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一種測(cè)定百草枯血藥濃度的方法

文檔序號(hào):6013307閱讀:1360來源:國(guó)知局
專利名稱:一種測(cè)定百草枯血藥濃度的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種測(cè)定百草枯血藥濃度的方法。
背景技術(shù)
百草枯(paraquat)又名克無蹤、對(duì)草快,化學(xué)名稱為1,Γ - 二甲基_4,4'-聯(lián)吡啶二氯化物,分子量257. 2,為中等毒性的有機(jī)雜環(huán)類接觸性脫葉劑及除草劑。百草枯可經(jīng)皮膚、呼吸道及消化道吸收,通過血液循環(huán)幾乎分布于所有組織和器官,肺中濃度較高, 中毒機(jī)理與超氧陰離子的產(chǎn)生有關(guān)。由于目前尚無特效解毒劑,因此目前百草枯中毒后死亡率較高。因?yàn)榘俨菘莸难帩舛扰c死亡率密切相關(guān),因此建立一種百草枯血藥濃度的測(cè)定方法非常必要,以實(shí)現(xiàn)對(duì)中毒患者體內(nèi)百草枯血藥濃度的較快監(jiān)測(cè),從而為臨床百草枯中毒患者的搶救贏得寶貴的時(shí)間。目前百草枯血藥濃度的測(cè)定方法主要有氣相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳質(zhì)譜聯(lián)用法和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法,其中以高效液相色譜法(HPLC)最為常用。例如《中國(guó)法學(xué)雜志》2007年第22卷第6期第388-389頁公開的“高效液相色譜法測(cè)定生物體液中百草枯”和《中國(guó)法學(xué)雜志》2004年第19卷第3期第160-161頁公開的 “高效液相色譜法測(cè)定人血液中的百草枯”,都是使用離子交換固相萃取法對(duì)百草枯血漿樣本進(jìn)行預(yù)處理,存在樣本處理過程復(fù)雜且花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn);另外,雖然在流動(dòng)相中加入了離子對(duì)試劑辛烷基磺酸鈉來改善百草枯的峰形,但百草枯色譜峰的拖尾形象依然存在;采用外標(biāo)法,操作誤差會(huì)影響到檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性;百草枯的保留時(shí)間為12min左右,超過了 IOmin0《中國(guó)法學(xué)雜志》2009年第M卷第4期第沈7_268頁公開的“HPLC法測(cè)定百草枯急性中毒大鼠的體內(nèi)分布”雖然采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)大鼠體內(nèi)的百草枯進(jìn)行了測(cè)定,內(nèi)標(biāo)物為乙基百草枯,但樣本的預(yù)處理仍使用離子交換固相萃取法,樣本處理過程復(fù)雜且花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng); 流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑辛烷基磺酸鈉來改善百草枯的峰形,但百草枯色譜峰的拖尾形象依然存在;百草枯的保留時(shí)間亦超過lOmin,為15min左右。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種樣本處理簡(jiǎn)便、干擾小、靈敏迅速的測(cè)定百草枯血藥濃度的方法。為了實(shí)現(xiàn)以上目的,本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種測(cè)定百草枯血藥濃度的方法,包括如下步驟
(1)樣品預(yù)處理
取血漿樣品,加入內(nèi)標(biāo)物卡馬西平的水溶液和蛋白沉淀劑乙腈,旋渦混合,再離心后取上清液進(jìn)樣;
(2)樣品分離
采用通用型C18液相色譜柱,高效液相系統(tǒng)采用通用型的二極管陣列檢測(cè)器及高壓泵,酸性流動(dòng)相使用離子對(duì)試劑,所述的酸性流動(dòng)相為3 mmol · L—1十二烷基磺酸鈉水溶液-0. 2%三氟乙酸水溶液-乙腈-水的混合液,等梯度洗脫; (3) 二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)
采用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)波長(zhǎng)為250 ^K)nm,測(cè)定內(nèi)標(biāo)物卡馬西平和百草枯的峰面積,以最小二乘法線形回歸計(jì)算出百草枯的血藥濃度。進(jìn)一步的,步驟(1)中蛋白沉淀劑乙腈的用量為蛋白沉淀劑乙腈的體積與血漿樣品的體積比為1:1。步驟(2)中的混合液中3 mmol · L—1十二烷基磺酸鈉水溶液、0. 2%三氟乙酸水溶液、乙腈和水的體積比為3 mmol · L—1十二烷基磺酸鈉水溶液0.洲三氟乙酸水溶液乙腈水=(23 33) (25 35) (30 40) (2 12)。酸性流動(dòng)相的流速為1. 0 mL · HiirT1,柱溫為25 30°C。本發(fā)明提供的測(cè)定百草枯血藥濃度的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)
