專利名稱：用于檢測卵巢癌特征蛋白的質(zhì)譜模型及構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及惡性腫瘤檢測領(lǐng)域，為一種全新的非入侵性檢測方法，在體外對卵巢癌進行早期的發(fā)現(xiàn)和檢測，其敏感性和特異性均達(dá)到85%以上。
背景技術(shù)：
據(jù)WHO近期世界范圍統(tǒng)計資料，卵巢癌發(fā)病率和死亡率在女性生殖道惡性腫瘤中均僅低于官頸癌占第二位。而在西方國家，卵巢癌死亡率占第一位，甚至比官頸癌和子宮內(nèi)膜癌死亡人數(shù)的總和還多。由于尚無成熟的早期診斷方法，卵巢癌發(fā)現(xiàn)時70% -80%均為晚期，治療極其困難。常規(guī)的手術(shù)、化療難以治愈，即使暫時緩解亦常在2-3年后復(fù)發(fā)，而對這一部分病人反復(fù)手術(shù)、化療嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量。如果說卵巢癌是婦科腫瘤醫(yī)生面臨的最大挑戰(zhàn)并不過分。對于卵巢癌的診斷，根據(jù)其生物學(xué)特征、年齡、性別、好發(fā)部位及臨床過程進行分析，在病史及體征基礎(chǔ)上，采用電生理、超聲波、放射性核素、放射學(xué)及核磁共振等輔助檢查。近年，隨著影像學(xué)診斷技術(shù)的進步和顯微神經(jīng)外科技術(shù)的應(yīng)用，卵巢癌的診斷和治療總體上取得了顯著進步。然而，對惡性卵巢癌的治療似乎并沒有突破性進展，患者大多在確診后一年內(nèi)死亡，迫切需要一種更早期的診斷方法。基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-T0F-MS)是近年來發(fā)展起來的一種新型的軟電離生物質(zhì)譜，其原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過程。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測器的飛行時間不同而被檢測即測定離子的質(zhì)荷比(M/Z)與離子的飛行時間成正比， 檢測離子。盡管MALDI-T0F的準(zhǔn)確度高達(dá)0. 1 % 0. 01 %，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前常規(guī)應(yīng)用的SDS 電泳與高效凝膠色譜技術(shù)，但在腫瘤標(biāo)志物尤其是卵巢癌標(biāo)志物的應(yīng)用中仍然存在一些缺陷，因此國內(nèi)迄今為止尚無采用MALDI-T0F-MS技術(shù)獲得檢測卵巢癌標(biāo)志物或卵巢癌血清特征蛋白的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種用于檢測卵巢癌血清特征蛋白的質(zhì)譜模型及其制備方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種用于檢測卵巢癌特征蛋白的質(zhì)譜標(biāo)記，該質(zhì)譜標(biāo)記是質(zhì)荷比為1451m/zd673m/z的峰。表征為質(zhì)荷比1451m/z的蛋白和表征為質(zhì)荷比^73m/z的蛋白是卵巢癌血清特征蛋白，當(dāng)其它們上調(diào)表達(dá)時，預(yù)示為卵巢癌患者或潛
在患者。進而本發(fā)明提供一種用于檢測卵巢癌特征蛋白的質(zhì)譜模型，該質(zhì)譜模型由質(zhì)荷比為1451m/z和^73m/z的峰構(gòu)成，模型中表征為質(zhì)荷比1451m/z的蛋白和表征為質(zhì)荷比 2673m/z的蛋白是卵巢癌血清特征蛋白，當(dāng)其它們上調(diào)表達(dá)時，預(yù)示為卵巢癌患者或潛在患者。根據(jù)Clirfrotools軟件對數(shù)據(jù)經(jīng)過統(tǒng)一的歸一化處理后，導(dǎo)出的峰面積參數(shù)作相對定量，上調(diào)表達(dá)的臨界值是分別是24. 63 士0. 2、19. 74士0. 27。本發(fā)明質(zhì)譜模型的構(gòu)建方法包括如下步驟1)收集多例臨床確診的卵巢癌患者血清和正常對照人員的血清作為兩組血清標(biāo)本，進行低溫冷凍備用；2)對血清蛋白進行質(zhì)譜前預(yù)處理3)對預(yù)處理過的兩組血清蛋白進行質(zhì)譜檢測讀取，獲得兩組血清多肽的指紋圖譜；4)對所有的卵巢癌患者和正常人血清多肽的指紋圖譜進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，并收集數(shù)據(jù)；5)對所得數(shù)據(jù)進標(biāo)準(zhǔn)化處理，篩選出具有下列質(zhì)荷比峰的2個卵巢癌特征蛋白 145lm/z、2673m/z，對差異多肽145lm/z、2673m/z進行多肽序列測定，根據(jù)這兩個質(zhì)荷比峰建立檢測卵巢癌特征蛋白的質(zhì)譜模型。