專利名稱：基于能斯特電勢(shì)熒光染料的細(xì)胞鉀電極特性的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，特別涉及基于能斯特電勢(shì)熒光染料的細(xì)胞鉀電極特性評(píng)價(jià)值的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞的電生物物理特性或電生理特性是細(xì)胞離子通道表達(dá)及功能分化或功能成熟的直接表現(xiàn)，也是一些細(xì)胞尤其是可興奮細(xì)胞功能評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。盡管細(xì)胞電生物物理特性或電生理特性評(píng)價(jià)最常用和經(jīng)典的方法仍然是膜片鉗為代表的玻璃微電極技術(shù)，這一手段的侵入性以及在某些條件下(如活組織及材料三維結(jié)構(gòu)內(nèi)部)應(yīng)用的局限性使得人們逐漸采用更加實(shí)用的非侵入性研究或評(píng)價(jià)方法。電勢(shì)熒光染料技術(shù)是近二十余年發(fā)展起來的評(píng)價(jià)細(xì)胞電生物物理特性的非侵入性檢測(cè)手段。它依靠電勢(shì)敏感熒光染料及顯微熒光技術(shù)來評(píng)價(jià)細(xì)胞的電生物物理特性或電生理特性進(jìn)而了解細(xì)胞的功能特性。盡管當(dāng)今電勢(shì)熒光染料技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)使得該技術(shù)可以被用于可興奮細(xì)胞動(dòng)作電位的顯示與研究，細(xì)胞靜息電位的評(píng)價(jià)與研究仍然是電勢(shì)熒光染料技術(shù)最為常見的用途。細(xì)胞靜息電位的評(píng)價(jià)對(duì)于成熟前的可興奮細(xì)胞(不具備動(dòng)作電位特征)及非興奮細(xì)胞的研究及功能評(píng)價(jià)具有極其重要的意義。這里的一個(gè)典型的應(yīng)用實(shí)例是在神經(jīng)干細(xì)胞以及以神經(jīng)干細(xì)胞為基礎(chǔ)的組織工程植入體的應(yīng)用研究。神經(jīng)干細(xì)胞以其可自我更新及多分化潛能在神經(jīng)組織修復(fù)、退行性疾病治療和神經(jīng)組織工程研究等方面有著巨大的應(yīng)用潛能。神經(jīng)干細(xì)胞的一個(gè)重要功能是分化為神經(jīng)元并修復(fù)神經(jīng)組織的缺損或病變。成熟神經(jīng)元的主要功能是接收、處理和傳遞電化學(xué)信號(hào)。在這一過程中，膜上離子通道的表達(dá)及功能成熟是神經(jīng)細(xì)胞完成其功能的基礎(chǔ)。在神經(jīng)干細(xì)胞沒有分化或分化的早期，離子通道尤其是電壓依賴性離子通道稀少且細(xì)胞不能產(chǎn)生穩(wěn)定的動(dòng)作電位時(shí)，細(xì)胞膜靜息電位是神經(jīng)干細(xì)胞所能檢測(cè)到的最重要的電生物物理特性。因此，研究細(xì)胞靜息電位建立成為了解神經(jīng)干細(xì)胞離子通道功能表達(dá)情況的重要途徑。為實(shí)現(xiàn)以細(xì)胞靜息膜電位了解細(xì)胞離子通道功能表達(dá)情況，一個(gè)核心的問題是細(xì)胞靜息膜電位的高內(nèi)含解析。細(xì)胞電極特性是與細(xì)胞靜息膜電位對(duì)細(xì)胞外離子濃度依賴關(guān)系相關(guān)的重要細(xì)胞電生物物理特性功能參數(shù)。其中最重要的是細(xì)胞鉀電極特性(細(xì)胞靜息電位變化對(duì)細(xì)胞外 K+濃度的依賴性)。細(xì)胞靜息電位的建立涉及鉀通道電流、鈉通道電流以及少量其他通道電流。從這一角度看，細(xì)胞電極特性可以理解為與靜息膜電位建立中各通道電流相對(duì)貢獻(xiàn)有關(guān)的物理量。理論上，如果細(xì)胞的靜息膜電位完全由鉀通道電流參與建立，細(xì)胞的靜息膜電位與胞外鉀離子濃度的依賴關(guān)系將完全符合Nernst方程的定量關(guān)系，細(xì)胞膜的鈉/鉀通透性比值將為零。容易理解，在神經(jīng)干細(xì)胞分化的不同時(shí)期，隨著細(xì)胞離子通道表達(dá)譜的改變，神經(jīng)干細(xì)胞應(yīng)該具有不同的細(xì)胞鉀電極特性或鈉/鉀通透性比值。采用膜片鉗的研究表明，在神經(jīng)干細(xì)胞分化前及分化初期，當(dāng)細(xì)胞鉀通道電流密度表達(dá)增加成為優(yōu)勢(shì)通道電流而又同時(shí)缺少鈉通道電流、鈣通道電流時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞靜息電位變化對(duì)細(xì)胞外K+的依
