專利名稱：肌酸激酶同工酶(ck-mb)定量測(cè)定試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測(cè)定血清的試劑盒及其測(cè)試方法，尤其是涉及測(cè)定人血清中肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量的試劑盒及其測(cè)試方法
背景技術(shù)：
人類肌酸激酶同工酶分子量是85745。CK-MB主要分布于心肌中。當(dāng)心肌損傷后，CK-MB釋放到血液中，3-8h后開始升高，可持續(xù)3-5天。肌鈣蛋白，肌紅蛋白，肌酸激酶同工酶這三項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)能今早檢測(cè)出心肌是否受損。CK是由M和B亞單位組成的二聚體， 兩種不同的亞基組成三種同工酶。CK-BB(CKl)主要存于腦組織CK-MB(CK2)主要存于心肌 CK-MM(CK3)主要存于骨骼肌組織此外在線粒體中還存在一種同工酶(CK-MiMi)。心肌不同部位CK-MB含量也不盡相同，前壁>后壁，右心室>左心室，所以不同部位AMI時(shí)MB的釋放量不僅與梗塞面積、程度有關(guān)，也和梗塞部位有關(guān)。CK-MB是診斷急性心肌梗死最有價(jià)值酶學(xué)生化指標(biāo)。(1)通常血漿中的CK-MB來自心肌，若患者具有CK-MB活性升高和下降的序列性變化，且峰值超過參考值上限2倍，又無其他原因可解釋時(shí)，應(yīng)考慮AMI。CK-MB質(zhì)量用于胸痛發(fā)作3小時(shí)后診斷AMI陽性率可達(dá) 50% .6小時(shí)的診斷陽性率可達(dá)到80% . (2)AMI發(fā)作后如未進(jìn)行溶栓治療，CK-MB通常在 3 8小時(shí)出現(xiàn)升高，達(dá)峰時(shí)在發(fā)病后9 30小時(shí)，于48 72小時(shí)恢復(fù)至正常水平。與總 CK測(cè)定比較，CK-MB的峰時(shí)稍有提前，且消失也較快。(3)以血清CK-MB水平評(píng)價(jià)AMI的梗塞面積大小存在一定的爭(zhēng)論，一般認(rèn)為，梗塞范圍較小者，CK-MB達(dá)峰時(shí)間較早，恢復(fù)正常時(shí)間較短。(4)溶栓治療時(shí)，CK-MB早期升高及短時(shí)間內(nèi)達(dá)峰是AMI的征兆。2.關(guān)于不穩(wěn)定性心絞痛(UAP)當(dāng)心肌缺血時(shí)CK-MB常不增高，故UAP患者大多數(shù)無CK-MB增高，即便增高也不超過正常上限的2倍。3. CK-MB并不對(duì)心肌完全特異，在骨骼肌中也少量存在。過去以放免為代表的肌酸激酶同工酶(CK-MB)測(cè)定試劑盒受方法學(xué)的限制，其靈敏度和抗干擾能力嚴(yán)重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市場(chǎng)，目前應(yīng)用較多的為酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)和化學(xué)發(fā)光技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)興起于上個(gè)世紀(jì)80年代是繼酶聯(lián)免疫技術(shù)和放免技術(shù)之后發(fā)展起來的新興技術(shù)，由于其高靈敏度、高特異性，同時(shí)方法簡(jiǎn)便、快速，標(biāo)記結(jié)合物穩(wěn)定，無放射性同位素?fù)p傷和污染等特點(diǎn)，在近些年得到了飛速發(fā)展。磁微粒分離酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)是一種以磁性微粒為固相分離載體，將免疫磁微粒分離技術(shù)與酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合而建立的一種新型免疫檢測(cè)方法。傳統(tǒng)ELISA方法， 抗原、抗體的結(jié)合反應(yīng)是在固相(ELISA板反應(yīng)孔)表面進(jìn)行的，而磁微粒分離酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，抗原、抗體的結(jié)合反應(yīng)也在近似液相的條件下進(jìn)行，因而反應(yīng)快速、徹底。