專利名稱：檢測肺癌蛋白的質(zhì)譜模型及構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及惡性腫瘤檢測領(lǐng)域，為一種全新的非入侵性檢測方法，在體外對肺癌進(jìn)行早期的發(fā)現(xiàn)和檢測。
背景技術(shù)：
肺癌在近年來已逐步代替肝癌成為我國惡性腫瘤的首位死亡原因，占全部惡性腫瘤死亡人數(shù)的22. 7%，并且肺癌的發(fā)病率和死亡率仍在繼續(xù)上升。根據(jù)衛(wèi)生部全國腫瘤防治辦公室提供的資料顯示，自2000 2005年間，中國肺癌的發(fā)患者數(shù)估計(jì)增加12萬人。其中，男性肺癌患者從2000年的沈萬人增加到2005年的33萬人，同期女性肺癌患者從12 萬人增加到17萬人。目前我國肺癌發(fā)病率每年增長沈.9%，如不及時(shí)采取有效控制措施， 預(yù)計(jì)到2025年，我國肺癌患者將達(dá)到100萬，成為“世界第一”肺癌大國。肺癌的早期診斷有利于幫助患者早期進(jìn)行治療，早期開展治療的肺癌預(yù)后效果好，不容易復(fù)發(fā)。肺癌的癥狀主要有咳嗽、咯血、胸痛、呼吸困難以及腫瘤引起的阻塞、壓迫和腫瘤轉(zhuǎn)移表現(xiàn)的各種癥狀，其癥狀有輕有重，早期不易引起人們注意。臨床醫(yī)師對中年以上久咳不愈或出現(xiàn)血痰以及肺部X線檢查發(fā)現(xiàn)性質(zhì)未明的塊影或炎變的病例提高警惕，高度懷疑肺癌的可能性，及時(shí)進(jìn)行周密檢查。我們應(yīng)用基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)提供一種可用于早期診斷的方法?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-T0F-MS)是近年來發(fā)展起來的一種新型的軟電離生物質(zhì)譜，其原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過程。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測器的飛行時(shí)間不同而被檢測即測定離子的質(zhì)荷比(M/Z)與離子的飛行時(shí)間成正比， 檢測離子。盡管MALDI-T0F的準(zhǔn)確度高達(dá)0. 1 % 0. 01 %，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前常規(guī)應(yīng)用的SDS電泳與高效凝膠色譜技術(shù)，但在腫瘤標(biāo)志物尤其是肺癌標(biāo)志物的應(yīng)用中仍然存在一些缺陷， 因此國內(nèi)迄今為止尚無采用MALDI-T0F-MS技術(shù)獲得檢測肺癌標(biāo)志物或肺癌血清特征蛋白的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是為了克服已有對肺癌標(biāo)志物或肺癌血清特征蛋白檢測技術(shù)的不足之處，提出一種用于檢測肺癌血清特征蛋白的質(zhì)譜模型及其制備方法。本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種用于檢測肺癌特征蛋白的質(zhì)譜標(biāo)記，該質(zhì)譜標(biāo)記是質(zhì)荷比為 4054m/z、2273m/z、409 lm/z、3955m/z、3192m/z、3884m/z、5337m/z 的峰。本發(fā)明的第二個(gè)發(fā)明目是提供一種用于檢測肺癌特征蛋白的質(zhì)譜模型，該質(zhì)譜模型包括質(zhì)荷比為 4054m/z、2273m/z、4091m/z、3955m/z、3192m/z、3884m/z 和 5337m/z 的峰，模型中表征為 4054m/z、2273m/z、4091m/z、3955m/z、3192m/z、3884m/z 和 5337m/z 的蛋白是肺癌血清特征蛋白，其中4054m/z、2273m/z、409lm/z、3955m/z、3192m/z特征蛋白的表達(dá)都下調(diào)，3884m/z、5337m/z的表達(dá)都上調(diào)時(shí)，預(yù)示為肺癌患者或潛在患者。