專利名稱：快速檢測(cè)玉米赤霉烯酮毒素的免疫化學(xué)發(fā)光方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物檢測(cè)工程技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種快速檢測(cè)玉米赤霉烯酮毒素的免疫化學(xué)發(fā)光方法。
背景技術(shù)：
玉米赤霉烯酮毒素(ZearalenoneJEN)是鐮刀菌在一定濕度和溫度條件下繁殖所產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物。玉米赤霉烯酮毒素可存在于玉米、小麥、大麥、高粱、黑麥等谷物，也可存在于食用含^N飼料的動(dòng)物組織中，包括牛奶、雞蛋等。玉米赤霉烯酮毒素與自發(fā)性乳腺癌，輸卵管和子宮水腫、增生，精細(xì)胞畸變、凋亡等疾病有關(guān)。玉米赤霉烯酮毒素具有分布廣泛、殘留時(shí)間長(zhǎng)、難處理、和其他毒素一起有增強(qiáng)毒性的現(xiàn)象。加入WTO之后，農(nóng)產(chǎn)品及相關(guān)食品的國(guó)際貿(mào)易量日益增加，隨之對(duì)進(jìn)出口產(chǎn)品的生物安全性的要求也越來越高，為了保證這類產(chǎn)品的順利上市和食用者的健康，出入境檢疫、海關(guān)、生產(chǎn)企業(yè)、監(jiān)督部門等部門迫切需要一種快速簡(jiǎn)便的玉米赤霉烯酮毒素檢測(cè)方法?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay, CLIA)，是將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、 酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測(cè)分析技術(shù)。是繼放免分析、酶免分析、熒光免疫分析和時(shí)間分辨熒光免疫分析之后發(fā)展起來的一項(xiàng)最新免疫測(cè)定技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光(Chemiluminescence, CL)早在19世紀(jì)80年代就得到證實(shí)，即在化學(xué)反應(yīng)過程中瞬間以釋放光子的形式放出能量。后發(fā)展出放射免疫分析技術(shù)(RIA)，因其高靈敏度和高特異性而受到普遍應(yīng)用。CLIA是在RIA基本理論的基礎(chǔ)上，以標(biāo)記發(fā)光劑為示蹤物信號(hào)建立起來的一種非放射標(biāo)記免疫分析法。近年來發(fā)展迅猛，是目前發(fā)展和推廣應(yīng)用最快的免疫分析方法，也是目前最先進(jìn)的標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)，靈敏度和精確度比酶免法、熒光法高幾個(gè)數(shù)量級(jí)，顯著優(yōu)于放射免疫分析和酶聯(lián)免疫分析。it^RjtM^M^fi (Chemi luminescent Enzyme Immunoassay, CLE ΙΑ) MBI^i 疫分析，只是酶反應(yīng)的底物是發(fā)光劑，操作步驟與酶免疫分析完全相同以酶標(biāo)記生物活性物質(zhì)(如酶標(biāo)記的抗原或抗體)進(jìn)行免疫反應(yīng)，免疫反應(yīng)復(fù)合物上的酶再作用于發(fā)光底物， 在信號(hào)試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號(hào)測(cè)定儀進(jìn)行發(fā)光測(cè)定。在酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析中可供標(biāo)記的酶有很多，目前常用的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)。在測(cè)定時(shí)，將包被抗原^N-OVA包被在96孔白板上，封閉后加入抗^N單克隆抗體和待測(cè)樣品，抗體會(huì)和包被在板上的ZEN特異性的結(jié)合，而待測(cè)樣品中如果含有^N，那么會(huì)和包被在板上的ZEN競(jìng)爭(zhēng)抗體，即待測(cè)樣品中ZEN的含量越高，抗體與板上的ZEN結(jié)合的越少，反之，則越多。孵育后再加入羊抗鼠HRP標(biāo)記或ALP標(biāo)記的二抗，二抗會(huì)和之前加入的抗體(一抗)結(jié)合，在加入發(fā)光底物后，免疫反應(yīng)復(fù)合物上的酶再作用于發(fā)光底物，在信號(hào)試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號(hào)測(cè)定儀進(jìn)行發(fā)光測(cè)定。此時(shí)待測(cè)樣品中^NW含量越高，測(cè)定得到的發(fā)光值越低；反之，則越高(如圖1所示)。關(guān)于玉米赤霉烯酮毒素檢測(cè)，國(guó)內(nèi)外已建立了多種方法。目前檢測(cè)^N的方法主要為高效液相色譜法(HPLC)，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)，液譜和質(zhì)譜聯(lián)用法 (LC-MS)。然而，這些方法需要對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行嚴(yán)格的預(yù)處理，還需要高效液相色譜儀等貴重儀器，同時(shí)要求有專業(yè)的操作人員，不利于現(xiàn)場(chǎng)常規(guī)檢測(cè)使用。