專(zhuān)利名稱(chēng)：山羊痘正向間接血凝診斷試劑的制備方法及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種山羊痘正向間接血凝診斷試劑的制備方法及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
山羊痘是由山羊痘病毒屬山羊痘病毒(goat poxvirus，GTPV)引起的一種呈地方流行的高度接觸性傳染病。一年四季均可發(fā)生，春秋常見(jiàn)，不分性別、年齡、品種。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將山羊痘列為A類(lèi)重大傳染病，1999年中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部第96號(hào)公告將山羊痘列為國(guó)家一類(lèi)動(dòng)物疫病。近年來(lái)，我國(guó)二十多個(gè)省市相繼報(bào)導(dǎo)山羊痘發(fā)生流行， 給我國(guó)蓬勃興起的山羊養(yǎng)殖業(yè)造成了極大經(jīng)濟(jì)損失，帶來(lái)了嚴(yán)峻的威脅。常用的瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)方法，具有敏感性低、檢測(cè)速度慢、特異性不強(qiáng)等缺點(diǎn)。為此，需要建立一種敏感、 快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的方法來(lái)檢測(cè)山羊痘抗體，以有效地開(kāi)展山羊痘血清學(xué)監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于，提供一種山羊痘正向間接血凝診斷試劑的制備方法及檢測(cè)方法，該山羊痘正向間接血凝診斷試劑能夠快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)山羊痘抗體，試驗(yàn)敏感性高、檢測(cè)速度快，用于獸醫(yī)臨床上山羊痘抗體快速、大量檢測(cè)，為山羊痘的臨床診斷與預(yù)防控制提供參考依據(jù)。本發(fā)明的山羊痘正向間接血凝診斷試劑的制備方法，它包括以下步驟
第一，無(wú)菌采集健康綿羊靜脈血，加10倍量PBS，2 000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，洗5遍， 以0. ΙΜ—ρΗ 7. 4 7. 8磷酸緩沖液配成2. 5%的紅細(xì)胞懸液；
第二，將步驟一制得的紅細(xì)胞懸液與1%戊二醛以9:1體積比混合，于室溫下緩慢攪拌 Ih, 2000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，用磷酸緩沖液洗5遍，制得醛化紅細(xì)胞；
第三，將步驟二制得的上述醛化紅細(xì)胞沉淀物溶于10倍量的磷酸緩沖液中，再與等量純化山羊痘病毒混合，置于室溫條件下攪拌2小時(shí)，2000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，制得致敏紅細(xì)胞；所述的純化山羊痘病毒抗原含量控制在20 μ g/mL 200 μ g/mL之間；
第四，將步驟三制得的致敏紅細(xì)胞沉淀物用含0. 1% NaN3、1%新生犢牛血清的磷酸緩沖液洗滌5次，并攪拌混合，配成0. 8% 1%致敏紅細(xì)胞； 第五，分析檢測(cè)合格即制得正向間接血凝診斷試劑。山羊痘正向間接血凝診斷試劑檢測(cè)山羊痘抗體的方法，如上述所述的山羊痘正向間接血凝診斷試劑的制備方法制備的山羊痘正向間接血凝診斷試劑，其檢測(cè)步驟按常規(guī)正向間接血凝試驗(yàn)方法進(jìn)行。其步驟為在96孔V形板中進(jìn)行，每個(gè)樣品為一組，每組1 12孔加入PBS 50 μ L，然后在第一孔加入待檢樣品50 μ L，用移液槍逐孔稀釋至第11孔，棄 50yL，第12孔為PBS空白對(duì)照。最后每孔加入山羊痘正向間接血凝診斷試劑50 μ L，振蕩混合后，置室溫作用50min，判定結(jié)果。