所述的4054m/z、2273m/z、4091m/z、3955m/z和3192m/z特征蛋白的下調(diào)表達(dá)的臨界值分別為 141. 88士57. 55,37. 13士8. 15,189. 43士61. 91,130. 06士 110. 44 和 78. 65士23. 6。所述的 3884m/z、5337m/z特征蛋白的上調(diào)表達(dá)的臨界值分別為20. 79士5. 78和214.79。其中，所述的表征為質(zhì)荷比為4054m/z、2273m/z、4091m/z、3955m/z、3192m/z、 3884m/z 和 5337m/z 的多肽的氨基酸序列分別如 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、 SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6 和 SEQ ID No. 7 所示。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的質(zhì)譜模型的構(gòu)建方法，包括1)收集多例臨床確診的肺癌患者血清和正常對照人員的血清作為兩組血清標(biāo)本， 進(jìn)行低溫冷凍備用；2)對血清蛋白進(jìn)行質(zhì)譜前預(yù)處理；3)對預(yù)處理過的兩組血清蛋白進(jìn)行質(zhì)譜檢測讀取，獲得兩組血清多肽的指紋圖譜；4)對所有的肺癌患者和正常人血清多肽的指紋圖譜進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，并收集數(shù)據(jù)；5)對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，篩選出具有下列質(zhì)荷比峰的七個(gè)肺癌特征蛋白 4054m/z、2273m/z、4091m/z、3955m/z、3192m/z、3884m/z 和 5337m/z，對差異多 Jft 4054m/z、 2273m/z、4091m/z、3955m/z、3192m/z、3884m/z 和 5337m/z 進(jìn)行多Jft序列測定，根據(jù)這七個(gè)質(zhì)荷比峰建立檢測肺癌特征蛋白的質(zhì)譜模型。其中，所述步驟2、的預(yù)處理包括使用磁珠純化和穩(wěn)定樣品中的血清蛋白或多肽。其中，所述步驟3)采用WCX2芯片對兩組血清蛋白進(jìn)行吸附，并對結(jié)合在弱陽離子 WCX2芯片上的兩組血清蛋白進(jìn)行讀取，獲得兩組血清多肽的指紋圖譜。本發(fā)明結(jié)合生物信息學(xué)方法篩選出相應(yīng)的肺癌標(biāo)志物并建立檢測模型進(jìn)行分析檢測，所述的生物信息學(xué)方法包括對指紋圖譜進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理、對所得數(shù)據(jù)進(jìn)實(shí)驗(yàn)質(zhì)控處理、篩選期望的血清特征蛋白并建立質(zhì)譜模型，以及可選擇地包括使用遺傳算法結(jié)合最近鄰算法建立并驗(yàn)證質(zhì)譜模型等。其中，所述的實(shí)驗(yàn)質(zhì)控處理，保留出峰數(shù)量大于50的質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)，并采用Sigma血清的組內(nèi)變異系數(shù)來保證實(shí)驗(yàn)的一致性，從而根據(jù)變異系數(shù)滿足一致性的允許范圍來進(jìn)行篩選。本發(fā)明中，變異系數(shù)優(yōu)選為16.2%。本發(fā)明檢測肺癌特征蛋白的質(zhì)譜標(biāo)記，可用于建立血清特征蛋白質(zhì)譜模型以及應(yīng)用于在肺癌早期檢測和篩查，本發(fā)明的質(zhì)譜模型，可用于肺癌的早期檢測和篩查。