專利名稱：一種測定脂質(zhì)體藥物包封率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物分析領(lǐng)域，具體涉及一種測定脂質(zhì)體藥物包封率的方法。
背景技術(shù)：
脂質(zhì)體藥物指的是藥物包封于類脂質(zhì)雙分子層內(nèi)而形成的微型泡囊，具有優(yōu)良的生物相容性，對組織、細(xì)胞具有一定的靶向性，可激活機體自身的免疫功能，提高藥物的溶解度，改變藥物在體內(nèi)的分布，延緩藥物的釋放，從而起到提高藥物治療指數(shù)，降低藥物毒副作用。脂質(zhì)體藥物的包封率是包封于脂質(zhì)體中的藥物量占脂質(zhì)體系中藥物總量的百分t匕，是評價脂質(zhì)體制劑質(zhì)量好壞的最重要的指標(biāo)之一。脂質(zhì)體粒徑大小和分布均勻程度也與其密切有關(guān)，直接影響脂質(zhì)體在集體組織的行為和處置，是脂質(zhì)體能否發(fā)揮較普通制劑高效、低毒的關(guān)鍵。因此，研究脂質(zhì)體時，包封率是一個重要的考察項目。包封率的測定方法一般是先用一定的方法把未包封的游離藥物與脂質(zhì)體分離開并分別進(jìn)行測定，根據(jù)總投藥量計算得出，或分離后測定包封于脂質(zhì)體內(nèi)的藥物量與磷脂的比例，計算出藥脂比。常用的測定方法包括葡聚糖凝膠柱過濾法(分子篩法)、超濾膜過濾法、超速離心法、微型柱離心法和透析法等。透析法是把藥物放入具有一定截留分子量的透析袋中，再把透析袋置于比它體積大許多倍的透析介質(zhì)中，游離藥物順濃度梯度從透析袋內(nèi)滲透到透析袋外，而脂質(zhì)體由于粒徑較大而不能滲透到外部介質(zhì)里。然后在不同的時間測定介質(zhì)中的藥物濃度，直至外部介質(zhì)中的藥物濃度不變，則說明透析袋內(nèi)外游離藥物的濃度相同，達(dá)到平衡。此時的時間作為游離藥物透支平衡時間，測出此時介質(zhì)中的藥物濃度計算游離藥物的濃度，進(jìn)而計算出包封率。該方法中所用的透析袋價格比較便宜，且用量較少，因此可降低使用成本，但是對藥物的溶解度要求極為苛刻，對于難溶性藥物不適用，且耗時長，一般需5-24h，頻繁更換溶劑容易產(chǎn)生人為誤差，外部介質(zhì)對脂質(zhì)體周圍的游離藥物稀釋倍數(shù)較大，可能破壞脂質(zhì)體與游離藥物的動態(tài)平衡，使得包在脂質(zhì)體中的藥物滲漏出來，透析過程中由于脂質(zhì)體的不穩(wěn)定性也可能產(chǎn)生滲漏。為此，在中國專利申請CN101017164中公開了先在脂質(zhì)體混懸液中加入與脂質(zhì)雙分子層不發(fā)生相互作用的水溶性物質(zhì)如5-氟尿嘧啶或酚紅再進(jìn)行透析的改進(jìn)方法，雖然在一定程度上可以緩解脂質(zhì)體中藥物的滲漏，但是并不能解決透析法中的共性問題，如要求藥物具有一定的溶解度，透析袋對藥物及添加物質(zhì)的吸附，操作復(fù)雜，容易廣生人為誤差等。葡聚糖凝膠柱過濾法是利用分子大小差別進(jìn)行脂質(zhì)體與游離藥物分離的方法，但是該方法耗時長，人工裝柱誤差大導(dǎo)致相同樣品的測定重復(fù)性差，周圍環(huán)境的改變也會對結(jié)果的一致性產(chǎn)生影響，不適于分離大分子和粘稠體系，并且易造成堵柱、浪費填料等，增加了分析時間和使用成本。此外，由于葡聚糖凝膠柱法在分離脂質(zhì)體與游離藥物時洗脫液對脂質(zhì)體進(jìn)行了大量的稀釋，可能導(dǎo)致脂質(zhì)體的滲漏，從而使測定的包封率不準(zhǔn)確。針對上述缺陷，在中國專利CN100451646C中提出先通過離心去除葡聚糖微柱中的水，再將樣品加入微柱的頂部、離心，分離出脂質(zhì)體，再用洗脫液多次離心洗脫分離出游離的藥物。