專利名稱：一種測定蓖麻毒蛋白含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測定蓖麻毒蛋白含量的方法，屬于化學(xué)定量分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
顧復(fù)昌等[參考文獻(xiàn)1]人用雙縮脲法測定了蓖麻毒蛋白含量。趙丹[參考文獻(xiàn) 2]經(jīng)硫酸銨鹽析、親和層析和凝膠過濾，得到了純的蓖麻毒蛋白，用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度。雙縮脲法很復(fù)雜、繁瑣。提純后再用考馬斯亮藍(lán)法測定蓖麻毒蛋白含量，提純過程中物質(zhì)損失很大，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量比較粗放，數(shù)據(jù)和實(shí)際含量差距大。金汝城等[參考文獻(xiàn)3]和高寶巖[參考文獻(xiàn)4]將蓖麻籽脫殼后脫脂，冰浴下在磷酸緩沖溶液中攪拌提取，用硫酸銨沉淀得到蓖麻粗蛋白，測定并計(jì)算濃度，通過葡聚糖 G-200或kpharose 4B分離純化蓖麻毒蛋白，用高效液相色譜法確定蓖麻毒蛋白，之后計(jì)算蓖麻毒蛋白含量。單純用高效液相色譜法，一般只能進(jìn)行定性鑒定，精確定量很難做到。在用葡聚糖 G-200或kpharose 4B分離純化蓖麻毒蛋白的過程中，毒蛋白損失很大，所以數(shù)據(jù)測定粗放。參考文獻(xiàn)[1]顧復(fù)昌，彭泳芳.蓖麻籽粕毒蛋白及非毒蛋白含量的測定.中國油料，1980，1 63-64 ；[2]趙丹.蓖麻毒蛋白的提純及殺蟲效果研究[碩].長沙湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005 ；[3]金汝城，賈超，楊曉華等.蓖麻毒蛋白的分離純化及其對南方根結(jié)線蟲殺滅效果的研究.中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2008，3 (4) =293-296 ；[4]高寶巖.蓖麻毒蛋白的提取及分析.光譜實(shí)驗(yàn)室，2001，18 ) =429-431 ；[5]曾佑煒，宋光泉，彭永宏等.蓖麻毒蛋白的分離純化和毒理作用研究.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2004，2(K4) :23-26 ；

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種測定蓖麻毒蛋白含量的方法。一種測定蓖麻毒蛋白含量的方法，包括以下步驟A1，提取蓖麻粗蛋白；A2，測定蓖麻粗蛋白含量；A3，測定蓖麻毒蛋白含量，包括以下步驟A31-A34 A31，用樣品的粗蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，得到樣品粗蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果；A32，采用質(zhì)譜法，對每條泳道的蛋白進(jìn)行確定，確定分子量為32. Okb和34. Okb的兩條帶為蓖麻毒蛋白條帶；A33，利用BandScan蛋白定量分析軟件，對9個蓖麻樣品粗蛋白電泳結(jié)果進(jìn)行泳道分析；
A34，毒蛋白含量計(jì)算。采用質(zhì)譜法確定分子量為32. Okb和34. Okb的兩條帶為蓖麻毒蛋白條帶之后，不用每次都進(jìn)行測定。以后可以用此方法對大量樣品進(jìn)行簡單、快速、精確測定蓖麻種子中的毒蛋白含量，既節(jié)省時間，測定的數(shù)據(jù)又更接近實(shí)際含量。


圖1為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2為9個蓖麻樣品粗蛋白電泳圖注M 低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)1 :1號樣品2 2號樣品3 3號樣品4 4號樣品5 5號樣品6 6號樣品7 7號樣品8 8號樣品9 9號樣品圖3為對9個蓖麻樣品粗蛋白電泳結(jié)果進(jìn)行泳道分析。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。利用磷酸鹽法、BCA試劑盒法、UVwin5紫外軟件V5. 1. 