本發(fā)明與其它肺癌的檢測方法比較，具有以下優(yōu)點(diǎn)第一，本發(fā)明采用肺癌患者與正常人具有差異的多個(gè)特征蛋白組合進(jìn)行對肺癌血清的檢測，并采用了傳統(tǒng)統(tǒng)計(jì)學(xué)與現(xiàn)代生物信息學(xué)方法相結(jié)合的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，從而得到肺癌患者和健康人血清蛋白質(zhì)指紋圖譜檢測模型，并且所發(fā)現(xiàn)的一系列蛋白質(zhì)質(zhì)荷比峰為尋找新的更理想的腫瘤標(biāo)志物提供了基礎(chǔ)和資源。第二，與以往的血清學(xué)檢測方法比較具有較高的敏感性和特異性，并能用于篩選抗肺癌的藥物中。第三，本發(fā)明模型的構(gòu)建方法設(shè)計(jì)合理可行，為提供肺癌的臨床治愈率提供了新的篩查方法，同時(shí)也為探索腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制提供了新的思路。
第四，利用本發(fā)明分析了 148份血清樣品，訓(xùn)練組94例，驗(yàn)證組M例，驗(yàn)證結(jié)果顯示，51例判斷正確，檢出率達(dá)94. 44%,特異性為90%，靈敏性為95. 5%，因此本發(fā)明可對肺癌做出早期的診斷，提早對病人治療，延長生命。


圖1為部分健康人血清和肺患者血清的多肽圖譜，其中A-C為肺癌患者血清，D-F 為健康人血清。圖2重復(fù)做樣的5個(gè)Sigma血清質(zhì)譜指紋圖。圖3-A為蛋白峰在所有建模型樣品中的表達(dá)水平展示，箭頭指向?yàn)橛糜诮Ｐ偷暮少|(zhì)比為4054m/z的肺癌特征蛋白峰；圖3-B表示根據(jù)蛋白峰進(jìn)行蛋白的模擬凝膠電泳圖， 其中箭頭指向建模型的4054m/z的特征蛋白帶。圖4-A為蛋白峰在所有建模型樣品中的表達(dá)水平展示，箭頭指向?yàn)橛糜诮Ｐ偷暮少|(zhì)比為2273m/z的肺癌特征蛋白峰；圖4-B表示根據(jù)蛋白峰進(jìn)行蛋白的模擬凝膠電泳圖， 其中箭頭指向建模型的2273m/z的特征蛋白帶。圖5-A為蛋白峰在所有建模型樣品中的表達(dá)水平展示，箭頭指向?yàn)橛糜诮Ｐ偷暮少|(zhì)比為4091m/z的肺癌特征蛋白峰；圖5-B表示根據(jù)蛋白峰進(jìn)行蛋白的模擬凝膠電泳圖， 其中箭頭指向建模型的4091m/z的特征蛋白帶。圖6-A為蛋白峰在所有建模型樣品中的表達(dá)水平展示，箭頭指向?yàn)橛糜诮Ｐ偷暮少|(zhì)比為3955m/z的肺癌特征蛋白峰；圖6-B表示根據(jù)蛋白峰進(jìn)行蛋白的模擬凝膠電泳圖， 其中箭頭指向建模型的3955m/z的特征蛋白帶。圖7-A為蛋白峰在所有建模型樣品中的表達(dá)水平展示，箭頭指向?yàn)橛糜诮Ｐ偷暮少|(zhì)比為3192m/z的肺癌特征蛋白峰；圖7-B表示根據(jù)蛋白峰進(jìn)行蛋白的模擬凝膠電泳圖， 其中箭頭指向建模型的3192m/z的特征蛋白帶。圖8-A為蛋白峰在所有建模型樣品中的表達(dá)水平展示，箭頭指向?yàn)橛糜诮Ｐ偷暮少|(zhì)比為3884m/z的肺癌特征蛋白峰；圖8-B表示根據(jù)蛋白峰進(jìn)行蛋白的模擬凝膠電泳圖， 其中箭頭指向建模型的3884m/z的特征蛋白帶。圖9-A為蛋白峰在所有建模型樣品中的表達(dá)水平展示，箭頭指向?yàn)橛糜诮Ｐ偷暮少|(zhì)比為5337m/z的肺癌特征蛋白峰；圖9-B表示根據(jù)蛋白峰進(jìn)行蛋白的模擬凝膠電泳圖， 其中箭頭指向建模型的5337m/z的特征蛋白帶。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1肺癌質(zhì)譜模型的建立1.樣本和儀器選自94例血清樣本，其中60例來自肺癌患者，另外34例來自健康人群，肺癌患者均經(jīng)術(shù)后病理報(bào)告確定。所有的血清樣本均在清晨空腹下抽取，分離血清后儲(chǔ)存在-80低溫冰箱中?；|(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜Autoflex II T0F/T0F及實(shí)驗(yàn)用的WCX磁珠試劑盒由美國Bruker公司研制。