與傳統(tǒng) ELISA相比具有靈敏度高，檢測(cè)用時(shí)少的優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題在于提供一種肌酸激酶同工酶(CK-MB)定量測(cè)定試劑盒及其檢測(cè)方法，采用該試劑盒進(jìn)行CK-MB檢測(cè)具有較高的靈敏度和特異性，和更短的獲得檢測(cè)結(jié)果的時(shí)間和更簡(jiǎn)便的操作方式。本發(fā)明提供了一種肌酸 激酶同工酶(CK-MB)的定量測(cè)定試劑盒，其包含的試劑有 CK-MB磁分離試劑，酶反應(yīng)物，反應(yīng)增強(qiáng)劑，稀釋液，校準(zhǔn)品、質(zhì)控品，清洗液濃縮液以及底物溶液。所述的磁分離試劑含有標(biāo)記有抗CK-MB單克隆抗體的磁性微球。所述的酶反應(yīng)物是含有堿性磷酸酶標(biāo)記的抗CK-MB單克隆抗體。所述的反應(yīng)增強(qiáng)劑是含有Tris的緩沖液。所述稀釋液是含有BSA溶液。所述的校準(zhǔn)品及質(zhì)控品是含有一定量的CK-MB抗原的BSA蛋白溶液。所述清洗液濃縮液是含有TWEEN-20和Proclin-300的緩沖液。所述的底物溶液為酶促化學(xué)發(fā)光底物溶液。本發(fā)明肌酸激酶同工酶(CK-MB)的定量測(cè)定試劑盒的制備方法，包括下述步驟第一步磁分離試劑的制備過程一、磁珠緩沖液配制操作步驟，配制IL 1、稱取 TRIS 4. 58g 和 NaC16. 81g 于 IL 容器中，稱取 0. 96g TWEEN-20 于 20ml 容器中加適量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；2、用移液器將Proclin-300量取0. 2ml于IOml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中，然后在上述IL容器中加入800ml純化水，充分?jǐn)嚢瑁?、調(diào)節(jié)PH計(jì)測(cè)量其PH值，調(diào)PH，控制PH在7. 95-8. 05之間；4、稱取BSA 3g倒入上述IL容器中；5、最后定容至1000ml，用0. 2um濾器過濾；過濾完后貼好標(biāo)簽于2_8°C冷庫貯存。二、磁分離試劑的制備過程1、將1. Omg辛二酸二琥珀酰亞胺酯溶于50ul DMSO中，取2mg抗CK-MB單克隆抗體溶于PH 9. 5的0. lmol/L PB緩沖液中至總體積為Iml ；2、確定辛二酸二琥珀酰亞胺酯的投入量，用移液槍吸取辛二酸二琥珀酰亞胺酯加入到步驟1的抗體溶液中，置室溫90min ；3、將步驟2抗體溶液加入到Centricon-10濃縮管中然后放入到高速冷凍離心機(jī)中在3000g下濃縮30min至體積為0. 5ml ；4、取0. 5ml磁珠，加入5ml反應(yīng)杯中，放入專用試管架，經(jīng)磁鐵吸附2分鐘后吸取
上清；5、每次加入1. 5ml PH9. 5 0. lmol/L PB,混勻30秒，上架，去上清，重復(fù)操作3次； 將步驟4獲得的抗體溶液加入到上述磁珠中，混勻后室溫反應(yīng)4小時(shí)；6、加入 0. 3ml lmol/L 的 TRIS 溶液 37V 15 分鐘；7、每次加入1. 5ml PH 7. 2 0. lmol/L PB清洗已經(jīng)標(biāo)記的磁珠，混勻30秒，上架，
去上清，重復(fù)操作3次；8、用IOOml磁珠保存液將磁珠轉(zhuǎn)入125ml玻璃瓶，即為0. 05%的CK-MB磁分離試劑；磁珠保存液配方為0. 1% BSA, 0. 05%吐溫-20，0. 02% NaN3，20%乙醇，4°C保存。9、將步驟9獲得的磁分離試劑用磁珠緩沖液按照1 1的比例混勻，即得本發(fā)明試劑盒中磁分離試劑。
第二步酶反應(yīng)物制備過程 一、酶反應(yīng)物稀釋液配制操作步驟，配制IL 1、取 Tris 6. 06g、NaCl 13. 0g、Zncl2 0. 05g、Proclin-300 0. 2ml 禾口 MgCl2 0. 05g 于燒瓶中，然后在燒瓶中加入800ml純化水，充分?jǐn)嚢瑁乖噭┩耆芙猓?、調(diào) PH，控制 PH 在 7. 35-7. 45 范圍內(nèi)；3、稱取BSA 3g倒入上述燒杯中；4、最后定容至1000ml，用0. 2um濾器過濾即得。二、堿性磷酸酶ALP與抗CK-MB單克隆抗體的偶聯(lián)1、取IOmgALP加入5ml生理鹽水中，加入到濃縮管中，3000RPM離心20分鐘，濃縮
