專利名稱：一種用斑馬魚定量評(píng)價(jià)化合物肝毒性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化合物檢測(cè)和藥物毒性與安全性評(píng)價(jià)領(lǐng)域，具體涉及一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、 高通量實(shí)現(xiàn)利用斑馬魚幼魚(larva)定量評(píng)價(jià)化合物肝毒性的方法。
背景技術(shù)：
肝臟是體內(nèi)最大的實(shí)質(zhì)性器官，成人的肝重量約占體重的3%左右。肝臟具有特殊的解剖位置、組織結(jié)構(gòu)與生理生化特性。在機(jī)體內(nèi)肝臟不僅作為人體物質(zhì)與能量代謝的重要器官?；瘜W(xué)物質(zhì)無(wú)論從何種途徑進(jìn)入機(jī)體，最終均通過血液循環(huán)系統(tǒng)迅速到達(dá)肝臟，尤其從消化道吸收的毒性化合物，在進(jìn)入體循環(huán)以前首先與肝臟接觸。肝臟作為毒性化合物生物轉(zhuǎn)化的主要器官，在一定條件下，毒性化合物極易對(duì)肝臟造成損害作用，特別是經(jīng)體內(nèi)代謝增毒的外源化學(xué)物質(zhì)在肝臟代謝轉(zhuǎn)化后其有毒代謝產(chǎn)物可首先損害肝臟。因此肝臟是毒性化合物的重要靶器官[1]。人類環(huán)境中的許多化學(xué)物質(zhì)(包括藥物)，在一定劑量水平均可對(duì)肝臟造成損害作用。凡是能引起肝臟損害的化學(xué)物質(zhì)均可稱為肝毒性化合物?；瘜W(xué)毒物引起的肝損傷可以分為急性肝損傷和慢性肝損傷。急性肝損傷一般是短期接觸較大劑量肝毒物或者肝臟功能不全時(shí)接觸某種肝毒物引起病理改變常見肝細(xì)胞壞死、脂肪變性、膽汁淤積等。慢性肝損傷可因長(zhǎng)期低劑量肝毒物引起，也可由一次急性壞死引起的后遺癥，病理改變包括纖維化、 硬變、癌變等。肝毒性是制約化學(xué)品開發(fā)、生產(chǎn)和應(yīng)用的重要原因。一項(xiàng)調(diào)查顯示，84種化合物因?yàn)榕R床毒性而終止進(jìn)一步藥物開發(fā)，其中15種(18% )是因?yàn)楦味拘浴８味拘砸彩巧鲜兴幬镆虬踩珕栴}回收的主要原因。從1961年到1992年，法、德、英和美國(guó)共回收181種藥物， 其中23種是因?yàn)楦味拘?13% ) [2]。評(píng)價(jià)化合物肝毒性的方法有兩大類，一類是體外試驗(yàn)，另一類是體內(nèi)試驗(yàn)。肝毒性的體外試驗(yàn)檢測(cè)方法有以下幾種①離體肝臟灌流②肝組織切片③離體肝細(xì)胞④肝細(xì)胞系 ⑤亞細(xì)胞組分⑥遺傳工程細(xì)胞[3]。體內(nèi)試驗(yàn)評(píng)價(jià)采用整體動(dòng)物試驗(yàn)。最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為大鼠或者小鼠其次為倉(cāng)鼠、豚鼠、兔、狗等。體內(nèi)試驗(yàn)的檢測(cè)方法有以下幾類①血清酶學(xué)檢測(cè)②肝臟排泄功能檢測(cè)③肝臟化學(xué)組成成分改變的檢測(cè)④肝臟組織病理學(xué)檢查[1]。研究表明以上的一些方法雖然是經(jīng)典的化合物肝毒性評(píng)價(jià)方法，但有很多的弊端和局限性。體外實(shí)驗(yàn)所需費(fèi)用較低，但缺少了生物整體的循環(huán)轉(zhuǎn)換和藥物在體內(nèi)的循環(huán)分布，不能真正反映藥物的整體生物活性，體內(nèi)試驗(yàn)通?；衔镉昧看?、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，操作復(fù)雜，價(jià)格昂貴，特異性差，而且不可以進(jìn)行高通量篩選。因此建立一種能很好的模擬毒性化合物在體內(nèi)的過程，又能快速方便的篩選肝毒性化合物具有重要意義。斑馬魚是一種新穎的模式生物，越來越廣泛的應(yīng)用于化合物毒性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中。與傳統(tǒng)的體內(nèi)和體外篩選模型相較，活體斑馬魚篩選模型具有諸多優(yōu)勢(shì)，克服了原有體外模型在吸收、分布、代謝和排泄環(huán)節(jié)驗(yàn)證的欠缺及傳統(tǒng)體內(nèi)篩選模型實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、成本高的弊端。與線蟲、果蠅相比，斑馬魚是一種脊椎動(dòng)物，與人類基因高度相似，經(jīng)英國(guó)專家的基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，斑馬魚的基因與人類基因的相似度高達(dá)85%左右，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可比性強(qiáng)。與鼠類等哺乳動(dòng)物相比，斑馬魚胚胎透明，可同時(shí)觀察分析多個(gè)器官，實(shí)驗(yàn)周期短，樣本容量大，結(jié)果可信度高，所需費(fèi)用低W]。