專利名稱：一種卷煙主流煙氣中四種煙草特有亞硝胺含量的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種卷煙主流煙氣中四種煙草特有亞硝胺(TSNAs)含量的測定方法， 屬于煙草和化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
煙氣是一種極為復(fù)雜的混合物，但只有0. 6%的有害物質(zhì)，其中僅有0. 2% (60多種)是致癌和可疑致癌物，被IRAC(國際癌癥研究協(xié)會)列入黑名單的物質(zhì)有七類，其中就包括煙草特有亞硝胺(TSNAs)。煙氣中的大部分物質(zhì)環(huán)境空氣中也有，如苯并[a]芘(B[a] P)，在城市空氣、汽車尾氣、廚房油煙、碳烤牛肉、烤制的咖啡以及水果、蔬菜和谷物制品中都有發(fā)現(xiàn)。但煙草特有亞硝胺(TSNAs)是個(gè)例外，是一類在煙草曬制、處理、發(fā)酵和燃燒過程中產(chǎn)生的致癌物質(zhì)，在煙草制品、煙氣、環(huán)境煙氣(ETQ、無煙煙草和其它煙草制品諸如雪茄及印度雪茄里面都鑒定出了這些物質(zhì)。目前世界上已發(fā)現(xiàn)有300多種N-亞硝胺對40多種動(dòng)物有致癌性，但煙草制品和煙氣中已經(jīng)知道的只有八種，其中就包括四種煙草特有亞硝胺(TSNAs) :NNN、NNK, NAT、 NAB。目前普遍認(rèn)為TSNAs會使人患肺癌，特別是NNN和NNK。用嚙齒動(dòng)物研究表明，無論是喂食還是注射，NNK均會導(dǎo)致肺部腫瘤-表皮細(xì)胞良性腫瘤，以及肺腺癌-惡性上皮瘤。研究表明在新陳代謝過程中，NNK可使動(dòng)物活體或離體的人體組織中DNA甲基化(從這種組織中分離出了 06-甲基鳥嘌呤)，分子生物學(xué)家認(rèn)為在細(xì)胞遺傳密碼中帶有06-甲基鳥嘌呤對DNA是一種化學(xué)損害，有可能致癌。IRAC的動(dòng)物研究試驗(yàn)報(bào)告則認(rèn)為NNN也是一個(gè)會導(dǎo)致多種致癌危險(xiǎn)成分。另外，美國國家科學(xué)院估計(jì)，每天抽一盒煙的吸煙者對TSNAs的接觸量是17毫克。TSNAs的接觸途徑有呼吸系統(tǒng)吸入、消化道吸收和皮膚接觸。吸煙或接觸環(huán)境煙氣均會接觸到TSNAs。致癌性TSNAs均無安全閾值。TSNAs的產(chǎn)生機(jī)理普遍認(rèn)為煙草制品中TSNAs產(chǎn)生的機(jī)理是煙草生物堿的自然亞硝化作用。新鮮煙草中TSNAs和亞硝酸鹽含量極微，一般認(rèn)為TSNAs的形成和積累是發(fā)生在采摘之后和調(diào)制處理階段。近來有一種假設(shè)，說是因?yàn)樵诖穗A段微生物將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽和其它含氮氧化物(NOx化合物)，然后與煙草生物堿作用而形成TSNAs。對白肋煙草制品也有類似假說。但對于烤制型煙草的TSNAs產(chǎn)生機(jī)理也有另外不同的假設(shè)，明火燃燒爐排放的氣體直接進(jìn)入了烤房，氣體中的NOx自發(fā)地與煙草中的生物堿發(fā)生反應(yīng)形成 TSNAs。目前已有的煙草特有亞硝胺分析檢測方法1)氣相色譜法卷煙主流煙氣中亞硝胺含量極微，存在體系極其復(fù)雜，因此對樣品進(jìn)行常規(guī)氣相色譜(GC)分析前，為降低分析背景干擾和對色譜柱的污染，要先經(jīng)過萃取分離、富集和純化等步驟。常用的萃取劑有檸檬酸緩沖液、稀氫氧化鈉溶液、檸檬酸緩沖液一甲苯混合溶液等。提取、純化TSNAs的典型步驟是將捕集有主流煙氣粒相物的玻璃纖維濾片放人錐形瓶中，加入檸檬酸緩沖液，置于超聲波發(fā)生器內(nèi)超聲提取，再用二氯甲烷萃?。惠腿∫航?jīng)無水硫酸鈉干燥后過濾，將盛有濾液的圓底燒瓶連接旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，通高純氮?dú)庑D(zhuǎn)蒸發(fā)，40°C下濃縮至約5mL，將110°C下活化池后的堿性氧化鋁及濃縮液樣品加入層析柱，用二氯甲烷一丙酮洗脫層析柱，收集全部洗脫液，在洗脫液中準(zhǔn)確加入內(nèi)標(biāo)液后，40°C 下濃縮至約lmL，進(jìn)樣分析.2)氣相色譜一熱能檢測器法1973年氣相色譜法就已被用于TSNAs的分析，但由于每一種TSNAs的含量各不相同，其中NNN，NAT和NNK的含量相對較大，NAB的含量極微， 早期的氣相檢測器其精度很難滿足定量分析的要求。