使用Bruker公司的數(shù)據(jù)分析軟件Clinprotools做數(shù)據(jù)的預(yù)處理，處理后的數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)分析軟件R2. 6. 2的遺傳算法包genalg進(jìn)行處理。2.技術(shù)路線血清的采集收集靜脈血在BD管中，避免溶血。緩慢地上下振蕩管五次，使血液中的凝結(jié)塊混勻。室溫(25°C )血凝結(jié)1小時(shí)，垂直放置。其中血液必須精確凝結(jié)一小時(shí)，否則，由于樣品不同的凝結(jié)時(shí)間而導(dǎo)致不同的肽譜。室溫下，用臨床離心機(jī)以1.400-2. OOOg 離心SST管(真空采血管，BD公司)十分鐘。吸取血清(上清液)到對應(yīng)的已標(biāo)記管中。標(biāo)記干凈的0. 5ml離心管，同一血清樣品50 μ 1 —管，分裝多管。立即凍存血清樣品于-80°C。 由于反復(fù)凍融血清樣品易造成多肽沉淀，從而使得肽譜丟失部分多肽，應(yīng)避免反復(fù)凍融。凍存血清分為永久保存和待分裝的。血清分裝后可在-80°C保存多年。血清樣品的磁珠處理在進(jìn)行Clirfrot實(shí)驗(yàn)前，從低溫冰箱提取分裝的血清樣品各1管，放于濕冰上?；瘍?0-90分鐘。取出10 μ 1磁珠結(jié)合緩沖液(BS)，10 μ 1混勻的磁珠懸浮液，5μ1血清樣品至樣品管，混勻。室溫靜置5min后，將樣品管放入磁珠分離器。使磁珠貼壁1分鐘，磁珠與懸浮的液體分離，吸去懸浮的液體，再向樣品管中加入100 μ 1磁珠清洗緩沖液(WQ，在磁珠分離器前后相鄰兩孔間反復(fù)移動(dòng)樣品管10次。最后一次使樣品管在磁珠分離器上靜置，磁珠與懸浮的液體分離，吸去懸浮的液體。重復(fù)從加100 μ 1磁珠清洗緩沖液，到最后吸去懸浮液體的操作步驟共3次。從磁珠分離器上取下樣品管，并向樣品管中加入5 μ 1磁珠洗脫緩沖液(EQ，溶解貼壁的磁珠，樣品管放入磁珠分離器，磁珠貼壁2min，磁珠與懸浮的液體充分分離后，將上清液移入干凈的剛加入5μ 1磁珠穩(wěn)定緩沖液 (SS)O. 5ml 樣品管。3.生物信息學(xué)方法(一 )質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集應(yīng)用Autoflex II T0F/T0F質(zhì)譜儀。激光能量50 %時(shí)，IOshots去雜，36 %時(shí) 50shots采集一個(gè)樣品結(jié)晶點(diǎn)的某一個(gè)點(diǎn)，平均每個(gè)樣品結(jié)晶點(diǎn)收集8次共400shots。激光頻率50Hz。數(shù)據(jù)收集范圍l-20KDa。在每8個(gè)樣品結(jié)晶點(diǎn)收集數(shù)據(jù)前用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行外標(biāo)校正，平均分子量偏差小于lOOppm。參見圖1，圖1中為血清多肽指紋譜圖，前三個(gè)(肺癌A-C)為肺癌患者的，后三個(gè)(normal E-F)為健康人的。實(shí)驗(yàn)質(zhì)控(1)對于每一張采集到的原始圖譜，我們設(shè)定S/N > = 5的峰數(shù)量做為評判圖譜質(zhì)量的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)；對于峰數(shù)量大于50的圖譜才保存，舍棄峰數(shù)量小于50的圖譜。 (2)針對整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作，采用Sigma血清的組內(nèi)變異系數(shù)保證實(shí)驗(yàn)的一致性，本實(shí)例方法的變異系數(shù)為16. 2%，滿足一致性允許范圍，說明實(shí)驗(yàn)一致性良好，參見表1、圖2。表1為 Sigma血清中12個(gè)蛋白峰的變異系數(shù)值；圖2為實(shí)驗(yàn)中5個(gè)SigmaA-E血清的指紋圖譜。表1 Sigma血清的組內(nèi)變異系數(shù)