已有的檢測(cè)玉米赤霉烯酮毒素的ELISA試劑盒，在檢測(cè)靈敏度上不及本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光ELISA方法，因此免疫化學(xué)發(fā)光將具有更高的檢測(cè)靈敏度，對(duì)保障谷物類食品的安全具有更重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種快速檢測(cè)玉米赤霉烯酮毒素的免疫化學(xué)發(fā)光方法。本發(fā)明的方法可以快速檢測(cè)出待測(cè)樣品中含有的ZEN的量；同時(shí)，本發(fā)明的方法檢測(cè)對(duì)象針對(duì)性強(qiáng)，準(zhǔn)確率高，靈敏度較市售ELISA檢測(cè)試劑盒高；本發(fā)明的方法采用抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體，與其他谷物中的真菌毒素?zé)o交叉反應(yīng)，較市售的以多克隆抗體為基礎(chǔ)的ELISA試劑盒有更強(qiáng)的特異性，減少了假陽(yáng)性率。本發(fā)明涉及的快速檢測(cè)玉米赤霉烯酮毒素的免疫化學(xué)發(fā)光方法，包括如下步驟 步驟一，將ZEN半抗原與OVA偶聯(lián)，得到偶聯(lián)物^N-OVA ；
步驟二，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行萃取，得到萃取液；
步驟三，將^N-OVA以最佳包被濃度包被在96孔白板上，封閉后分別加入已知的不同濃度的ZEN純品與抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體的混合溶液，待測(cè)樣品萃取液與抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體的混合溶液，孵育；
步驟四，孵育后加入HRP標(biāo)記的二抗，之后再加入發(fā)光底物，進(jìn)行發(fā)光測(cè)定，得到結(jié)果； 步驟五，根據(jù)已知的不同濃度ZEN純品與抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體的混合溶液的發(fā)光值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；
步驟六，根據(jù)待測(cè)樣品萃取液與抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體的混合溶液的發(fā)光值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)樣品萃取液中的^N濃度。優(yōu)選地，步驟一中，所述偶聯(lián)的方法為活潑酯法。優(yōu)選地，步驟二中，所述萃取為取0.3g待測(cè)樣品，加入3ml體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇-PBS溶液，劇烈震蕩15min，靜置30min，上清液通過快速定性濾紙過濾，稀釋5倍后，得萃取液。優(yōu)選地，步驟三中，所述孵育為37°C孵育4小時(shí)。本發(fā)明具有如下的有益效果
當(dāng)測(cè)樣品中含有ZEN毒素時(shí)，由于ZEN和抗ZEN單克隆抗體特異性結(jié)合，單克隆抗體繼而又和HRP酶或ALP酶標(biāo)記的二抗結(jié)合，酶再作用于發(fā)光底物，在信號(hào)試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號(hào)測(cè)定儀進(jìn)行發(fā)光測(cè)定；由于待測(cè)樣品中含有的ZEN的量與發(fā)光檢測(cè)結(jié)果有線性關(guān)系，因此可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線算出待測(cè)樣品中含有的ZEN的量；
本發(fā)明的方法檢測(cè)對(duì)象針對(duì)性強(qiáng)，準(zhǔn)確率高，靈敏度較市售ELISA檢測(cè)試劑盒高； 本發(fā)明的方法采用抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體，與其他谷物中的真菌毒素?zé)o交叉反應(yīng)，較市售的以多克隆抗體為基礎(chǔ)的ELISA試劑盒有更強(qiáng)的特異性，減少了假陽(yáng)性率。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例原理；其中，a為不加入含有 N樣品的示意圖，b為加入含有ZEN樣品的示意圖2為本發(fā)明實(shí)施例96孔白板檢測(cè)示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件， 例如 Sambrook 等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York: Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。術(shù)語(yǔ)“ZEN”是玉米赤霉烯酮毒素的簡(jiǎn)稱，“OVA”是0_羧甲基羥的簡(jiǎn)稱。
實(shí)施例1、抗原的制備，玉米赤霉烯酮包被抗原(ZEN - 0VA)的制備
取0. 33ml (3mg/ml) ZEN,混合于1. 2ml吡啶中，加入^ig 0-羧甲基羥胺，室溫?cái)嚢璺磻?yīng) 24h0真空干燥后，加入蒸餾水，并使其溶解，調(diào)整pH至8. O。未反應(yīng)的ZEN用苯抽提除去(3ml苯，共抽提3次)，除去苯相，保留水相。水相調(diào)pH至3.0，用乙酸乙酯抽提(IOml乙酸乙酯，共抽提4次)，抽出酯相，棄水相。酯相用無水硫酸鈉濾過后吹干。吹干后的結(jié)晶物溶于0. 5ml堿性氧化鋁處理過的二氧六環(huán)中。稱取IOmgOVA溶于0. 7ml 0. 05mol/L(pH7. 2) 的PBS溶液中，將兩溶液于4°C緩慢混合。ImgNHS和^iigDCC溶于0. 2ml 二氧六環(huán)中，并緩慢滴加此溶液。將混合后的溶液放置室溫?cái)嚢璺磻?yīng)16h。調(diào)pH至6.0，通風(fēng)櫥中吹干，緩慢滴加DCC溶液(2mgDCC溶于0. 2ml 二氧六環(huán)中得到)。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)48h。最后用PBS溶液透析2 3d，-20°C保存。2、對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行萃取，得到萃取液