在1975年，熱能分析儀(TEA)被用于對TSNAs進(jìn)行檢測，TEA是一種針對揮發(fā)和非揮發(fā)性N —亞硝胺基化合物痕量分析的氣相檢測技術(shù)。此后TEA與GC技術(shù)的聯(lián)用在一定程度上提高了對N-亞硝基化合物的選擇性和靈敏性。近年來，有人采用氣相色譜儀配備氮磷檢測器來測定TSNAs，取得了較好的效果，但對含量極微的NAB檢測結(jié)果不十分理想。3) LC-MS/MS法通過利用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用法可以快速定量地同時(shí)測定了多種煙絲和主流煙中的TSNAs含量。其主要步驟為在煙末或收集煙氣的劍橋?yàn)V片中加入0. 1摩爾/升的乙酸胺溶液和氘化的內(nèi)標(biāo)物，振搖萃取30min，過濾，濾液用于LC-MS/MS 分析，分析時(shí)間僅為8min左右。該法具有以下特點(diǎn)①樣品處理量小，步驟簡單，不需純化， 處理時(shí)間短；②檢測限比氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法低，靈敏度高；③分析時(shí)間短，樣品分析量大；4)性能穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。但目前的LC-MS/MS法由于采用的液相色譜柱存在四種煙草特有亞硝胺(TSNAs)分離效果不理想、使用的流動(dòng)相及梯度洗脫導(dǎo)致分析峰發(fā)叉、嚴(yán)重拖尾及噪音偏高等缺點(diǎn)。因此研究建立一種快速、準(zhǔn)確、分離效果好、靈敏度高、重現(xiàn)性佳的卷煙主流煙氣中四種煙草特有亞硝胺(TSNAs)含量的檢測方法，仍然是煙草行業(yè)當(dāng)前的一項(xiàng)迫切任務(wù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種前處理簡單、分離效果好、樣品分析時(shí)間短、檢測準(zhǔn)確性高的卷煙主流煙氣中四種煙草特有亞硝胺(TSNAs)含量的測定方法。一種卷煙主流煙氣中四種煙草特有亞硝胺含量的測定方法利用玻璃纖維濾片捕集卷煙主流煙氣，用含內(nèi)標(biāo)、甲醇和乙酸銨的水溶液萃取，其中甲醇與水的體積比為 0-1 15-20，加入的乙酸銨濃度為0.08-0. 12摩爾/升；四種內(nèi)標(biāo)物的濃度各為3-lOng/ mL ；萃取液過濾后直接利用高效液相色譜-質(zhì)譜儀對卷煙主流煙氣中四種煙草特有亞硝胺的含量進(jìn)行檢測；所述四種煙草特有亞硝胺為N-亞硝基去甲基煙堿(NNN)、N-亞硝基假木賊堿(NAB)、N-亞硝基新煙草堿(NAT)、4-(N-甲基-N-亞硝胺)_1_(3_吡啶基)_ 丁酮 (NNK)；所述高效液相色譜儀所采用的液相色譜柱為Atlantis dC18色譜柱，所述高效液相色譜儀的其它參數(shù)為進(jìn)樣量1-10微升；流速0·1-0. 3ml/min ；柱溫30-70°C;流動(dòng)相A為乙酸銨甲醇水溶液，其中甲醇與水的體積比為0-1 15-20，乙酸銨濃度為3-8毫摩爾/升；流動(dòng)相B為甲醇；梯度洗脫程序0-3min洗脫液為體積百分含量85% -95 %的A與5_15 %的B ；3-8min40% -60%的 A :40-60%的 B ；8min 以上 85% -95%的 A 與 5-15%的 B ；所述質(zhì)譜儀的檢測參數(shù)為離子化模式電噴霧(ESI)；掃描模式正離子；霧化氣Nebulizer Gas (NEB) :7. 00-9. 00 ；氣簾氣Curtain Gas (CUR) :7. 00-9. 00 ；碰撞氣Collision Gas (CAD) :6. 00-8. 00 ；離子源噴射電壓IonSpray Voltage(IS) :5000. 00-5500. 00 ；離子源溫度 Temperature (TEM) :380. 00-420. 00。所述四種煙草特有亞硝胺內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)品為四氘代-N-亞硝基去甲基煙堿 (d4-NNN)、四氘代-N-亞硝基假木賊堿(d4-NAB)、四氘代-N-亞硝基新煙草堿(d4_NAT)、四氘代-4- (N-甲基-N-亞硝胺)-1-(3-吡啶基)-丁酮(d4-NNK)。所述四種煙草特有亞硝胺被測物及各自內(nèi)標(biāo)物的檢測參數(shù)如下