4賴性接近Nernst方程的描述，即Nernst (能斯特)鉀電極特性，推測(cè)這一現(xiàn)象可能與神經(jīng)干細(xì)胞存在的延遲整流性鉀電流以及大量的主要由鉀離子介導(dǎo)的被動(dòng)電流有關(guān)。隨著神經(jīng)干細(xì)胞的進(jìn)一步分化和鈉通道和鈣通道等電流的表達(dá)和增加，細(xì)胞靜息膜電位值可能明顯偏離鉀平衡電位或Nernst鉀電極特性，同時(shí)，細(xì)胞膜的鈉/鉀通透性比值可能會(huì)明顯地增加。因此考察細(xì)胞的鉀電極特性可以作為神經(jīng)干細(xì)胞功能分化程度的一個(gè)重要客觀指標(biāo)。應(yīng)用膜片鉗技術(shù)評(píng)價(jià)細(xì)胞鉀電極特性的局限性是①膜片鉗技術(shù)操作精細(xì)，儀器昂貴，技術(shù)要求高，不便于普通研究與開發(fā)機(jī)構(gòu)推廣；②檢測(cè)通量低，每次只能測(cè)定一個(gè)細(xì)胞。同時(shí)，細(xì)胞取樣的隨機(jī)性及取樣不足可能給結(jié)果的解釋帶來困難；③是一種侵入性測(cè)量手段，測(cè)量對(duì)細(xì)胞的侵入或封接不可避免地會(huì)引起細(xì)胞功能特性的改變；④操作過程往往需要細(xì)胞脫離原來生長(zhǎng)環(huán)境進(jìn)行檢測(cè)，難于在原位或in situ實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞鉀電極特性或其他電生物物理特性的評(píng)價(jià)；⑤難于在活組織或材料三維結(jié)構(gòu)條件下應(yīng)用。與之相對(duì)應(yīng)的是， 電勢(shì)熒光染料技術(shù)的特點(diǎn)是①技術(shù)要求低，易于廣泛推廣和使用；②檢測(cè)通量高，一次能測(cè)定一個(gè)視野內(nèi)的所有細(xì)胞；③是一種非侵入性測(cè)量手段；④操作過程細(xì)胞不需要脫離原來生長(zhǎng)環(huán)境進(jìn)行檢測(cè)，可在原位或in situ實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞鉀電極特性或其他電生物物理特性的評(píng)價(jià)；⑤結(jié)合激光共聚焦顯微技術(shù)，可以直接在活組織或材料三維結(jié)構(gòu)條件下應(yīng)用。能斯特電勢(shì)熒光染料是一類根據(jù)細(xì)胞膜電位在細(xì)胞內(nèi)外分布呈Nernst平衡的電勢(shì)敏感熒光染料。它可以依據(jù)染料在細(xì)胞內(nèi)外的分布濃度比值或熒光強(qiáng)度比值來評(píng)價(jià)細(xì)胞的靜息膜電位及變化。然而，由于染料帶有電荷，在跨膜平衡分布的同時(shí)會(huì)不可避免地與細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)的生物大分子相結(jié)合，即非電勢(shì)依賴性結(jié)合。非電勢(shì)依賴性結(jié)合是影響以能斯特染料確定細(xì)胞靜息電位數(shù)值的主要干擾因素。在進(jìn)行細(xì)胞靜息膜電位的有關(guān)比較研究時(shí)，非電勢(shì)依賴性結(jié)合是這一方法系統(tǒng)誤差的組成部分。顯然，忽略非電勢(shì)依賴性結(jié)合并不會(huì)影響有關(guān)比較研究的結(jié)論。另一種權(quán)宜的校正非電勢(shì)依賴性結(jié)合的方法是，以高鉀離子濃度的溶液(通常130mM)刺激細(xì)胞，在這一“零電位”狀態(tài)標(biāo)定細(xì)胞的非電勢(shì)依賴性染料結(jié)合量。很顯然，這一標(biāo)定方法在很大程度上取決于“零電位”狀態(tài)的實(shí)際電位值。上述標(biāo)定方法顯然不適用于在評(píng)價(jià)細(xì)胞鉀電極特性、需要更準(zhǔn)確了解細(xì)胞靜息膜電位與細(xì)胞外鉀離子濃度依賴關(guān)系時(shí)非電勢(shì)依賴性染料結(jié)合的標(biāo)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供基于能斯特電勢(shì)熒光染料的細(xì)胞鉀電極特性評(píng)價(jià)值的檢測(cè)方法，該方法準(zhǔn)確性高，操作簡(jiǎn)單。