更重要的是，斑馬魚具有與生俱來的優(yōu)點(diǎn)W，5] 1)飼養(yǎng)成本低， 性成熟周期短；幻繁殖能力強(qiáng)，一尾雌魚每次可產(chǎn)200 300枚卵；幻生長(zhǎng)發(fā)育速度快，在受精24h后，斑馬魚主要的組織器官原基已形成，可為研究提供大量的樣本和較短的實(shí)驗(yàn)周期；4)胚胎及幼魚透明，體外受精，體外發(fā)育，可直接觀察，并可同時(shí)分析多個(gè)器官系統(tǒng)； 5)胚胎有可以提供營(yíng)養(yǎng)的卵黃，第一周內(nèi)不需喂食，可避免化合物處理時(shí)化合物與食物成份的相互作用；6)胚胎很小，幼魚體長(zhǎng)只有l(wèi)_4mm，能夠在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的6、12、24、48或96孔板內(nèi)進(jìn)行分析；7)給藥方式簡(jiǎn)單溶于水的小分子物質(zhì)可直接經(jīng)皮膚、鰓及消化系統(tǒng)進(jìn)入斑馬魚體內(nèi)；不溶于水的物質(zhì)、大分子物質(zhì)及蛋白質(zhì)可進(jìn)行顯微注射。因此斑馬魚可作為很好的化合物肝毒性的研究材料。目前利用斑馬魚研究化合物肝毒性的報(bào)道較少，并且大多集中在對(duì)與肝臟形成相關(guān)的因子進(jìn)行遺傳學(xué)分析方面W-ll]。McGra I^atricia和Li Chimqi在一篇綜述性文章提到可以用斑馬魚評(píng)價(jià)藥物的肝毒性，肝毒性藥物處理后的斑馬魚肝臟形狀不規(guī)則、邊緣模糊、肝組織顏色加深變?yōu)樯钭厣蛘吆谏?，但是該文章只是提到用斑馬魚定性評(píng)價(jià)化合物肝毒性的可能性W]。Mdler等利用突變體斑馬魚建立評(píng)價(jià)肝腫大、脂肪肝、膽汁淤積等肝臟疾病的模型[12]。Amali等利用硫代乙酰胺處理斑馬魚建立篩選抗脂肪肝藥物的斑馬魚模型[13]。Passeri等利用斑馬魚研究乙醇誘發(fā)的脂肪變性的分子機(jī)制[14]。專利 20101070675. 2公開了一種用模式生物斑馬魚篩選肝損傷藥物的方法，但是該方法利用成年斑馬魚進(jìn)行篩選，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、所需費(fèi)用較高、不能進(jìn)行高通量篩選。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述現(xiàn)有的評(píng)價(jià)肝毒性化合物方法所存在的缺陷和不足，發(fā)明人經(jīng)過研究，旨在提供了一種方便快捷、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的利用斑馬魚定量篩選肝毒性化合物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分析方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種用斑馬魚定量評(píng)價(jià)化合物肝毒性的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)斑馬魚選取選取受精后2-7天的正常發(fā)育的斑馬魚，放入微孔板中，(2)化合物處理移除微孔板中的培養(yǎng)液，設(shè)置多個(gè)實(shí)驗(yàn)組待測(cè)化合物處理組、陽(yáng)性對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、空白對(duì)照組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組根據(jù)微孔板的規(guī)格分別加入相應(yīng)的溶液，然后恒溫培養(yǎng)；(3)定性分析和/或定量分析。優(yōu)選的，所述的步驟(1)斑馬魚選取受精2天后的斑馬魚；優(yōu)選的，所述的步驟( 化合物處理中斑馬魚在下恒溫培養(yǎng)；優(yōu)選的，所述的步驟( 化合物處理中斑馬魚培養(yǎng)72小時(shí)；優(yōu)選的，所述的微孔板選用6-384孔微孔板；優(yōu)選的，所述的步驟O)中陽(yáng)性對(duì)照組中使用的溶液為四氯化碳；優(yōu)選的，所述的步驟O)中溶劑對(duì)照組中使用的溶液為0. 1 %的DMSO ；
優(yōu)選的，所述的步驟O)中空白對(duì)照組中使用的溶液為養(yǎng)殖用水；優(yōu)選的，所述的步驟(3)中定性分析步驟如下A)移除微孔板中養(yǎng)殖用水，加入等體積1 XMESAB (甲磺酸)麻醉斑馬魚，用3%甲基纖維素膠固定后，再置于解剖顯微鏡下觀察斑馬魚肝臟；B)溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組中可以觀察到透明的斑馬魚肝臟；陽(yáng)性對(duì)照組可以觀察到深棕色或者黑色不透明的斑馬魚肝臟；觀察化合物處理組斑馬魚肝臟，如化合物處理組斑馬魚肝臟表現(xiàn)出深棕色或者黑色不透明，則可判斷該化合物具有肝毒性；優(yōu)選的，所述的步驟(3)中定量分析步驟如下利用圖像處理軟件進(jìn)行圖像定量分析；選定整個(gè)肝臟區(qū)域，計(jì)算肝臟明亮度總和， 每個(gè)濃度組取10只斑馬魚的圖片進(jìn)行分析；肝臟損傷率計(jì)算公式為
