專利名稱：黃芪提取物中糖類成分的含量測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種中藥提取物中有效成分的含量測定方法，特別涉及黃芪提取物中糖類成分的含量測定方法，該提取物為芪參益氣滴丸中間體之一。
背景技術：
中藥材黃芪為豆科草本植物蒙古黃芪、膜莢黃芪的根，具有補氣固表、利水退腫、 托毒排膿、生肌等功效。黃芪的藥用迄今已有2000多年的歷史，現(xiàn)代研究，黃芪含皂甙、蔗糖、多糖、多種氨基酸、葉酸及硒、鋅、銅等多種微量元素。有增強機體免疫功能、保肝、利尿、 抗衰老、抗應激、降壓和較廣泛的抗菌作用。
黃芪提取物(黃芪提取物)黃芪提取物為黃芪經(jīng)過乙醇提取得到的黃芪提取物， 其在市場上有售，黃芪提取物可以作為如芪參益氣滴丸的制劑的中間體。芪參益氣滴丸是天士力集團研制的治療心血管疾病的現(xiàn)代中藥，是提取黃芪、丹參、三七、降香中的有效成分精制而成的滴丸制劑，適用于慢性心功能不全、心肌炎及后遺癥、心肌梗塞恢復期、心肌纖維化等病癥。芪參益氣滴丸在上市七年中，已經(jīng)建立起了一整套全面地的工藝質(zhì)量控制體系，并且不斷進行完善和補充。
黃苗提取物中含有的主要活性成分為polysaccharides黃苗多糖，另有其他成分如單糖、多糖、皂甙、黃酮、氨基酸、微量元素、蛋白質(zhì)、核黃素、葉酸、維生素P、有機酸、 香豆素、谷甾醇、胡蘿卜甙、羽扁豆醇、正十六醇、膽堿、甜菜堿等多種成分。
中藥中的糖類成分糖類成分可分布于植物的各個部位，常常占植物干重的80% 90%，是中藥材及中藥產(chǎn)品中的主要組成成分，所占含量比例很高。另外，許多糖類成分對于中藥活性成分具有輔助藥效作用，同時糖類成分本身也具有為機體提供能量的作用，因此糖類成分的測定對于全面掌握中藥材及中藥產(chǎn)品質(zhì)量非常重要。測定結(jié)果表明，黃芪提取物中主要含有蔗糖和果糖等小分子糖類物質(zhì)，且含量較高，所以測定它們的含量非常必要。
糖類成分的測定針對糖類成分的常用測定方法有化學分析法、氣相色譜法、離子交換色譜法、凝膠色譜法、高效液相色譜法、毛細管電泳法、衍生化氣相色譜法等。但這些方法穩(wěn)定性差，靈敏度不高。
為得到一種新的黃芪提取物中糖類成分的含量測定方法，本發(fā)明采用高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-EL SD)法，具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、能夠進行梯度洗脫等優(yōu)點。
本發(fā)明采用PrevailTM Carbohydrate ES色譜柱,對于各個小分子糖類的分離度大大提高。相對于常用的氨基柱，具有噪音低，色譜柱壽命長的特點，是本專利的最大優(yōu)勢所在。
本發(fā)明以最簡單的乙腈-水為流動相，能夠在20分鐘內(nèi)完成測定，色譜峰分離度均大于3，達到高效、快速分離。
本發(fā)明采用固相萃取技術，能夠有效去除黃酮、皂苷等干擾成分。
經(jīng)驗證本發(fā)明的質(zhì)量控制方法精密度、靈敏度、穩(wěn)定性良好，能夠有效測定復方丹參浸膏中的糖類物質(zhì)含量。
本發(fā)明針對黃芪提取物中含量較高的糖類成分建立的含量測定方法，目的是進一步提升產(chǎn)品質(zhì)量控制水平，從而更加準確的把握產(chǎn)品質(zhì)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種專屬性強、靈敏度高、穩(wěn)定準確的糖類成分測定方法，用于黃芪提取物中糖類成分的含量測定，該方法包括以下步驟
I)糖類成分對照品溶液的制備
2)對黃芪提取物進行溶解，上固相萃取小柱，水洗脫，收集洗脫液；
3)采用高效液相色譜法進行樣品測定。采用PrevailTM Carbohydrate ES色譜柱，以一定比例的有機溶劑和水為流動相，進行洗脫；
4)以ELSD檢測器進行檢測；
5)用外標兩點法對數(shù)方程分別計算果糖和蔗糖的含量。
其中所述糖類成分為果糖和蔗糖。其中所述黃芪提取物為黃芪經(jīng)過水煮得到的浸膏，或黃芪經(jīng)過有機溶劑提取得到的浸膏。所述有機溶劑為醇類有機溶劑，醇類有機溶劑， 優(yōu)選乙醇，優(yōu)選95 %的食用乙醇。
本發(fā)明所述黃芪提取物還可以是經(jīng)過水煮醇提得到的，也可以是經(jīng)過醇提水沉得到的，還可以是在以上步驟的基礎上進一步經(jīng)過選自萃取，過柱，酸化，堿化等步驟得到的。
如采用以下方法得到黃芪提取物，提取方法包括以下步驟黃芪藥材加水煎煮3 次，每次I. 5h，第I次加水量為5倍量，第2、3次加水量為3倍量，合并煎煮液，濃縮至浸膏， 加95%乙醇至溶液含醇量為70%，冷藏過夜，過濾，濾液濃縮至浸膏。加無水乙醇使浸膏含醇量為85 %，冷藏過夜，濾過，濾液濃縮至浸膏，即可。
優(yōu)選的本發(fā)明的測定方法如下
I)對照品溶液的制備精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過的果糖對照品、蔗糖對照品適量，加水制得每毫升含果糖和蔗糖分別為O. 5mg和2. 5mg的混合對照溶液。
2)供試品溶液的制備取黃芪提取物約O. 25g，精密稱定，加水約20ml，超聲溶解，上至已處理好的固相萃取柱(Cleanert PS-SPE, O. 5g/6ml),流速約lml/min,再用水分次洗滌，收集上樣液和洗滌流出液約45ml，轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，加水至刻度，混勻，即得。