上述方法其中步驟2、預(yù)處理的方法是采用SPE-C磁珠對血清蛋白進行富集。本發(fā)明結(jié)合生物信息學(xué)方法篩選出相應(yīng)的腫瘤標(biāo)志并建立檢測模型進行分析檢測，所述的生物信息學(xué)方法包括對指紋圖譜進行標(biāo)準(zhǔn)化處理、對所得數(shù)據(jù)進實驗質(zhì)控處理、 篩選期望的血清特征蛋白并建立質(zhì)譜模型，以及可選擇地包括使用遺傳算法結(jié)合最近鄰算法建立并驗證質(zhì)譜模型等。其中，所述的實驗質(zhì)控處理指保留峰數(shù)量大于50的質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)，并采用Sigma血清的組內(nèi)變異系數(shù)來保證實驗的一致性，從而根據(jù)變異系數(shù)滿足一致性的允許范圍來進行篩選。本發(fā)明中，變異系數(shù)優(yōu)選為14.7%。本發(fā)明檢測卵巢癌特征蛋白的質(zhì)譜標(biāo)記，可用于建立血清特征蛋白質(zhì)譜模型以及應(yīng)用于在卵巢癌早期檢測和篩查。本發(fā)明的質(zhì)譜模型，可用于卵巢癌早期檢測和篩查。本發(fā)明與其它卵巢癌的檢測方法比較，具有以下優(yōu)點第一，本發(fā)明采用卵巢癌患者與正常人具有差異的兩個特征蛋白組合進行對卵巢癌血清的檢測，并采用了傳統(tǒng)統(tǒng)計學(xué)與現(xiàn)代生物信息學(xué)方法相結(jié)合的方法進行數(shù)據(jù)處理， 從而得到卵巢癌患者和健康人血清蛋白質(zhì)指紋圖譜檢測模型，并且所發(fā)現(xiàn)的一系列蛋白質(zhì)質(zhì)荷比峰為尋找新的更理想的腫瘤標(biāo)志物提供了基礎(chǔ)和資源。第二，與以往的血清學(xué)檢測方法比較具有較高的敏感性和特異性，并能用于篩選抗卵巢癌的藥物中。第三，本發(fā)明模型的構(gòu)建方法設(shè)計合理可行，為提供卵巢癌的臨床治愈率提供了新的篩查方法，同時也為探索腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制提供了新的思路。第四，利用本發(fā)明分析了 39份血清樣品，訓(xùn)練組30例，驗證結(jié)果顯示，1451m/z、 2673m/z在患病組和正常組間有明顯差異，因此本發(fā)明可對卵巢癌作出早期的診斷，提高病人的存活率和生活質(zhì)量。


圖1為部分健康人血清和卵巢癌患者血清的多肽圖譜。圖2為重復(fù)做樣的5個Sigma血清質(zhì)譜指紋圖。圖3-A為蛋白峰在所有建模型樣品中的表達(dá)水平展示，箭頭指向為用于建模型的質(zhì)荷比為1451m/z的卵巢癌特征蛋白峰；圖3-B表示根據(jù)蛋白峰進行蛋白的模擬凝膠電泳圖，其中箭頭指向建模型的1451m/z的特征蛋白帶。圖4-A為蛋白峰在所有建模型樣品中的表達(dá)水平展示，箭頭指向為用于建模型的質(zhì)荷比為^573m/Z的卵巢癌特征蛋白峰；圖4-B表示根據(jù)蛋白峰進行蛋白的模擬凝膠電泳圖，其中箭頭指向建模型的2673m/z的特征蛋白帶。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實施例1卵巢癌特征蛋白質(zhì)譜模型的建立1、樣本和儀器共39例血清樣本，其中四例來自卵巢癌患者，另外10例來自健康人群，卵巢癌患者均經(jīng)術(shù)后病理報告確定。均在清晨空腹下抽取，分離血清后儲存在-80度低溫冰箱中?；|(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜Autoflex II T0F/T0F及實驗用的SPE-C磁珠試劑盒購自毅新興業(yè)(北京)科技有限公司。使用Bruker公司的數(shù)據(jù)分析軟件Clirfrotools 做數(shù)據(jù)的預(yù)處理，處理后的數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計分析軟件R2. 6. 2的遺傳算法包genalg進行處理。2、血清采集及處理血清的采集收集靜脈血在BD管中，避免溶血。緩慢地上下振蕩管五次，使血液中的凝結(jié)塊混勻。室溫(25°C )血凝結(jié)1小時，垂直放置。其中血液必須精確凝結(jié)1小時，否則，由于樣品不同的凝結(jié)時間而導(dǎo)致不同的肽譜。室溫下，用臨床離心機以1.400-2. OOOg 離心SST管(真空采血管，BD公司)十分鐘。吸取血清(上清液)到對應(yīng)的已標(biāo)記管中。 標(biāo)記干凈的0. 5ml離心管，同一血清樣品50ul —管，分裝多管。立即凍存血清樣品于_80°C。 由于反復(fù)凍融血清樣品易造成多肽沉淀，從而使得肽譜丟失部分多肽，應(yīng)避免反復(fù)凍融。凍存血清分為永久保存和待分裝的。血清分裝后可在-80°C保存多年。血清樣品的磁珠處理在進行Clirfrot實驗前，從低溫冰箱提取分裝的血清樣品各1管，放于濕冰上?；瘍?0 90分鐘。取出10 μ 1磁珠結(jié)合緩沖液(BS)，10 μ 1混勻的磁珠懸浮液，5μ 1血清樣品至樣品管，混勻。