權(quán)利要求
1.一種用斑馬魚定量評(píng)價(jià)化合物肝毒性的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)斑馬魚選取選取受精后2-7天的正常發(fā)育的斑馬魚，放入微孔板中；(2)化合物處理移除微孔板中的培養(yǎng)液，設(shè)置多個(gè)實(shí)驗(yàn)組待測(cè)化合物處理組、陽(yáng)性對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、空白對(duì)照組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組根據(jù)微孔板的規(guī)格分別加入相應(yīng)的溶液，然后恒溫培養(yǎng)；(3)定性分析和/或定量分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的評(píng)價(jià)化合物肝毒性的方法，其特征在于馬魚選取受精后2天的斑馬魚。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的評(píng)價(jià)化合物肝毒性的方法，其特征在于合物處理中斑馬魚于下恒溫培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的評(píng)價(jià)化合物肝毒性的方法，其特征在于合物處理中斑馬魚培養(yǎng)72小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的評(píng)價(jià)化合物肝毒性的方法，其特征在于 6-384孔微孔板。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的評(píng)價(jià)化合物肝毒性的方法，其特征在于陽(yáng)性對(duì)照組中使用的溶液為四氯化碳。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的評(píng)價(jià)化合物肝毒性的方法，其特征在于溶劑對(duì)照組中使用的溶液為0. 的DMS0。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的評(píng)價(jià)化合物肝毒性的方法，其特征在于空白對(duì)照組中使用的溶液為斑馬魚養(yǎng)殖用水。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的評(píng)價(jià)化合物肝毒性的方法，其特征在于定性分析步驟如下A)移除微孔板中養(yǎng)殖用水，加入等體積1XMESAB(甲磺酸)麻醉斑馬魚，用3%甲基纖維素膠固定后，再置于解剖顯微鏡下觀察斑馬魚肝臟；B)溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組中可以觀察到透明的斑馬魚肝臟；陽(yáng)性對(duì)照組可以觀察到深棕色或者黑色不透明的斑馬魚肝臟；觀察化合物處理組斑馬魚肝臟，如化合物處理組斑馬魚肝臟表現(xiàn)出深棕色或者黑色不透明，則可判斷該化合物具有肝毒性。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的評(píng)價(jià)化合物肝毒性的方法，其特征在于所述的步驟(3)中定量分析步驟如下利用圖像處理軟件進(jìn)行圖像定量分析；選定整個(gè)肝臟區(qū)域，計(jì)算肝臟明亮度總和，每個(gè)濃度組取10只斑馬魚的圖片進(jìn)行分析；肝臟損傷率計(jì)算公式為肝臟損傷率=(卜化合物^，月亮度^、和)xl00%。溶劑組明殼度總和所述的步驟(1)斑 所述的步驟(2)化 所述的步驟(2)化 所述的微孔板選用 所述的步驟O)中 所述的步驟O)中 所述的步驟O)中 所述的步驟(3)中
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用斑馬魚定量評(píng)價(jià)化合物肝毒性的方法，主要包括斑馬魚選取，化合物處理，定性分析和/或定量分析幾個(gè)步驟。本發(fā)明的方法具有可靠、快速、高效、高性價(jià)比等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)體內(nèi)高通量評(píng)價(jià)化合物的肝毒性。本發(fā)明能明顯提高化合物肝毒性評(píng)價(jià)的速度，對(duì)加快大規(guī)模的化合物肝毒性評(píng)價(jià)具有重要意義。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102353663SQ20111019007
公開日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月6日
發(fā)明者李春?jiǎn)? 陳汝家 申請(qǐng)人:杭州環(huán)特生物科技有限公司