被測物分子離子Qi mass (amu) 碎片離子Q3 mass (amu) 碰撞能量CE (ν)
NNN NNK NAB NAT d4-NNN d4-NNK d4-NAB d4-NAT
178. 0-178.4 208. 0-208. 4
192.0-192. 4 189. 9-190. 3 182. 0-182. 4 212. 0-212. 4 196. 0-196. 4
193.9-194. 3
147. 8-148. 2 122. 0-122. 4 161. 8-162. 2 159. 8-160. 2 152. 0-152. 4 125. 8-126. 2 166. 0-166. 4 83. 0-83. 4
14-16 16-18 14-16
14-16
15-17
16-18 16-18 39-41①標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制分別準(zhǔn)確稱取四種煙草特有亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品，混合用甲醇溶解、定容，配制成濃度各為0. 8-1. 2mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液；②內(nèi)標(biāo)儲備液的配制分別準(zhǔn)確稱取四種煙草特有亞硝胺氘代內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)品，混合用甲醇溶解，定容，配制成濃度各為0. 8-1. 2mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備液；檢測時(shí)將標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋后配制為7-8個(gè)不同濃度梯度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；濃度在 0-100ng/mL 范圍內(nèi)。卷煙主流煙氣樣品前處理將捕集有卷煙樣品主流煙氣的玻璃纖維濾片放置于 50mL磨口帶塞的錐形瓶中，加10-15mL萃取液，機(jī)械振蕩20_40min后取0. 8-1. 2mL萃取液， 采用0. 22 μ m水相濾膜過濾后待分析用。利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀對系列標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行檢測，將得到的四種煙草特有亞硝胺的色譜峰面積與相對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)物峰面積比對，分別繪制四種煙草特有亞硝胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到回歸方程，然后在相同條件下對樣品進(jìn)行檢測，將得到的待測四種煙草特有亞硝胺的色譜峰面積帶入相應(yīng)的回歸方程中，即可得到樣品中相應(yīng)四種煙草特有亞硝胺的含量。
所述卷煙主流煙氣收集時(shí)對卷煙的抽吸的步驟及條件為將選取的煙支和玻璃纖維濾片在22士 1°C、相對濕度60士2%條件下平衡48小時(shí)，然后在該條件下使用吸煙機(jī)對卷煙進(jìn)行抽吸，用玻璃纖維濾片捕集卷煙煙氣，每口抽吸2秒，抽吸體積35mL，每口間隔58秒， 每組抽吸4-5支卷煙。本發(fā)明提供的測定方法克服了現(xiàn)有通用的高效液相色譜-熱能分析儀(LC-TEA) 檢測方法中存在的前處理步驟煩瑣、每個(gè)樣品分析時(shí)間長、檢測靈敏度低等缺點(diǎn)。目前已有的LC-MS/MS測定方法存在四種煙草特有亞硝胺(TSNAs)分離效果不理想、樣品分析峰發(fā)叉、嚴(yán)重拖尾及噪音偏高等缺點(diǎn)，本發(fā)明采用了新的液相色譜柱、流動(dòng)相及梯度洗脫程序，使得四種煙草特有亞硝胺(TSNAs)得到了完全分離，因此提高了色譜分離的選擇性、分辨率和靈敏度。