1、血漿樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單方便,直接使用有機(jī)溶劑乙腈沉淀蛋白質(zhì),經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后發(fā)現(xiàn),當(dāng)乙腈與血漿樣品的體積比為1:1時(shí),蛋白沉淀效果最好,內(nèi)源性干擾物質(zhì)少,而且由于省略了提取的步驟,因此血漿樣品的預(yù)處理簡(jiǎn)便快速,適用于臨床常規(guī)檢測(cè)。2、流動(dòng)相選用十二烷基磺酸鈉(SDS)-三氟乙酸(TFA)-乙腈-水的混合液,離子對(duì)試劑SDS和TFA的使用改善了百草枯色譜峰峰形不對(duì)稱、峰展寬和拖尾現(xiàn)象,同時(shí)避免了血漿中雜峰的干擾,取得了良好的分離效果,提高了檢測(cè)結(jié)果的可靠性。3、采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定百草枯血藥濃度,使用卡馬西平為內(nèi)標(biāo)物,減少了操作誤差對(duì)檢測(cè)結(jié)果帶來的影響。4、采用本發(fā)明提供的測(cè)定百草枯血藥濃度的方法測(cè)得的內(nèi)標(biāo)物卡馬西平和百草枯的保留時(shí)間分別為5. 5 5. Smin和6. 5 7. Omin,血漿樣品從進(jìn)樣到得出檢測(cè)結(jié)果整個(gè)色譜分析過程只需8分鐘,提高了百草枯的檢測(cè)速度,大大縮短了樣品的測(cè)定周期,達(dá)到了靈敏迅速的測(cè)定百草枯血藥濃度的目的,適于臨床百草枯中毒患者的急救監(jiān)測(cè)。與現(xiàn)有的百草枯血藥濃度的檢測(cè)方法相比,本發(fā)明的測(cè)定百草枯血藥濃度的方法血漿樣品預(yù)處理簡(jiǎn)便、檢測(cè)過程靈敏快速,在實(shí)際應(yīng)用中能較快確定中毒物質(zhì)及其血藥濃度。本發(fā)明測(cè)定百草枯血藥濃度的方法測(cè)定的百草枯血藥濃度的線性范圍為0. 5 100. 0 mg ^r1,相對(duì)回收率標(biāo)準(zhǔn)偏差在5%以內(nèi),絕對(duì)回收率在75%以上,日內(nèi)、日間精密度標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。同時(shí),百草枯血漿樣品在室溫放置和冰凍保存條件下均具有良好的穩(wěn)定性,本發(fā)明適用于臨床百草枯中毒患者的血藥濃度檢測(cè)。


圖1為試驗(yàn)例中百草枯中毒患者張某入院后的血漿樣品經(jīng)樣品預(yù)處理后所得上清液的色譜圖,其中1代表內(nèi)標(biāo)物卡馬西平,2代表百草枯。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例本實(shí)施例測(cè)定百草枯血藥濃度的方法,步驟如下(1)樣品預(yù)處理
準(zhǔn)確吸取血漿樣品300 PL于1.5 mL EP管中,再向該1.5 mL EP管中加入1 g化―1的卡馬西平水溶液30 PL,之后再加蛋白沉淀劑乙腈300 μ ,渦旋混合1 min后,12000 r -min"1 離心10 min,取上清液300 PL于自動(dòng)進(jìn)樣器的樣品瓶中,設(shè)定2. 5 μ 進(jìn)樣檢測(cè);
(2)樣品分離
采用Agilent TC-C18 (4. 6 mmX 150mm,5 μ m)液相色譜柱,高效液相系統(tǒng)采用通用型的二極管陣列檢測(cè)器及高壓泵,酸性流動(dòng)相使用離子對(duì)試劑,酸性流動(dòng)相為3 mmol · L—1 十二烷基磺酸鈉水溶液-0. 2%三氟乙酸水溶液-乙腈-水的混合液,混合液中3 mmol · Γ1 十二烷基磺酸鈉水溶液、0.洲三氟乙酸水溶液、乙腈和水的體積比為3 mmol · L—1十二烷基磺酸鈉水溶液0.洲三氟乙酸水溶液乙腈水為28:30:35:7,酸性流動(dòng)相的流速為1. 0 mL · HiirT1,柱溫為30°C,等梯度洗脫;
(3)二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)
采用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)波長(zhǎng)為258nm,測(cè)定內(nèi)標(biāo)物卡馬西平和百草枯的峰面積,以最小二乘法線形回歸計(jì)算出百草枯的血藥濃度。本實(shí)施例測(cè)定百草枯血藥濃度的方法測(cè)定的內(nèi)標(biāo)物卡馬西平和百草枯的保留時(shí)間分別為5. 6min和6. 7min。本實(shí)施例測(cè)定百草枯血藥濃度的方法的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線取8支1. 5 mL EP管,分別加入不同濃度不同體積的百草枯標(biāo)準(zhǔn)工作液,再用空白血漿補(bǔ)充到體積為0. 3 mL,配成濃度相當(dāng)于 0. 5 mg · L-1、l· 0 mg · L-1、2. 5 mg · L-1、5. 0 mg · L-1UO. 0 mg · L-1、25. 0 mg · Γ1、 50. 0 mg · Γ\100. 