凡紅細(xì)胞沉積于孔底，集中呈1個(gè)圓點(diǎn)的為不凝集； 如紅細(xì)胞凝集，則分布于孔底周?chē)?。根?jù)紅細(xì)胞凝集的程度判斷陽(yáng)性反應(yīng)的強(qiáng)弱，以出現(xiàn)50%以上凝集現(xiàn)象(++)的血清最高稀釋度為檢測(cè)抗體的效價(jià)。所述試劑的檢測(cè)反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度20 25°C，反應(yīng)時(shí)間50min。本發(fā)明有益效果本發(fā)明的試劑及方法適用于獸醫(yī)臨床上快速、大量檢測(cè)山羊痘抗體，為山羊痘的臨床診斷與預(yù)防控制提供參考依據(jù)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和積極效果
(1)速度快與瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)相比，正向間接血凝試驗(yàn)檢測(cè)速度更快，在試劑準(zhǔn)備好的情況下，50分鐘即可判定結(jié)果；
(2)敏感性高能檢測(cè)出較低效價(jià)的抗體，敏感性較瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)高。


圖1為本發(fā)明的山羊痘正向間接血凝診斷試劑的制備流程圖。
具體實(shí)施例方式
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的山羊痘正向間接血凝診斷試劑各組分為pH 7. 4磷酸緩沖液、戊二醛、綿羊紅細(xì)胞、純化山羊痘病毒抗原、新生犢牛血清、NaN3。如圖1所示意，本發(fā)明的山羊痘正向間接血凝診斷試劑的制備方法，包括以下步驟
第一，無(wú)菌采集健康綿羊靜脈血，加10倍量PBS，2 000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，洗5遍， 以0. ΙΜ—ρΗ 7. 4 7. 8磷酸緩沖液配成2. 5%的紅細(xì)胞懸液；
第二，將步驟一制得的紅細(xì)胞懸液與1%戊二醛以9:1體積比混合，于室溫下緩慢攪拌 Ih, 2000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，用磷酸緩沖液洗5遍，制得醛化紅細(xì)胞；
第三，將步驟二制得的上述醛化紅細(xì)胞沉淀物溶于10倍量的磷酸緩沖液中，再與等量純化山羊痘病毒混合，置于室溫條件下攪拌2小時(shí)，2000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，制得致敏紅細(xì)胞；所述的純化山羊痘病毒抗原含量控制在20 μ g/mL 200 μ g/mL之間；
第四，將步驟三制得的致敏紅細(xì)胞沉淀物用含0. 1% NaN3、1%新生犢牛血清的磷酸緩沖液洗滌5次，并攪拌混合，配成0. 8% 1%致敏紅細(xì)胞； 第五，分析檢測(cè)合格即制得正向間接血凝診斷試劑。所述成分中致敏紅細(xì)胞濃度0. 8% 1. 0%，純化山羊痘病毒抗原含量控制在 20 μ g/mL 200 μ g/mL之間為最佳制備條件。山羊痘正向間接血凝診斷試劑檢測(cè)山羊痘抗體的方法，其檢測(cè)步驟按常規(guī)正向間接血凝試驗(yàn)方法進(jìn)行。其步驟為在96孔V形板中進(jìn)行，每個(gè)樣品為一組，每組1 12 孔加入PBS 50 μ L，然后在第一孔加入待檢樣品50 μ L，用移液槍逐孔稀釋至第11孔，棄 50μ L，第12孔為PBS空白對(duì)照。最后每孔加入山羊痘正向間接血凝診斷試劑50μ L，振蕩混合后，置室溫作用50min，判定結(jié)果。凡紅細(xì)胞沉積于孔底，集中呈1個(gè)圓點(diǎn)的為不凝集； 如紅細(xì)胞凝集，則分布于孔底周?chē)８鶕?jù)紅細(xì)胞凝集的程度判斷陽(yáng)性反應(yīng)的強(qiáng)弱，以出現(xiàn) 50%以上凝集現(xiàn)象(++)的血清最高稀釋度為檢測(cè)抗體的效價(jià)。所述試劑的檢測(cè)反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度20 25°C，反應(yīng)時(shí)間50min。