圖1為標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖。圖2為標(biāo)準(zhǔn)溶液(含內(nèi)標(biāo)物)的色譜圖。圖3為某牌號卷煙主流煙氣中四種煙草特有亞硝胺(含內(nèi)標(biāo)物)的色譜圖。圖中標(biāo)記，1、NNN, 2、NNK, 3、NAT, 4、NAB, 5、(d4_NNN)、6、(d4_NNK)，7、(d4_NAT)、8、 (d4-NAB)。
具體實(shí)施例方式以下對本發(fā)明的卷煙主流煙氣中四種煙草特有亞硝胺(TSNAs)含量的測定方法進(jìn)行進(jìn)一步的說明，而不會限制本發(fā)明。實(shí)施例11、儀器和試劑美國Applied Biosystems公司API 3000型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(Turbo IonSpray)以及Analyst 1. 4系統(tǒng)軟件；美國Agilent公司1100型高效液相色譜儀，帶自動(dòng)進(jìn)樣器和恒溫箱；英國Filtrona公司450型20通道吸煙機(jī)；電子天平(感量0. Img)、回旋可調(diào)機(jī)械振蕩器。甲醇(色譜純)，乙酸銨(色譜純)，去離子水；四種煙草特有亞硝胺NNN、NNK、NAB、 NAT的標(biāo)準(zhǔn)品，純度均彡98% ；對應(yīng)的四種氘代內(nèi)標(biāo)物d4-NNN、d4_NNK、d4_NAB、d4_NAT的標(biāo)準(zhǔn)品，純度均彡99%。2、溶液的配制標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制在50mL燒杯中分別準(zhǔn)確稱取約IOOmg左右的NNN、NNK, NAB、 NAT標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)確至0. OOOlg,加入約30mL甲醇完全溶解后，轉(zhuǎn)移至IOOmL容量瓶中，用少量甲醇洗滌燒杯內(nèi)壁3-5次，洗滌液一同轉(zhuǎn)移至IOOmL容量瓶中，最后用甲醇定容至刻度。內(nèi)標(biāo)儲備液的配制在50mL燒杯中分別準(zhǔn)確稱取約IOOmg左右的d4-NNN、d4_NNK、 d4-NAB、d4-NAT標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)確至0. OOOlg,加入約30mL甲醇完全溶解后，轉(zhuǎn)移至IOOmL容量瓶中，用少量甲醇洗滌燒杯內(nèi)壁3-5次，洗滌液一同轉(zhuǎn)移至IOOmL容量瓶中，最后用甲醇定容至刻度。濾片萃取液向950mL水和50mL甲醇混合液中加入7. 7g乙酸銨和5 μ L內(nèi)標(biāo)儲備液，完全溶解后混勻；濾片萃取液即配即用。一級標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確移取50 μ L標(biāo)準(zhǔn)儲備液至IOOmL容量瓶中，用濾片萃取液定容稀釋至刻度。該溶液須即配即用。系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別準(zhǔn)確移取0. 02mL、0. ImL,0. 5mL、l. OmL,2. OmL,5. OmL、
10. OmL 一級標(biāo)準(zhǔn)溶液至50mL容量瓶中，用濾片萃取液定容稀釋至刻度得到7個(gè)不同系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次將此系列標(biāo)準(zhǔn)溶液以及濾片萃取液進(jìn)行LC-MS/MS分析檢測，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。3、樣品的收集及前處理卷煙的抽吸將卷煙在22士 1°C、相對濕度60士2%條件下平衡48小時(shí)，然后在該條件下使用吸煙機(jī)對卷煙進(jìn)行抽吸，使抽吸的主流煙氣通過玻璃纖維濾片進(jìn)行捕集。每口抽吸2秒，抽吸體積35mL，每口間隔58秒，每組抽吸4_5支卷煙。