0, SDS-PAGE電泳、BandScan 蛋白定量分析軟件、質(zhì)譜法相結(jié)合，優(yōu)化出一個簡單、快速、精確測定蓖麻毒蛋白含量的方法。具體操作方法如下1. 1蓖麻粗蛋白的提取(磷酸鹽法)每個樣品稱取50. Og去殼蓖麻籽，在液氮中充分研磨；加入5mmol/L磷酸緩沖液(PBS，pH6. 5，含lOOmmol/LNaCl，稱為緩沖液A) 200ml并充分混勻；4°C放置過夜；4°C下 20000g離心30min，小心去除沉淀和白色脂肪，取上清；重復(fù)離心一次，取上清；在上清中加入固體(MM)2SO4，達(dá)到60%飽和度；4°C放置3h ；4°C下20000g離心30min ；倒去上清，把沉淀溶解在緩沖液A中；裝入透析袋(MW :8000-14000)，用PEG (分子量20000)包埋后4°C透析池；4°C下20000g離心30min，取上清即為毒蛋白粗品，記錄所得的粗蛋白的體積。設(shè)3 個重復(fù)。1. 2蓖麻粗蛋白含量的測定(BCA試劑盒法、UVwin5紫外軟件V5. 1. 0)1.2. 1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作操作步驟參照北京莊盟國際生物基因科技有限公司BCA蛋白定量試劑盒說明。數(shù)據(jù)采集和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用UVwin5紫外軟件V5. 1. 0軟件。利用BCA法繪制的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，圖1中公式C = klx (Abs)+k0 ；校正方法 濃度法；k0 -0. 08091 ；kl :0. 98279 ；R2 0. 9997 ；測量波長562. Onm ；1.2. 2粗蛋白濃度測定取一定量粗蛋白，稀釋100倍后測Abs(UgAil)，并根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算稀釋100倍后每個樣品的粗蛋白濃度(ug/ul)。1.2. 3粗蛋白含量的計(jì)算根據(jù)粗蛋白的濃度、粗蛋白的體積和每個樣品提取粗蛋白時的種子用量，計(jì)算出每個樣品每克種子中粗蛋白的含量。不同蓖麻樣品粗蛋白含量測定，結(jié)果見表1。表1不同蓖麻樣品粗蛋白含量測定結(jié)果
權(quán)利要求
1. 一種測定蓖麻毒蛋白含量的方法，其特征在于，包括以下步驟:A1，提取蓖麻粗蛋白；A2，測定蓖麻粗蛋白含量；A3，測定蓖麻毒蛋白含量，包括以下步驟A31-A34 A31，用樣品的粗蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，得到樣品粗蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果； A32，采用質(zhì)譜法，對每條泳道的蛋白進(jìn)行確定，確定分子量為32. 01Λ和34. Okb的兩條帶為蓖麻毒蛋白條帶；A33，利用BandScan蛋白定量分析軟件，對9個蓖麻樣品粗蛋白電泳結(jié)果進(jìn)行泳道分析；A34，毒蛋白含量計(jì)算。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種測定蓖麻毒蛋白含量的方法，包括以下步驟A1，提取蓖麻粗蛋白；A2，測定蓖麻粗蛋白含量；A3，測定蓖麻毒蛋白含量，包括以下步驟A31-A34A31，用樣品的粗蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，得到樣品粗蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果；A32，采用質(zhì)譜法，對每條泳道的蛋白進(jìn)行確定，確定分子量為32.0kb和34.0kb的兩條帶為蓖麻毒蛋白條帶；A33，利用BandScan蛋白定量分析軟件，對9個蓖麻樣品粗蛋白電泳結(jié)果進(jìn)行泳道分析；A34，毒蛋白含量計(jì)算。本發(fā)明的方法既節(jié)省時間，測定的數(shù)據(jù)又更接近實(shí)際含量。
文檔編號G01N27/62GK102411027SQ20111021759
公開日2012年4月11日 申請日期2011年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月1日
發(fā)明者劉鵬, 孟凡娟, 李久明, 李國瑞, 狄建軍, 蘇亞拉圖, 陳永勝, 魏永春, 黃鳳蘭 申請人:內(nèi)蒙古民族大學(xué)