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為1、基于能斯特電勢(shì)熒光染料的細(xì)胞鉀電極特性的檢測(cè)方法，具體包括以下步驟A建立具有能斯特鉀電極特性的細(xì)胞用鉀離子載體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，得具有能斯特鉀電極特性的細(xì)胞；B對(duì)細(xì)胞內(nèi)平均鉀離子濃度與染料非電勢(shì)依賴性結(jié)合系數(shù)的比值的計(jì)算將步驟A所述具有能斯特鉀電極特性的細(xì)胞浸浴在設(shè)定的梯度鉀離子濃度，即 [K+]。的溶液中，用能斯特電勢(shì)熒光染料染色并平衡，用熒光顯微技術(shù)對(duì)染色平衡后的細(xì)胞在同一參數(shù)條件下拍照、圖像分析，求得細(xì)胞內(nèi)外熒光強(qiáng)度比值[F]i/[F]。，將已知的各組
5[K+]。和[F] J [F]。值代入公式
權(quán)利要求
1.基于能斯特電勢(shì)熒光染料的細(xì)胞鉀電極特性的檢測(cè)方法，其特征在于，具體包括以下步驟A建立具有能斯特鉀電極特性的細(xì)胞用鉀離子載體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，得具有能斯特鉀電極特性的細(xì)胞； B對(duì)細(xì)胞內(nèi)平均鉀離子濃度與染料非電勢(shì)依賴性結(jié)合系數(shù)的比值的計(jì)算將步驟A所述具有能斯特鉀電極特性的細(xì)胞浸浴在設(shè)定的梯度鉀離子濃度，即[K+]。的溶液中，用能斯特電勢(shì)熒光染料染色并平衡，用熒光顯微技術(shù)對(duì)染色平衡后的細(xì)胞在同一參數(shù)條件下拍照、圖像分析，求得細(xì)胞內(nèi)外熒光強(qiáng)度比值[F]i/[F]。，將已知的各組[K+]。和[F] 乂 [F]。值代入公式= fff中，進(jìn)行線性擬合，求得具有能斯特鉀電極特性的J Yk J0 L^J0細(xì)胞胞內(nèi)平均鉀離子濃度與染料非電勢(shì)依賴性結(jié)合系數(shù)的比值，即[K+]i/f ； C胞內(nèi)鈉離子的檢測(cè)用鈉離子載體對(duì)細(xì)胞通透使細(xì)胞內(nèi)外的鈉離子平衡，讓細(xì)胞浸浴在預(yù)先設(shè)定的梯度鈉離子濃度[Na+]。的緩沖液中，對(duì)細(xì)胞加載Na+熒光染料并平衡，拍照，對(duì)圖像進(jìn)行分析，得到不同的[Na+]。濃度所對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度讀數(shù)，以細(xì)胞內(nèi)鈉離子的熒光強(qiáng)度對(duì)設(shè)定濃度作圖，對(duì)其進(jìn)行線性擬合求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程；在相同的條件下，另取未使用用鈉離子載體處理的細(xì)胞使用相同濃度的Na+熒光染料染色，拍照，對(duì)圖像進(jìn)行分析，得出對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度讀數(shù)，以胞內(nèi)鈉離子熒光強(qiáng)度代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，可以直接計(jì)算胞內(nèi)鈉離子濃度；D非電勢(shì)依賴性染料結(jié)合系數(shù)的標(biāo)定及待測(cè)細(xì)胞鉀電極特性評(píng)價(jià)值的獲得將待測(cè)鉀電極特性的細(xì)胞浸浴在設(shè)定的梯度鉀離子濃度的溶液中，該溶液是以不同濃度鉀離子依次置換鈉離子的等滲鹽溶液，其中鉀離子濃度與鈉離子濃度之和為依據(jù)等滲條件設(shè)定的常量；用能斯特電勢(shì)熒光染料分別染色并平衡，用熒光顯微技術(shù)對(duì)染色平衡后的細(xì)胞在同一參數(shù)條件下拍照、圖像分析，求得細(xì)胞內(nèi)外熒光強(qiáng)度比值[F] 乂 [F]。；將上述所得各濃度梯度下對(duì)應(yīng)的[F]i/[F]。比值、步驟B所得[K+]i/f值以及步驟C所得的[Na+幾值[Fl [K+ \lf + [Na+1 .PNalK // 代入公式H = Lr'+1 ΓΛΓ + 中，取得的數(shù)據(jù)采用非線性迭代擬合法 [Fl [Κ+]ο+ΡΝα/κ[Να+]ο求出染料非電勢(shì)依賴性結(jié)合系數(shù)f、胞內(nèi)鉀離子濃度DOi和細(xì)胞表觀鈉/鉀通透性比值1^值;所述步驟B和步驟C的進(jìn)行無(wú)時(shí)間上的先后區(qū)分，[F]” [F]。分別為胞內(nèi)、外熒光強(qiáng)度， [K+]。