0 mg · Γ1的血漿樣品,再按本實(shí)施例步驟(1)血漿樣品的預(yù)處理方法處理,測(cè)定百草枯峰面積As、內(nèi)標(biāo)物峰面積Ai,以As/Ai為縱坐標(biāo)y,以所對(duì)應(yīng)各點(diǎn)濃度 (C)為橫坐標(biāo)χ繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,經(jīng)最小二乘法線性回歸,得百草枯的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為 y=0. 02094x+0. 0038 (r=0. 999 9),線性范圍為 0. 5 100. 0 mg · I71。本實(shí)施例測(cè)定百草枯血藥濃度的方法的相對(duì)回收率配制低、中、高三種濃度 (1. 0,10. 0,50. 0 mg-Γ1)的百草枯血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液,每種濃度6份,再按本實(shí)施例步驟(1) 血漿樣品的預(yù)處理方法處理,之后檢測(cè),依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算檢測(cè)量,以檢測(cè)量與加入量之比計(jì)算相對(duì)回收率,結(jié)果顯示相對(duì)回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在5%以內(nèi),見表1所示。表1百草枯在人血漿的相對(duì)回收率
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定百草枯血藥濃度的方法,其特征在于,包括如下步驟(1)樣品預(yù)處理取血漿樣品,加入內(nèi)標(biāo)物的水溶液和蛋白沉淀劑乙腈,旋渦混合,再離心后取上清液進(jìn)樣;(2)樣品分離采用通用型C18液相色譜柱,高效液相系統(tǒng)采用通用型的二極管陣列檢測(cè)器及高壓泵,酸性流動(dòng)相使用離子對(duì)試劑,所述的酸性流動(dòng)相為3 mmol · L—1十二烷基磺酸鈉水溶液-0. 2%三氟乙酸水溶液-乙腈-水的混合液,等梯度洗脫;(3)二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)采用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)波長(zhǎng)為250 ^K)nm,測(cè)定內(nèi)標(biāo)物和百草枯的峰面積,以最小二乘法線形回歸計(jì)算出百草枯的血藥濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定百草枯血藥濃度的方法,其特征在于,所述的內(nèi)標(biāo)物為卡馬西平。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定百草枯血藥濃度的方法,其特征在于,步驟(1)中蛋白沉淀劑乙腈的用量為蛋白沉淀劑乙腈的體積與血漿樣品的體積比為1:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定百草枯血藥濃度的方法,其特征在于,所述混合液中3 mmol · L—1十二烷基磺酸鈉水溶液、0.洲三氟乙酸水溶液、乙腈和水的體積比為3 mmol · Γ1 十二烷基磺酸鈉水溶液0.洲三氟乙酸水溶液乙腈水=(23 33): (25 35): (30 40) (2 12)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定百草枯血藥濃度的方法,其特征在于,酸性流動(dòng)相的流速為 1. 0 mL · mirT1,柱溫為 25 30°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種測(cè)定百草枯血藥濃度的方法,包括如下步驟(1)樣品預(yù)處理取血漿樣品,加入內(nèi)標(biāo)物水溶液和蛋白沉淀劑乙腈,旋渦混合,再離心后取上清液進(jìn)樣;(2)樣品分離采用通用型C18液相色譜柱,酸性流動(dòng)相使用離子對(duì)試劑,所述的酸性流動(dòng)相為3mmol·L-1十二烷基磺酸鈉水溶液-0.2%三氟乙酸水溶液-乙腈-水的混合液;(3)二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)采用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)波長(zhǎng)為250~260nm,測(cè)定內(nèi)標(biāo)物和百草枯的峰面積,以最小二乘法線形回歸計(jì)算出百草枯的血藥濃度。本發(fā)明血漿樣品預(yù)處理簡(jiǎn)便、檢測(cè)過程靈敏快速,在實(shí)際應(yīng)用中能較快確定中毒物質(zhì)及其血藥濃度,臨床應(yīng)用價(jià)值高。
文檔編號(hào)G01N30/02GK102288696SQ20111018670
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月5日
發(fā)明者劉玲, 徐仁愛, 王勇, 王建剛, 邱相君 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)
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