征是，所述的離子交換和梯度洗脫的條件具體為時間(min)流速(mL/min)流動相(％)125mmoI/ LNaOH色譜級超純水2moI/L 乙酸鈉初始狀態(tài)1.07.092.90.1
8.根據(jù)權利要求1所述的基于生物酶技術的低聚半乳糖檢測方法，其特征是，所述的檢測是指在室溫環(huán)境下以lmL/min流速，進樣體積20yL，采用倆字交換和梯度洗脫法， 通5psi氮氣檢測，使用四電位脈沖安培檢測器采用波形檢測法，其檢測電壓分別為El = +0. 10V、E2 = -2. 00V, E3 = +0. 60V 和 E4 = -0. IOV。
全文摘要
一種食品工程技術領域的基于生物酶技術的低聚半乳糖檢測方法，首先采用三氯乙酸及乙酸鉛脫蛋白質法對待測對象進行預處理后通過膜過濾去掉雜質獲得待測樣品，然后用不同濃度的氫氧化鈉和乙酸鈉進行離子交換和梯度洗脫，最后用四電位脈沖安培檢測器進行檢測。本發(fā)明適用于含低聚半乳糖的牛乳及低聚半乳糖溶液體系中各種低聚半乳糖成分的分離和檢測，采用離子色譜法，利用離子交換和梯度洗脫的方法對低聚半乳糖進行分離，配合四電位脈沖安培檢測器進行檢測，能夠除掉樣品中的蛋白質、脂肪以及可能存在的乳化劑等大分子物質對分析柱、檢測器等的污染和干擾，使檢測精準、快速。
文檔編號G01N30/02GK102353730SQ20111018475
公開日2012年2月15日 申請日期2011年7月4日 優(yōu)先權日2011年7月4日
發(fā)明者余芳, 張少輝, 潘彬也, 鐘瑞強 申請人:上海交通大學