將玉米研磨，取0. 3g作為待測(cè)樣品，加入3ml體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇-PBS溶液，劇烈震蕩15min，靜置30min。上清液通過快速定性濾紙過濾，稀釋5倍后，取50 μ 1進(jìn)行檢測(cè)。3、化學(xué)發(fā)光ELISA檢測(cè)待測(cè)樣品萃取液
3. 1將^N-OVA以最佳包被濃度包被在96孔白板上，封閉后分別加入已知的不同濃度的ZEN純品與抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體的混合溶液，待測(cè)樣品萃取液與抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體的混合溶液，孵育；
(1)將^N-OVA以最佳包被濃度包被在96孔白板上，37°C孵育4小時(shí)；圖1為本發(fā)明實(shí)施例原理；其中，a為不加入含有 N樣品的示意圖，b為加入含有^N樣品的示意圖；圖 2為本發(fā)明實(shí)施例96孔白板檢測(cè)示意圖。檢測(cè)試劑盒中含有100、50、10、5、1、0. 1、0 ng/ml 的^N標(biāo)準(zhǔn)溶液，顯色后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的發(fā)光值(每個(gè)樣品3次重復(fù)，得到平均值)確定標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測(cè)樣品的發(fā)光值(每個(gè)樣品3次重復(fù)，得到平均值)從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算得到對(duì)應(yīng)濃度；為了測(cè)試試劑盒的可靠性，設(shè)計(jì)加入空白對(duì)照，如果在檢測(cè)中空白對(duì)照的發(fā)光值達(dá)到或超過0 ng/mlZEN溶液所對(duì)應(yīng)的發(fā)光值的一半，則判定試劑盒失效。(2)用0. 01 M PBST洗滌3次，每次加入PBST，震蕩3分鐘并倒出孔內(nèi)液體，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉，37°C孵育2小時(shí)；
(3)用0.01M PBST洗滌3次，每次加入PBST震蕩3分鐘并倒出孔內(nèi)液體；
(4)在標(biāo)準(zhǔn)曲線孔中依次加入100、50、10、5、1、0.1、0 ng/ml的ZEN純品50 μ 1，并做3次重復(fù)；在待測(cè)孔中加入步驟2中制備的待測(cè)樣品萃取液50 μ 1，并做3次重復(fù)。以上各孔中分別加入50 μ 1的1/40000稀釋的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體；空白孔中加入100 μ 1 0. OlM PBS，將96孔板放置37°C孵育1小時(shí);
3. 2孵育后加入HRP標(biāo)記的二抗，之后再加入發(fā)光底物，進(jìn)行發(fā)光測(cè)定，得到結(jié)果；
(1)用0.OlM PBST洗滌3次，每次加入PBST震蕩3分鐘并倒出孔內(nèi)液體，加入HRP標(biāo)記的二抗，37°C孵育1小時(shí)；
(2)用0.01M PBST洗滌3次，每次加入PBST震蕩3分鐘并倒出孔內(nèi)液體，加入100 μ 1 發(fā)光底物；所述發(fā)光底物為PH為8. 6的0. lmol/L Tris-HCl，具體配制方法為將0. Imol Tris溶于IL水中，使用HCl調(diào)整pH至8. 6，之后加入魯米諾，對(duì)碘酚，過氧化氫，使其終濃度分別為lmmol/L魯米諾，2. 5mmol/L對(duì)碘酚，lmmol/L過氧化氫)，用發(fā)光信號(hào)測(cè)定儀進(jìn)行發(fā)光測(cè)定，得到結(jié)果。4、檢測(cè)ZEN的標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作與結(jié)果判定
(1)根據(jù)已知不同濃度ZEN與抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體加入后得到的發(fā)光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體做法為以加入ZEN濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以加入不同濃度ZEN所得到的不同發(fā)光值的平均數(shù)除以不加入ZEN (空白)所得到的發(fā)光值的結(jié)果為縱坐標(biāo)，通過 Microsoft Excel軟件，繪制散點(diǎn)圖并添加趨勢(shì)線公式和R2 ；