權(quán)利要求
1.用于檢測肺癌特征蛋白的質(zhì)譜標(biāo)記，其包括質(zhì)荷比為4054m/z、2273m/z、4091m/z、 3955m/z、3192m/z、3884m/z 和 5337m/z 的峰。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)譜標(biāo)記，其特征在于，所述的表征質(zhì)荷比為4054m/z、 2273m/z、4091m/z、3955m/z、3192m/z、3884m/z 和 5337m/z 的多肽的氨基酸序列分別如 SEQ ID No. USEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6 和 SEQ IDNo. 7 所示。
3.用于檢測肺癌特征蛋白的質(zhì)譜模型，其特征在于，該質(zhì)譜模型中包含質(zhì)荷比為 4054m/z、2273m/z、409 lm/z、3955m/z、3192m/z、3884m/z 和 5337m/z 的峰，其中，當(dāng) 4054m/z、 2273m/z、4091m/z、3955m/z、3192m/z 的峰都下調(diào)表達(dá)，以及 3884m/z 和 5337m/z 的峰上調(diào)表達(dá)時(shí)預(yù)示為肺癌患者或潛在患者。
4.建立權(quán)利要求3所述質(zhì)譜模型的方法，包括如下步驟1)收集多例臨床確診的肺癌患者血清和正常對照人員的血清作為兩組血清標(biāo)本，進(jìn)行低溫冷凍備用；2)對血清蛋白進(jìn)行質(zhì)譜前預(yù)處理；3)對預(yù)處理過的兩組血清蛋白進(jìn)行質(zhì)譜檢測讀取，獲得兩組血清多肽的指紋圖譜；4)對所有的肺癌患者和正常人血清多肽的指紋圖譜進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，并收集數(shù)據(jù)；5)對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，篩選出具有下列質(zhì)荷比峰的七個(gè)肺癌特征蛋白 4054m/z、2273m/z、4091m/z、3955m/z、3192m/z、3884m/z 和 5337m/z，對差異多Jft 4054m/z、 2273m/z、4091m/z、3955m/z、3192m/z、3884m/z 和 5337m/z 進(jìn)行多Jft序列測定，根據(jù)這七個(gè)質(zhì)荷比峰建立檢測肺癌特征蛋白的質(zhì)譜模型。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，其中步驟幻預(yù)處理的方法包括使用磁珠純化和穩(wěn)定樣品中的血清蛋白或多肽。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于檢測肺癌特征蛋白的質(zhì)譜模型，該質(zhì)譜模型包括質(zhì)荷比為4054m/z、2273m/z、4091m/z、3955m/z、3192m/z、3884m/z和5337m/z的峰，模型中表征為質(zhì)荷比4054m/z、2273m/z、4091m/z、3955m/z、3192m/z、3884m/z和5337m/z的蛋白是肺癌血清特征蛋白，當(dāng)4054m/z、2273m/z、4091m/z、3955m/z、3192m/z的峰下調(diào)表達(dá)，以及3884m/z、5337m/z的峰上調(diào)表達(dá)時(shí)預(yù)示為肺癌患者或潛在患者。本發(fā)明的質(zhì)譜模型，可用于肺癌早期檢測和篩查，方法簡單易于操作，準(zhǔn)確性高，為肺癌早期檢測和篩查提供了新的思路。
文檔編號G01N21/64GK102323246SQ20111021698
公開日2012年1月18日 申請日期2011年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月29日
發(fā)明者任晶, 胡曉慧, 趙艷梅, 馬慶偉 申請人:毅新興業(yè)(北京)科技有限公司