樣品萃取取出捕集有主流煙氣粒相物的玻璃纖維濾片，轉(zhuǎn)移至50mL錐形瓶中， 準(zhǔn)確加入IOmL濾片萃取液，機(jī)械振蕩30min后取適量(約0. 8-1. 2mL)萃取液經(jīng)0. 22 μ m 水相濾膜過濾后，移到2mL色譜瓶中，即可進(jìn)行LC-MS/MS分析。4、檢測高效液相色譜儀條件液才目色譜柱Waters Atlantis dC18 3 μ m 2. IX 150mm Column。進(jìn)樣量5微升；流速0. 2ml/min ；柱溫60°C； 流動(dòng)相A 向950mL水和50mL甲醇混合液中加入0. 4g乙酸銨，完全溶解后混勻。流動(dòng)相B為甲醇，梯度洗脫程序0-;3min洗脫液為體積百分含量90%的A與10%的B ；3-8min50% 的A與50%的B ;8-12min以上90%的A與10%的B;串聯(lián)質(zhì)譜儀條件參數(shù)離子化模式電噴霧(ESI)；掃描模式正離子；霧化氣Nebulizer Gas (NEB) :8.00;氣簾氣Curtain Gas (CUR) :8. 00 ；碰撞氣Collision Gas (CAD) :7. 00 ；離子源噴射電壓IonSpray Voltage(IS) :5500. 00 ；離子源溫度 Temperature (TEM) :400. 00 ；所述四種煙草特有亞硝胺(TSNAs)被測物及各自內(nèi)標(biāo)物的主要檢測參數(shù)如下。被測物分子離子Qi ιBass(amu)碎片離子Q3mass(amu)碰撞能量CENNN178.2148.,015NNK208.2122.,217NAT190.1160.,015NAB192.2162.,015d4-NNN182.2152.,216d4-NNK212.2126.,017d4-NAB194.183.240d4-NAT196.2166.,217分析檢測步驟首先利用高效液相色譜-質(zhì)譜儀(LC-MS/MQ對系列標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行檢測，將得到的四種煙草特有亞硝胺(TSNAs)的色譜峰面積與相對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)物峰面積比對分別繪制四種煙草特有亞硝胺(TSNAs)的校正曲線，計(jì)算得到校正曲線的回歸方程， 四種煙草特有亞硝胺(TSNAs)標(biāo)準(zhǔn)樣品的檢測結(jié)果如下表1所示。表1、四種煙草特有亞硝胺(TSNAs)標(biāo)準(zhǔn)樣品的檢測結(jié)果
被測物回歸方程相關(guān)系數(shù)r
NNN y = 0. 0858x + 0.075 0.9999 NNK y = 0. 0342x + 0. 0158 0. 9999 NAT y = 0. 639x + 0. 112 0.9999
NAB y = 0. 0496x + 0. 0489 0. 9999卷煙樣品的檢測在相同條件下對樣品進(jìn)行檢測，將樣品中四種煙草特有亞硝胺 (TSNAs)的色譜峰面積帶入相應(yīng)的回歸方程中，即可得到樣品中相應(yīng)四種煙草特有亞硝胺 (TSNAs)的含量。圖1為標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖。從圖中可看出，采用本發(fā)明的檢測方法對四種煙草特有亞硝胺(TSNAs)具有很好的分離效果。圖2為標(biāo)準(zhǔn)溶液(含內(nèi)標(biāo)物)的色譜圖。圖3為某牌號卷煙樣品的色譜圖，從圖中亦可看出四種煙草特有亞硝胺均實(shí)現(xiàn)了基線分離，提高了定量檢測的準(zhǔn)確性。5、本發(fā)明測定方法的精密度(n = 5)、回收率和檢測限如表2所示。表2.方法的精密度、回收率和檢測限結(jié)果被測物變異系數(shù)RSD(%) 回收率(％)檢出限(ng/mL) 檢測限(ng/ml)
NNN4. 199. 10.020.08
NNK3.898.60.030.10
NAT3. 296.80.010.04
NAB4.695. 70.040.14