至1毫升；2、向步驟1獲得濃縮液中加入0. 2ml的0. IM NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘，然后裝入透析袋中，用ImM PH4. 4的醋酸鈉緩沖液透析，4°C過夜，收集保留液；3、向步驟3獲得保留液中加入0. 2M PH9. 5碳酸鹽緩沖液，使PH升高到9. 0，然后立即加入2. 5mg抗CK-MB單克隆抗體，室溫避光輕輕攪拌2小時(shí)，再加入0. Iml的4mg/ml NaBH4溶液，混勻，置4°C下2小時(shí)；4、將上述液裝入透析袋中，對(duì)0. 15M PH7. 4PBS透析，4°C過夜，收集保留液；5、向步驟4獲得保留液中逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4°C 1小時(shí)，然后 3000rpm離心半小時(shí)，棄上清，沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于20ml的 0. 15M PH7. 4 的 PBS 中；6、將步驟5獲得的溶液裝入透析袋中，用0. 15M PH7. 4的PB緩沖鹽水透析5個(gè)小時(shí)去除銨離子，收集保留液后10，OOOrpm離心30分鐘去除沉淀，收集上清液，按照體積比為 1 100的比例添加IM MgCl2溶液，即得堿性磷酸酶(ALP)與CK-MB單克隆抗體的偶聯(lián)物， 最后將收集到的堿性磷酸酶(ALP)與CK-MB單克隆抗體的偶聯(lián)物用上述酶反應(yīng)物稀釋液以 1 1000的體積比混合均勻，即得酶反應(yīng)物。第三步反應(yīng)增強(qiáng)劑配制步驟，配制IL 1、稱取TRIS1. 56g和NaCl 4. 23g于IL容器中；用移液器將Proclin-300量取 0. 2ml于IOml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；2、用量筒量取800ml純化水于上述IL容器中，充分?jǐn)嚢?，直至完全溶解調(diào)PH，控制 PH 在 7. 35-7. 45 之間；3、稱取Mak33 0. 9g于上述IL容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0. 2um濾
器過濾ο第四步稀釋液配制步驟，配制IL 1、稱取 NaC19. Og 和 BSA 60g 于 IL 的容器中；2、用移液器將Proclin-300量取0. 5ml加IOml純化水溶解，倒入上述IL的容器中；3、最后定容1000ml，完全溶解后，用0. 2um濾器過濾，貼好標(biāo)簽于2_8°C冷庫貯存， 有效期為12個(gè)月。
第五 步校準(zhǔn)品和質(zhì)控品的配制校準(zhǔn)品濃度分別為l、3、10、50、100ng/ml ；質(zhì)控品濃度分別為3、50ng/ml。第六步清洗濃縮液配制步驟，配制IL 1、稱取 TRIS 12.54g 和 NaCl 325. 6g 于 IL 容器中；2、稱取5g Tween-20于IOOml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述IL容
器中；3、用移液器將Proclin-300量取0. 2ml于盛有IOml純化水的燒杯中完全溶解后， 倒入上述IL容器中；4、用量筒量取800ml純化水于上述IL容器中，充分?jǐn)嚢?，直至完全溶解?、調(diào)PH，控制其范圍在7. 35-7. 45之間；6、最后定容1000ml，完全溶解后用0. 2um濾器過濾即得。第七步底物溶液配制步驟，配制IL 1、稱取 TRIS 2.35g、NaCl 6. 41g、Na2SO3 0. 002g 和 Proclin-300 0.2ml 于 IL 燒杯中；2、用量筒量取600ml純化水于IL燒杯中，充分?jǐn)嚢?，直至完全溶解，調(diào)PH，控制其范圍在7. 95-8. 05之間；3、加入250ml Lumi-Phos 480后，用0. 2um濾器過濾收集濾液，用純化水定容至 1000ml，混勻后即得。本發(fā)明工作原理本品為夾心法化學(xué)發(fā)光免疫分析法與磁性微粒分離技術(shù)相結(jié)合的一種檢測(cè)方法。