為胞外鉀離子濃度，[K+Ji為胞內(nèi)鉀離子濃度，f為非電勢(shì)依賴性染料結(jié)合系數(shù)，[Na+J0 為胞外鈉離子濃度，[Na+]i為胞內(nèi)鈉離子濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，在步驟A中，鉀離子載體為纈氨霉素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，在步驟B中，能斯特電勢(shì)熒光染料為四甲基羅丹明甲酯染料或其它依據(jù)能斯特平衡原理進(jìn)行細(xì)胞膜電位測(cè)量的電勢(shì)熒光染料。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，在步驟B中，細(xì)胞浸浴的梯度鉀離子濃度溶液為無(wú)鈉離子的鹽溶液，鉀離子濃度梯度由有機(jī)陽(yáng)離子置換鉀離子獲得。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，在步驟B中，根據(jù)梯度鉀離子濃度條件下的細(xì)胞內(nèi)外熒光強(qiáng)度比值首先計(jì)算出細(xì)胞內(nèi)鉀離子平均濃度Dni與染料非電勢(shì)依賴性結(jié)合系數(shù)f的比值[K+L/f。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，在步驟C中，在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鈉離子熒光染料染色的同時(shí)，使用梯度鈉離子濃度溶液浸浴經(jīng)鈉離子載體通透的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)定，獲取鈉離子濃度與熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，在步驟D中，采用梯度鉀離子濃度的鹽溶液平衡浸浴待測(cè)細(xì)胞，其中平衡鹽溶液中鈉離子濃度高于步驟C中所測(cè)胞內(nèi)鈉離子濃度的數(shù)據(jù)點(diǎn)不少于三個(gè)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，在步驟D中，采用最小二乘法非線性迭代擬合法求出染料非電勢(shì)依賴性結(jié)合系數(shù)f、胞內(nèi)鉀離子濃度[K+] i和細(xì)胞表觀鈉/鉀通透性比值I3iwk值。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法在細(xì)胞離子通道功能表達(dá)或功能分化的非侵入性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述的檢測(cè)方法在材料三維結(jié)構(gòu)條件下對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞離子通道功能表達(dá)或功能分化的非侵入性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明特別涉及基于Nernst電勢(shì)熒光染料的細(xì)胞鉀電極特性評(píng)價(jià)方法，具體步驟為構(gòu)建具Nernst鉀電極特性的細(xì)胞，以電勢(shì)熒光染料技術(shù)得到[K+]i/f；用鈉離子熒光染料評(píng)價(jià)胞內(nèi)鈉離子濃度；在梯度鉀溶液中測(cè)量經(jīng)電勢(shì)熒光染料染色的待測(cè)細(xì)胞胞內(nèi)外熒光強(qiáng)度比，根據(jù)Goldman方程以非線性迭代擬合得出f、[K+]i和細(xì)胞表觀鈉/鉀通透性比PNa/K，以PNa/K作為評(píng)價(jià)細(xì)胞鉀電極特性的定量指標(biāo)；本發(fā)明建立的細(xì)胞鉀電極特性評(píng)價(jià)法，為以電勢(shì)熒光染料技術(shù)研究細(xì)胞電生物物理特性及離子通道功能表達(dá)提供了新的指標(biāo)和方法，并為材料三維結(jié)構(gòu)下細(xì)胞電生物物理特性乃至神經(jīng)細(xì)胞功能分化的非侵入性原位檢測(cè)提供了可能。
文檔編號(hào)G01N33/50GK102393451SQ201110218448
公開日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月1日
發(fā)明者吳澤志, 威廉.S.克薩阿利達(dá), 宋兆全, 廖彥劍, 張利光, 李晨鐘, 林雨, 羅美蓉, 金良, 陳景龍, 黃豈平 申請(qǐng)人:重慶大學(xué)