6、含量的計(jì)算每支卷煙主流煙氣中四種煙草特有亞硝胺(TSNAs)的測定結(jié)果，按照下列公式計(jì)算q = SX V/n式中q為每支卷煙主流煙氣中煙草特有亞硝胺(TSNAs)含量的檢測值，單位為納克每支(ng/cig)；S為卷煙主流煙氣樣品萃取液中煙草特有亞硝胺(TSNAs)的檢測濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)；V為卷煙主流煙氣樣品萃取液體積(mL)；η為每次測試抽吸卷煙的支數(shù)，單位為支(cig)。采用具體實(shí)施方式
中的測定方法，對試驗(yàn)卷煙樣品Α、B、C、D進(jìn)行檢測，試驗(yàn)樣品信息及其常規(guī)指標(biāo)如表3所示表3試驗(yàn)樣品信息及其常規(guī)指標(biāo)檢測數(shù)據(jù)
樣品卷煙煙支重量吸阻總粒相物水份煙氣煙堿量焦油量抽吸U數(shù)CO編號類型(g/支)(Pa)(mg/支)(mg/支)(mg/支)(mg/支)(門/支)(mg/支)A烤煙型0. 905110012. 521. 250. 9510. 327. 112. 36B烤煙型0. 905105515. 731. 201. 1013. 437. 214. 50C混合型0. 905101010. 031. 180. 758. 106. 710. 30D混合型0. 915109012. 381. 221. 0610. 106. 912. 30
試驗(yàn)樣品卷煙主流煙氣中四種煙草特有亞硝胺(TSNAs)含量的測定采用本發(fā)明
方法，測定結(jié)果如表4所示
權(quán)利要求
1.一種卷煙主流煙氣中四種煙草特有亞硝胺含量的測定方法，其特征在于利用玻璃纖維濾片捕集卷煙主流煙氣，用含內(nèi)標(biāo)、甲醇和乙酸銨的水溶液萃取，其中甲醇與水的體積比為0-1 15-20，加入的乙酸銨濃度為0.08-0. 12摩爾/升；四種內(nèi)標(biāo)物的濃度各為 3-lOng/mL;萃取液過濾后直接利用高效液相色譜-質(zhì)譜儀對卷煙主流煙氣中四種煙草特有亞硝胺的含量進(jìn)行檢測；所述四種煙草特有亞硝胺包括N-亞硝基去甲基煙堿、N-亞硝基假木賊堿、N-亞硝基新煙草堿、4-(N-甲基-N-亞硝胺)-1-(3-吡啶基)_ 丁酮。所述高效液相色譜儀所采用的液相色譜柱為Atlantis dC18色譜柱，所述高效液相色譜儀的其它參數(shù)為 進(jìn)樣量1-10微升； 流速0. 1-0. 3ml/min ； 柱溫:30-70 0C ；流動(dòng)相A為乙酸銨甲醇水溶液，其中甲醇與水的體積比為0-1 15-20，乙酸銨濃度為 3-8毫摩爾/升；流動(dòng)相B為甲醇；梯度洗脫程序0-3min洗脫液為體積百分含量85% -95%的A與5-15%的B ； 3-8min40% -60%的 A :40-60%的 B ；8min 以上 85% -95%的 A 與 5-15%的 B。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于 所述質(zhì)譜儀的檢測參數(shù)為離子化模式電噴霧；掃描模式正離子；霧化氣7. 00-9. 00 ；氣簾氣7. 00-9. 00 ；碰撞氣6. 00-8. 00 ；離子源噴射電壓5000. 00-5500. 00 ；離子源溫度380. 00-420. 00。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于所述四種煙草特有亞硝胺內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)品為四氘代-N-亞硝基去甲基煙堿、四氘代-N-亞硝基假木賊堿、四氘代-N-亞硝基新煙草堿、四氘代-4-(N-甲基-N-亞硝胺)-1-(3-吡啶基)_ 丁酮。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的測定方法，其特征在于所述四種煙草特有亞硝胺被測物及各自內(nèi)標(biāo)物的檢測參數(shù)如下