在標(biāo)本、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品中加入定量的酶標(biāo)CK-MB單抗、結(jié)合著磁性微粒的CK-MB單克隆抗體及穩(wěn)定增強(qiáng)劑。37°C孵育后，磁性微粒上結(jié)合的CK-MB單克隆抗體與酶標(biāo)單克隆抗體分別與CK-MB分子的不同表位結(jié)合，形成“三明治”結(jié)構(gòu)。在外加磁場(chǎng)中直接沉淀，不需離心即可分離。倒去上清液，清洗沉淀的復(fù)合物，然后加入酶促化學(xué)發(fā)光底物。 底物在酶作用下被催化裂解，形成不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)激發(fā)態(tài)中間體回到基態(tài)時(shí)便發(fā)出光子，形成發(fā)光反應(yīng)，即可使用發(fā)光儀檢測(cè)反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可算出樣品中的CK-MB含量。在檢測(cè)范圍內(nèi)，發(fā)光強(qiáng)度與樣本中的CK-MB濃度成正比。本發(fā)明的主要?jiǎng)?chuàng)新之處在于1、本發(fā)明試劑盒將化學(xué)發(fā)光技術(shù)與免疫磁微粒相結(jié)合，提供了一種接近均相的反應(yīng)體系，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明試劑盒具有更高的檢測(cè)靈敏度和特異性，并達(dá)到了較佳的性能參數(shù)。2、本發(fā)明公開了一種新的專用穩(wěn)定增強(qiáng)劑以及清洗液濃縮液，使得反應(yīng)過程更加穩(wěn)定可靠，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)靈敏有效，在提高產(chǎn)品性能的同時(shí)，并且大大降低了產(chǎn)品成本；3、試劑盒中的磁分離試劑，酶反應(yīng)物，穩(wěn)定增強(qiáng)劑，校準(zhǔn)品、質(zhì)控品，清洗液濃縮液、稀釋液以及底物溶液均是該反應(yīng)體系下的最優(yōu)配方，給該試劑盒的使用效期及檢測(cè)性能提供了有力保障。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1一、磁珠緩沖液配制操作規(guī)程配方見表1，以配制IL為例1、稱取 TRIS 4. 58g 和 NaC16. 81g 于 IL 容器中，稱取 0. 96g TWEEN-20 于 20ml 容器中加適量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；2、用移液器將Proclin-300量取0. 2ml于少量純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；然后在IL容器中加入800ml純化水，充分?jǐn)嚢瑁乖噭┩耆芙猓?、調(diào)節(jié)PH計(jì)測(cè)量其PH值；用HCl或NaOH調(diào)PH，測(cè)量其PH在7. 95-8. 05之間即符合要求；4、稱取BSA(牛血清白蛋白)3g倒入上述容器中；5、最后定容至1000ml，測(cè)PH值，范圍在7. 95-8. 05之間即符合要求，用0. 2um濾器過濾；過濾完后貼好標(biāo)簽于2_8°C冷庫貯存，磁珠緩沖液有效期為12個(gè)月；磁珠緩沖液表1
試劑IOOOral用量試劑級(jí)別
TRIS4.58g分析純
NaCl6.81g分析純
TWEEN-200.96g分析純
Proclin-3000.2ml/
加水至加至800ml,溶解混勻
"PH8. 0+0.05
加水至加至IOOOml
"BSA
驗(yàn)證 PH8. 0+0. 05
0. 2um濾器過濾二、磁分離試劑的制備過程ljfl.Omg DSS (辛二酸二琥珀酰亞胺酯)溶于50ul DMSO中，即濃度為20mg/ml ； 取2mg抗CK-MB單克隆抗體(天健生物制藥(天津)有限公司，濃度為41mg/ml)溶于PH 9. 5的0. lmol/L PB緩沖液中至總體積為Iml ；2、計(jì)算DSS的投入量，按照以下公式計(jì)算(抗體質(zhì)量/16000) XlOX 368/CDSS)，其中Cdss指代DSS的物質(zhì)的量濃度mol/L ；3、用移液槍吸取相應(yīng)體積的DSS加入到步驟1的抗體溶液中，置室溫90min ；4、將步驟3抗體溶液加入到Centricon-IO濃縮管中然后放入到sigma2_16k高速冷凍離心機(jī)中在3000g的離心力下濃縮約30min至體積為0. 5ml ；