室溫靜置5min后，將樣品管放入磁珠分離器。 使磁珠貼壁1分鐘，磁珠與懸浮的液體分離，吸去懸浮的液體，再向樣品管中加入100 μ 1磁珠清洗緩沖液(WQ，在磁珠分離器前后相鄰兩孔間反復(fù)移動樣品管10次。最后一次使樣品管在磁珠分離器上靜置，磁珠與懸浮的液體分離，吸去懸浮的液體。重復(fù)從加100 μ 1磁珠清洗緩沖液，到最后吸去懸浮液體的操作步驟共3次。從磁珠分離器上取下樣品管，并向樣品管中加入5 μ 1磁珠洗脫緩沖液(EQ，溶解貼壁的磁珠，樣品管放入磁珠分離器，磁珠貼壁2min，磁珠與懸浮的液體充分分離后，將上清液移入干凈的剛加入5μ 1磁珠穩(wěn)定緩沖液 (SS)O. 5ml 樣品管。3、生物信息學(xué)方法(一 )質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集應(yīng)用Autoflex II T0F/T0F質(zhì)譜儀。激光能量50 %時，IOshots去雜，36 %時
550shots采集一個樣品結(jié)晶點的某一個點，平均每個樣品結(jié)晶點收集8次共400shots。激光頻率50Hz。數(shù)據(jù)收集范圍l-20KDa。在每8個樣品結(jié)晶點收集數(shù)據(jù)前用標(biāo)準(zhǔn)品進行外標(biāo)校正，平均分子量偏差小于lOOppm。實驗質(zhì)控(1)對于每一張采集到的原始圖譜，設(shè)定S/N > = 5的峰數(shù)量做為評判圖譜質(zhì)量的一個標(biāo)準(zhǔn)；對于峰數(shù)量大于50的圖譜才保存，舍棄峰數(shù)量小于50的圖譜。(2) 針對整個實驗操作，采用Sigma血清的組內(nèi)變異系數(shù)保證實驗的一致性，本實例方法的變異系數(shù)為14. 7%，滿足一致性允許范圍，說明實驗一致性良好。表1為Sigma血清中12個蛋白峰的變異系數(shù)值。表ISigma血清的組內(nèi)變異系數(shù)
權(quán)利要求
1.用于檢測卵巢癌特征蛋白的質(zhì)譜標(biāo)記，其包括質(zhì)荷比為1451m/zd673m/z的峰。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)譜標(biāo)記，其特征在于，所述的質(zhì)荷比為1451m/z的多肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示；所述的質(zhì)荷比為^73m/z的多肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
3.用于檢測卵巢癌特征蛋白的質(zhì)譜模型，其特征在于，該質(zhì)譜模型中包含質(zhì)荷比為 1451m/z,2673m/z的峰，當(dāng)這兩個峰上調(diào)表達(dá)時預(yù)示為卵巢癌患者或潛在患者。
4.建立權(quán)利要求3所述質(zhì)譜模型的方法，包括如下步驟1)收集多例臨床確診的卵巢癌患者血清和正常對照人員的血清作為兩組血清標(biāo)本，進行低溫冷凍備用；2)對血清蛋白進行質(zhì)譜前預(yù)處理3)對預(yù)處理過的兩組血清蛋白進行質(zhì)譜檢測讀取，獲得兩組血清多肽的指紋圖譜；4)對所有的卵巢癌患者和正常人血清多肽的指紋圖譜進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，并收集數(shù)據(jù)；5)對所得數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，篩選出具有下列質(zhì)荷比峰的2個卵巢癌特征蛋白 1451m/ZJ673m/Z，對差異多肽1451m/ZJ673m/Z進行多肽序列測定，根據(jù)這兩個質(zhì)荷比峰建立檢測卵巢癌特征蛋白的質(zhì)譜模型。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，其中步驟幻預(yù)處理的方法是采用SPE-C磁珠對血清蛋白進行富集。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于檢測檢測卵巢癌特征蛋白的質(zhì)譜模型，該質(zhì)譜模型由質(zhì)荷比為1451m/z和2673m/z的峰構(gòu)成，模型中表征為質(zhì)荷比1451m/z的蛋白和表征為質(zhì)荷比2673m/z的蛋白是卵巢癌血清特征蛋白，當(dāng)其它們上調(diào)表達(dá)時，預(yù)示為卵巢癌患者或潛在患者。本發(fā)明的質(zhì)譜模型，可用于卵巢癌早期檢測和篩查，方法簡單易于操作，準(zhǔn)確性高。為卵巢癌早期檢測和篩查提供了新的思路。
文檔編號G01N27/64GK102426186SQ20111023898
公開日2012年4月25日 申請日期2011年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月18日
發(fā)明者李燕, 趙艷梅, 邢雙艷, 馬慶偉 申請人:毅新興業(yè)(北京)科技有限公司