(2)根據(jù)待測(cè)樣品的發(fā)光值的平均值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線所得到的趨勢(shì)線公式計(jì)算，得到對(duì)應(yīng)的ZEN濃度。5、加標(biāo)樣本的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)針對(duì)已知陰性樣本(不含^N的玉米)，研磨后， 添加觀N，制備加標(biāo)樣本，使樣本中的ZEN濃度為lyg/kgUOyg/kg^Oyg/kg。取0. 3g加標(biāo)樣本加入3ml 70% (ν/ν)甲醇，劇烈震蕩15分鐘，靜置1小時(shí)，2500g離心15分鐘，取上清液。上清液通過快速定性濾紙過濾，稀釋5倍后，取50μ 1進(jìn)行檢測(cè)。將萃取液加入待測(cè)樣品孔中，再加入50 μ 1的1/40000稀釋的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體，同一樣品做3次重復(fù)。最后，通過加標(biāo)樣本的發(fā)光值和標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算加標(biāo)樣本的玉米赤霉烯酮含量，其回收率在80% 120%。綜上所述，本發(fā)明的方法能夠快速檢測(cè)出待測(cè)樣品中含有的^N的量；同時(shí)，本發(fā)明的方法檢測(cè)對(duì)象針對(duì)性強(qiáng)，準(zhǔn)確率高，靈敏度較市售ELISA檢測(cè)試劑盒高；本發(fā)明的方法采用抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體，與其他谷物中的真菌毒素?zé)o交叉反應(yīng)，較市售的以多克隆抗體為基礎(chǔ)的ELISA試劑盒有更強(qiáng)的特異性，減少了假陽(yáng)性率。
權(quán)利要求
1.一種快速檢測(cè)玉米赤霉烯酮毒素的免疫化學(xué)發(fā)光方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，將ZEN半抗原與OVA偶聯(lián)，得到偶聯(lián)物^N-OVA ； 步驟二，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行萃取，得到萃取液；步驟三，將^N-OVA以最佳包被濃度包被在96孔白板上，封閉后分別加入已知的不同濃度的ZEN純品與抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體的混合溶液，待測(cè)樣品萃取液與抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體的混合溶液，孵育；步驟四，孵育后加入HRP標(biāo)記的二抗，之后再加入發(fā)光底物，進(jìn)行發(fā)光測(cè)定，得到結(jié)果； 步驟五，根據(jù)已知的不同濃度ZEN純品與抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體的混合溶液的發(fā)光值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；步驟六，根據(jù)待測(cè)樣品萃取液與抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體的混合溶液的發(fā)光值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)樣品萃取液中的^N濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)玉米赤霉烯酮毒素的免疫化學(xué)發(fā)光方法，其特征是，步驟一中，所述偶聯(lián)的方法為活潑酯法。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)玉米赤霉烯酮毒素的免疫化學(xué)發(fā)光方法，其特征是，步驟二中，所述萃取為取0.3g待測(cè)樣品，加入3ml體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇-PBS溶液， 劇烈震蕩15min，靜置30min，上清液通過快速定性濾紙過濾，稀釋5倍后，得萃取液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)玉米赤霉烯酮毒素的免疫化學(xué)發(fā)光方法，其特征是，步驟三中，所述孵育為37°C孵育4小時(shí)。
全文摘要
一種生物檢測(cè)工程技術(shù)領(lǐng)域的檢測(cè)玉米赤霉烯酮毒素的免疫化學(xué)發(fā)光方法，包括如下步驟將ZEN半抗原與OVA偶聯(lián)，得到偶聯(lián)物ZEN-OVA；對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行萃取，得到萃取液；將ZEN-OVA以最佳包被濃度包被在96孔白板上，封閉后分別加入已知的不同濃度的ZEN純品與抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體的混合溶液，待測(cè)樣品萃取液與抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體的混合溶液，孵育；孵育后加入HRP標(biāo)記的二抗，之后再加入發(fā)光底物，進(jìn)行發(fā)光測(cè)定，得到結(jié)果；制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)樣品萃取液中的ZEN濃度。本發(fā)明的方法可以快速檢測(cè)出待測(cè)樣品中含有的ZEN的量；同時(shí)，本發(fā)明的方法檢測(cè)對(duì)象針對(duì)性強(qiáng)，準(zhǔn)確率高。
文檔編號(hào)G01N21/76GK102313810SQ20111021536
公開日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2011年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月29日
發(fā)明者嚴(yán)亞賢, 孫建和, 王元?jiǎng)P 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)