5、取0. 5ml磁珠，磁珠濃度為0. 5g/ml，所述的磁珠直徑在0. 9 μ m之間，加入5ml
反應(yīng)杯中，放入專用試管架，經(jīng)磁鐵吸附2分鐘后吸取上清；6、每次加入1. 5ml PH9. 5 0. lmol/L PB,混勻30秒，上架，去上清，重復(fù)操作3次；
將步驟4獲得的抗體溶液加入到磁珠中，混勻后室溫反應(yīng)4小時(shí)，保持混勻狀態(tài)；7、加入0. 3ml lmol/L的TRIS溶液37度15分鐘，其中TRIS的加樣量為Img抗體
加 0. 15mlTRIS ；8、每次加入1. 5ml PH 7. 2 0. lmol/L PB清洗已經(jīng)標(biāo)記的磁珠，混勻30秒，上架，
去上清，重復(fù)操作3次；9、用IOOml磁珠保存液將磁珠轉(zhuǎn)入125ml玻璃瓶，即為0. 05%的CK-MB磁分離試
劑；磁珠保存液配方為0. 1% BSA, 0. 05%吐溫-20，0. 02% NaN3，20%乙醇，4°C保存。10、將步驟9獲得的磁分離試劑用磁珠緩沖液按照1 1的比例混勻；11、貼好標(biāo)簽于2_8°C冷庫貯存，磁分離試劑有效期為12個(gè)月；實(shí)施例2一、酶反應(yīng)物稀釋液配制操作規(guī)程配方見表2，以配制IL為例1、取 Tris 6.06g、NaCl 13. 0g、Zncl2 0. 05g、Proclin-300 0. 2ml 禾口 MgCl2 0. 05g
于燒瓶中；然后在燒瓶中加入800ml純化水，充分?jǐn)嚢瑁乖噭┩耆芙猓?、用HCl或NaOH調(diào)PH，測(cè)量使PH在7. 35-7. 45范圍內(nèi)；3、稱取BSA 3g倒入上述容器中；4、最后定容至1000ml，測(cè)PH值，范圍在7. 35-7. 45之間即符合要求，用0. 2um濾器
過濾；過濾完后，貼好標(biāo)簽于2-8°C冷庫貯存，有效期為12個(gè)月；酶反應(yīng)物稀釋液表權(quán)利要求
1.一種肌酸激酶同工酶CK-MB的定量測(cè)定試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含CK-MB磁分離試劑，酶反應(yīng)物，反應(yīng)增強(qiáng)劑，稀釋液，CK-MB校準(zhǔn)品、CK-MB質(zhì)控品，清洗液濃縮液以及底物溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的CK-MB磁分離試劑含有標(biāo)記有抗 CK-MB單克隆抗體的磁性微球；所述的酶反應(yīng)物是含有堿性磷酸酶標(biāo)記的抗CK-MB單克隆抗體；所述的反應(yīng)增強(qiáng)劑是含有Tris的緩沖液；所述稀釋液是含有BSA的溶液；所述的校準(zhǔn)品及質(zhì)控品是含有一定量的CK-MB抗原的BSA溶液；所述清洗液濃縮液是含有TWEEN-20和Proclin-300的緩沖液；所述的底物溶液為酶促化學(xué)發(fā)光底物溶液。
3.如權(quán)利要求1-2任其一所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中各組分按照如下制備方法制得一、磁分離試劑的制備過程一)、磁珠緩沖液配制操作步驟，配制IL·1、稱取TRIS 4. 58g 和 NaC16. 81g 于 IL 容器中，稱取 0. 96g TWEEN-20 于 20ml 容器中加適量水使其完全溶解后，倒入上述IL容器中；·2、用移液器將Proclin-300量取0.2ml于IOml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述 IL容器中，然后在上述IL容器中加入800ml純化水，充分?jǐn)嚢?；?、調(diào)節(jié)PH,控制PH在7.95-8. 05之間；·4、稱取BSA3g倒入上述IL容器中；·5、最后定容至1000ml，用0.2um濾器過濾即得；二)、磁分離試劑的制備過程·1、將1.Omg辛二酸二琥珀酰亞胺酯溶于50ul DMSO中，取2mg抗CK-MB單克隆抗體溶于PH 9. 