5.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的測定方法，其特征在于①標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制分別準(zhǔn)確稱取四種煙草特有亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品，混合用甲醇溶解、定容，配制成濃度各為0. 8-1. 2mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液；②內(nèi)標(biāo)儲備液的配制分別準(zhǔn)確稱取四種煙草特有亞硝胺氘代內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)品，混合用甲醇溶解、定容，配制成濃度各為0. 8-1. 2mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備液；
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的測定方法，其特征在于檢測時(shí)將標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋后配制為7-8個(gè)不同濃度梯度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；濃度在 0-100ng/mL 范圍內(nèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于卷煙主流煙氣樣品前處理將捕集有卷煙樣品主流煙氣的玻璃纖維濾片放置于50mL 磨口帶塞的錐形瓶中，加10-15mL萃取液，機(jī)械振蕩20-40min后取0. 8-1. 2mL萃取液，過濾后待分析用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的測定方法，其特征在于所述濾片萃取后過濾是采用0.22 μ m 水相濾膜過濾。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀對系列標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行檢測，將得到的四種煙草特有亞硝胺的色譜峰面積與相對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)物峰面積比對，分別繪制四種煙草特有亞硝胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到回歸方程，然后在相同條件下對樣品進(jìn)行檢測，將得到的待測四種煙草特有亞硝胺的色譜峰面積帶入相應(yīng)的回歸方程中，即可得到樣品中相應(yīng)四種煙草特有亞硝胺的含量。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于所述卷煙主流煙氣收集時(shí)對卷煙的抽吸的步驟及條件為將選取的煙支和玻璃纖維濾片在22士 1°C、相對濕度60士2%條件下平衡48小時(shí)，然后在該條件下使用吸煙機(jī)對卷煙進(jìn)行抽吸，用玻璃纖維濾片捕集卷煙煙氣，每口抽吸2秒，抽吸體積35mL，每口間隔58秒，每組抽吸4-5支卷煙。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種測定卷煙主流煙氣中四種煙草特有亞硝胺含量的方法，該方法是利用玻璃纖維濾片捕集卷煙主流煙氣中的煙草特有亞硝胺，用含內(nèi)標(biāo)、甲醇和乙酸銨的水溶液萃取，萃取液過濾后直接利用高效液相色譜-質(zhì)譜儀(LC-MS/MS)對卷煙主流煙氣中四種煙草特有亞硝胺(TSNAs)的含量進(jìn)行檢測。本發(fā)明提供的測定方法采用新的液相色譜柱、流動(dòng)相及梯度洗脫程序后使得四種煙草特有亞硝胺(TSNAs)得到了完全分離，因此提高了色譜分離的選擇性、分辨率和靈敏度。該方法具有前處理簡單、分離效果好、樣品分析時(shí)間短、檢測靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了對卷煙主流煙氣中煙草特有亞硝胺(TSNAs)的快速、準(zhǔn)確測定。
文檔編號G01N30/88GK102353741SQ20111024645
公開日2012年2月15日 申請日期2011年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月25日
發(fā)明者丁時(shí)超, 劉鋒, 唐麗云, 蔣臘梅, 郭紫明, 錢曉春 申請人:湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司