權(quán)利要求
1.一種山羊痘正向間接血凝診斷試劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟第一，無(wú)菌采集健康綿羊靜脈血，加10倍量PBS，2 000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，洗5遍， 以0. IM pH 7. 4 7. 8磷酸緩沖液配成2. 5%的紅細(xì)胞懸液；第二，將步驟一制得的紅細(xì)胞懸液與1%戊二醛以9:1體積比混合，于室溫下緩慢攪拌 Ih, 2000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，用磷酸緩沖液洗5遍，制得醛化紅細(xì)胞；第三，將步驟二制得的上述醛化紅細(xì)胞沉淀物溶于10倍量的磷酸緩沖液中，再與等量純化山羊痘病毒混合，置于室溫條件下攪拌2小時(shí)，2000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，制得致敏紅細(xì)胞；所使用的純化山羊痘病毒抗原含量控制在20 μ g/mL 200 μ g/mL之間；第四，將步驟三制得的致敏紅細(xì)胞沉淀物用含0. 1% NaN3、1%新生犢牛血清的磷酸緩沖液洗滌5次，并攪拌混合，配成0. 8% 1%致敏紅細(xì)胞； 第五，分析檢測(cè)合格即制得正向間接血凝診斷試劑。
2.—種山羊痘正向間接血凝診斷試劑檢測(cè)山羊痘抗體的方法，其特征在于如權(quán)利要求1所述的山羊痘正向間接血凝診斷試劑的制備方法制備的山羊痘正向間接血凝診斷試劑，檢測(cè)步驟按常規(guī)正向間接血凝試驗(yàn)方法進(jìn)行，其步驟為在96孔V形板中進(jìn)行，每個(gè)樣品為一組，每組1 12孔加入PBS 50 μ L，然后在第一孔加入待檢樣品50 μ L，用移液槍逐孔稀釋至第11孔，棄50μ L，第12孔為PBS空白對(duì)照；最后每孔加入山羊痘正向間接血凝診斷試劑50 μ L，振蕩混合后，置室溫作用50min，判定結(jié)果；凡紅細(xì)胞沉積于孔底，集中呈 1個(gè)圓點(diǎn)的為不凝集；如紅細(xì)胞凝集，則分布于孔底周?chē)桓鶕?jù)紅細(xì)胞凝集的程度判斷陽(yáng)性反應(yīng)的強(qiáng)弱，以出現(xiàn)50%以上凝集現(xiàn)象的血清最高稀釋度為檢測(cè)抗體的效價(jià)；所述試劑的檢測(cè)反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度20 25°C，反應(yīng)時(shí)間50min。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種能夠檢測(cè)山羊痘抗體的山羊痘正向間接血凝診斷試劑及其制備方法、檢測(cè)方法。制備方法為以戊二醛和綿羊紅細(xì)胞混合制備紅細(xì)胞懸液，與等量的純化山羊痘病毒混合，經(jīng)攪拌、離心、洗滌，用含1%新生犢牛血清的PBS配成1%致敏紅細(xì)胞，即制成為山羊痘正向間接血凝診斷試劑。經(jīng)優(yōu)化的制備條件是采用戊二醛單醛化法固定紅細(xì)胞，致敏紅細(xì)胞濃度0.8%～1.0%，抗原含量控制在20μg.mL-1～200μg.mL-1之間，可以達(dá)到較好的致敏效果；檢測(cè)方法按常規(guī)正向間接血凝試驗(yàn)方法進(jìn)行，反應(yīng)溫度20～25℃，反應(yīng)時(shí)間50min。該方法具有較好的特異性、敏感性和可重復(fù)性，可用于獸醫(yī)臨床上山羊痘抗體快速檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/531GK102253198SQ20111018892
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月7日
發(fā)明者劉忠偉, 周碧君, 岳筠, 嵇辛勤, 文明, 汪德生, 王開(kāi)功, 程振濤 申請(qǐng)人:貴州大學(xué)