5的0. lmol/L PB緩沖液中至總體積為Iml ；·2、用移液槍吸取上述辛二酸二琥珀酰亞胺酯加入到步驟1的抗體溶液中，置室溫 90min ；·3、將步驟2的溶液加入到濃縮管中，然后放入到高速冷凍離心機(jī)中在3000g下離心 30min 濃縮至 0. 5ml ；·4、取0.5ml磁珠，加入5ml反應(yīng)杯中，經(jīng)磁鐵吸附2分鐘后吸取上清，然后加入1. 5ml PH9. 50. lmol/L PB，混勻30秒，然后加入步驟3獲得的抗體溶液，混勻后室溫反應(yīng)4小時(shí)；·5、加入0.3ml lmol/L 的 TRIS 溶液 37°C 15 分鐘，然后加入 1. 5ml PH 7.2 0. lmol/L PB 清洗已經(jīng)標(biāo)記的磁珠，混勻30秒；·6、用IOOml磁珠保存液將磁珠轉(zhuǎn)入玻璃瓶；·7、將步驟6獲得的溶液與上述磁珠緩沖液按照1 1的體積比例混勻，即得權(quán)利要求 1或2所述試劑盒中的磁分離試劑；二、酶反應(yīng)物的制備過程一)、酶反應(yīng)物稀釋液配制操作步驟，配制IL ·1、取 Tris 6.06g、NaCl 13. Og^Zncl2 0. 05g,Proclin-300 0. 2ml 和 MgCl2 0. 05g 于燒瓶中，然后在燒瓶中加入800ml純化水，充分?jǐn)嚢瑁乖噭┩耆芙猓?2、調(diào)PH,控制PH在7.35-7. 45范圍內(nèi);.3、稱取BSA3g倒入上述燒杯中；.4、最后定容至1000ml，用0.2um濾器過濾即得；二)、堿性磷酸酶ALP與抗CK-MB單克隆抗體的偶聯(lián).1、取IOmgALP加入5ml生理鹽水中，加入到濃縮管中，3000RPM離心20分鐘，濃縮至1毫升；.2、向步驟1獲得濃縮液中加入0.2ml的0. IM NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘，然后裝入透析袋中，用ImM PH4. 4的醋酸鈉緩沖液透析，4°C過夜，收集保留液；.3、向步驟2獲得保留液中加入0.2M PH9. 5碳酸鹽緩沖液，使PH升高到9. 0，然后立即加入2. 5mg抗CK-MB單克隆抗體，攪拌2小時(shí)，再加入0. Iml的.4mg/ml NaBH4溶液，混勻， 置4°C下2小時(shí)；.4、將上述溶液裝入透析袋中，用0.15M PH7. 4PBS透析，4°C過夜，收集保留液；.5、向步驟4獲得保留液中逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4°C1小時(shí)，然后3000rpm離心半小時(shí)，棄上清，沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于20ml的.0. 15M PH7. 4的 PBS 中；.6、將步驟5獲得的溶液裝入透析袋中，用0.15M PH7. 4的PB緩沖液透析5個(gè)小時(shí)去除銨離子，收集保留液后10，OOOrpm離心30分鐘去除沉淀，收集上清液，按照體積比為 1 100的比例添加IM MgCl2溶液，即得堿性磷酸酶ALP與抗CK-MB單克隆抗體的偶聯(lián)物；將收集到的堿性磷酸酶ALP與抗CK-MB單克隆抗體的偶聯(lián)物用上述步驟一)獲得的酶反應(yīng)物稀釋液以1 1000的體積比混合均勻，即得酶反應(yīng)物。三、反應(yīng)增強(qiáng)劑的制備過程，配制IL.1、取TRIS1. 56g 和 NaCl 4. 23g 于 IL 容器中，取 0. 2ml Proclin-300 于 IOml 純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；.2、取800ml純化水于上述IL容器中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙猓{(diào)PH在7.35-7. 45之間；.3、稱取Mak330.9g于上述IL容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0. 