3)分別精密吸取各對照品溶液5 μ I、10 μ 1，供試品溶液10 μ 1，注入高效液相色譜儀，測定，用外標兩點法對數(shù)方程分別計算果糖和蔗糖的含量，即得。其中高效液相色譜的色譜條件為采用PrevailTM Carbohydrate ES色譜柱，以乙腈水=75 25為流動相， 流速O. 8ml/min,柱溫30°C ;以WATERS 2420 ELSD檢測器進行檢測，參數(shù)設置為增益10，氣壓25psi,漂移管60°C, Neb heater :60%。理論板數(shù)按鹿糖色譜峰計算應不低于2000。
本發(fā)明的測定方法，是經(jīng)過篩選得到的，試驗如下
驗證項目及驗證合格標準
權(quán)利要求
1.一種黃芪提取物中糖類成分的含量測定方法，該提取物為芪參益氣滴丸中間體之一，其特征在于，該方法包括以下步驟1)糖類成分對照品溶液的制備；2)對黃芪提取物進行溶解，上固相萃取小柱，水洗脫，收集洗脫液；3)采用高效液相色譜法進行樣品測定，采用PrevailTMCarbohydrate ES色譜柱，以一定比例的有機溶劑和水為流動相，進行洗脫；4)以ELSD檢測器進行檢測；5)用外標兩點法對數(shù)方程分別計算果糖和蔗糖的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的測定方法，其特征在于，所述步驟I)中糖類成分對照品溶液為一種混合物，是由果糖、葡萄糖、鹿糖、麥芽糖等單糖、二糖、低聚糖單獨、任何兩種、三種、四種、五種等更多種混合配制而成。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的測定方法，其特征在于，所述步驟2)中黃芪提取物為黃芪經(jīng)過有機溶媒提取得到，或在以上步驟的基礎上進一步經(jīng)過選自水沉，萃取，過柱，酸化，堿化等步驟得到的。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的測定方法，其特征在于，所述步驟2)中黃芪提取物為黃芪經(jīng)過水煮得到，或在以上步驟的基礎上進一步經(jīng)過選自醇沉，萃取，過柱，酸化，堿化等步驟得到的。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的測定方法，其特征在于，所述步驟I)中糖類成分對照品溶液的制備方法為精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過的果糖對照品和蔗糖對照品適量，加水制得每毫升含上述物質(zhì)各O. 5mg的混合對照溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的測定方法，其特征在于，所述步驟2)中黃芪提取物供試品溶液的制備方法為取黃芪提取物O. 25g，加水適量，超聲溶解，上至已處理好的固相萃取柱(Cleanert PS-SPE或其他型號的聚苯乙烯基質(zhì)型填料)，流速約lml/min,再用水分次洗滌，收集上樣液和洗滌流，即得。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的測定方法，其特征在于，所述步驟3)中采用高效液相色譜法進行樣品測定的方法為采用PrevailTM Carbohydrate ES色譜柱，以乙腈或甲醇為流動相A，水為流動相B，乙腈或甲醇的比例在60-90%之間，水的比例在10-40%之間。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的測定方法，其特征在于，所述步驟4)中采用ELSD檢測器為WATERS 2420 ELSD檢測器或其他品牌ELSD檢測器，采用WATERS 2420 ELSD檢測器進行檢測時，參數(shù)設置為增益10，氣壓25psi，漂移管60°C，Neb heater :60%。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的測定方法，其特征在于，所述步驟5)中采用外標兩點法對數(shù)方程分別計算樣品中果糖和蔗糖的含量。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的測定方法，其特征在于，所述黃芪提取物中的糖類成分為果糖和蔗糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種中藥提取物中有效成分的含量測定方法，特別涉及黃芪提取物中糖類成分的含量測定方法，該方法包括以下步驟1)糖類成分對照品溶液的制備；2)對黃芪提取物進行溶解，上固相萃取小柱，水洗脫，收集洗脫液；3)采用高效液相色譜法進行樣品測定。采用PrevailTM Carbohydrate ES色譜柱，以一定比例的有機溶劑和水為流動相，進行洗脫；4)以ELSD檢測器進行檢測；5)用外標兩點法對數(shù)方程分別計算果糖和蔗糖的含量。本發(fā)明檢測方法操作簡單、快捷，專屬性強、分離度高、準確度和精密度良好，適用于黃芪提取物的質(zhì)量控制。
文檔編號G01N30/02GK102928520SQ20111022729
公開日2013年2月13日 申請日期2011年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月10日
發(fā)明者劉巖, 徐波, 牛濤, 陳紅, 高陽 申請人:天津天士力現(xiàn)代中藥資源有限公司