2um濾器過濾即得；四、稀釋液的制備過程，配制IL:.1、稱取NaC19.Og和BSA 60g于IL的容器中；.2、取0.5ml Proclin-300加IOml純化水溶解，倒入上述IL的容器中；.3、最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um濾器過濾即得；五、CK-MB校準(zhǔn)品和CK-MB質(zhì)控品的配制CK-MB校準(zhǔn)品中CK-MB抗原的濃度分別為l、3、10、50、100ng/ml ；CK-MB質(zhì)控品中CK-MB 抗原的濃度分別為3、50ng/ml ；六、清洗液濃縮液的制備過程，配制IL.1、取TRIS 12. 54g 和 NaCl 325. 6g 于 IL 容器中；.2、取5gTween-20于IOOml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述IL容器中；.3、取0.2ml Proclin-300于盛有IOml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；.4、取800ml純化水于上述IL容器中，充分?jǐn)嚢瑁敝镣耆芙猓?5、調(diào)PH，控制其范圍在7.35-7. 45之間；.6、最后定容1000ml，完全溶解后用0.2um濾器過濾即得； 七、底物溶液的制備過程，配制IL .1、取TRIS 2. 35g、NaCl 6. 41g、Na2SO3 0. 002g 和 Proclin-300 0.2ml 于 IL 燒杯中；.2、取600ml純化水于IL燒杯中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙?，調(diào)PH在7.95-8. 05之間；.3、加入250mlLumi-Phos 480，用0. 2um濾器過濾收集濾液，用純化水定容至1000ml，混勻后即得。
4、如權(quán)利要求1-3任其一所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的使用方法如下.1)、加30μ 1 CK-MB校準(zhǔn)品、CK-MB質(zhì)控品、待測(cè)標(biāo)本至對(duì)應(yīng)試管底部；.2)、加30μ 1酶反應(yīng)物至每一試管中；.3)、加30μ 1反應(yīng)增強(qiáng)劑至每一試管中；.4)、加30μ 1磁分離試劑至每一試管中；.5)、用塑料薄膜覆蓋試管，多管混勻器輕輕振蕩試管架30s后，置37°C水浴30分鐘；.6)、然后放至磁分離器上，確保每支試管都與分離器表面接觸，沉淀2分鐘，倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液；.7)、清洗液濃縮液用純化水稀釋20倍后，加200μ 1稀釋后的清洗液至每一試管中，置多管混勻器上輕輕振蕩混勻30s ；.8)、加200μ 1底物溶液至試管中混勻3秒，發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)。
5、如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述待測(cè)標(biāo)本為高值HOOK樣本時(shí)，根據(jù)需要使用稀釋液對(duì)標(biāo)本進(jìn)行稀釋。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種肌酸激酶同工酶CK-MB的定量測(cè)定試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含CK-MB磁分離試劑，酶反應(yīng)物，反應(yīng)增強(qiáng)劑，稀釋液，CK-MB校準(zhǔn)品、CK-MB質(zhì)控品，清洗液濃縮液以及底物溶液。本發(fā)明還公開了該試劑盒的制備方法。本發(fā)明試劑盒將化學(xué)發(fā)光技術(shù)與免疫磁微粒相結(jié)合，提供了一種接近均相的反應(yīng)體系，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明試劑盒具有更高的檢測(cè)靈敏度和特異性，并達(dá)到了較佳的性能參數(shù)，并且大大降低了產(chǎn)品成本。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102435738SQ20111025748
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月31日
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