該方法的優(yōu)點是在最初的離心中已除去增加脂質(zhì)體體積的過量空白溶液，因此不經(jīng)稀釋即可重新得到脂質(zhì)體，但是該法是建立在脂質(zhì)體不被填充物物理滯留的假設(shè)之上，因此同樣不能真實準(zhǔn)確地反映出脂質(zhì)體制劑中實際的包封情況。此外，該方法難以證明在所述離心條件下被包封脂質(zhì)體與未包封游離藥物已得到充分且完全的分離，即所測包封率結(jié)果可能高于或低于實際真實結(jié)果。利用重力差的離心分離 法和離心超濾法雖然可在一定程度上縮短測定時間，但是其不能對脂質(zhì)體與外水相進(jìn)行準(zhǔn)確地分離，前者分離出來的外水相很可能有小單室脂質(zhì)體存在，導(dǎo)致測得的外水相濃度偏高，這將影響了測定結(jié)果的穩(wěn)定性，而且巨大的離心力會對藥物結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞，增加了測定誤差。因此，還有待開發(fā)出新的測定脂質(zhì)體藥物包封率的方法。

發(fā)明內(nèi)容
因此，為了克服了脂質(zhì)體包封率測定中普遍存在的對藥物選擇性高、無法驗證的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種測定脂質(zhì)體藥物包封率的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。本發(fā)明提供一種測定脂質(zhì)體藥物包封率的方法，所述方法采用高效液相色譜與分子排阻色譜相結(jié)合來測定脂質(zhì)體的包封率。優(yōu)選地，所述方法包括以下步驟1)采用高效液相色譜系統(tǒng)測定100 500μ I脂質(zhì)體藥物中的藥物濃度，記為Cg ；2)采用高效液相-分子排阻結(jié)合色譜系統(tǒng)分離出與步驟
1)等量的脂質(zhì)體藥物中的被包封部分和未包封部分；3)采用高效液相色譜系統(tǒng)測定步驟
2)中所分離的被包封部分的藥物濃度，記為Cilii；4)按以下公式計算包封率包封率=Cil封/C總 X 100%。優(yōu)選地，所述方法還包括以下步驟5)采用高效液相色譜系統(tǒng)測定步驟2)中所分離的未包封部分的藥物濃度，記為，按以下公式計算回收率回收率=(Cilii+C^ii)/C,6 X 100%。優(yōu)選地，所述步驟2)中采用高效液相-分子排阻結(jié)合色譜系統(tǒng)分離脂質(zhì)體藥物中的被包封部分時以水為流動相，分離脂質(zhì)體藥物中的未包封部分時以有機溶劑為流動相；優(yōu)選地，所述有機溶劑選自甲醇或乙腈或異丙醇中的一種或幾種。優(yōu)選地，所述脂質(zhì)體藥物為納米脂質(zhì)體制劑。優(yōu)選地，所述脂質(zhì)體藥物中所包封的藥物為疏水疏脂性藥物。優(yōu)選地，所述脂質(zhì)體藥物為兩性霉素B或制霉菌素。此外，本發(fā)明提供一種測定兩性霉素B脂質(zhì)體包封率的方法，所述方法采用上述方法來測定兩性霉素B脂質(zhì)體的包封率。優(yōu)選地，所述測定兩性霉素B脂質(zhì)體包封率的方法包括以下步驟1)采用高效液相色譜系統(tǒng)測定100 500 μ I兩性霉素B脂質(zhì)體中的兩性霉素B濃度，記為C,6，具體色譜條件為C18色譜柱，流動相為乙腈-水(7 3)，檢測波長405nm，流速lml/min;2)采用高效液相-分子排阻色譜系統(tǒng)分離與步驟I)等量的兩性霉素B脂質(zhì)體中的被包封部分和未包封部分，具體色譜條件為硅膠柱，流動相為水，檢測波長405nm，流速lml/min ；3)采用高效液相色譜系統(tǒng)分別測定步驟2)中所分離的被包封部分和未包封部分中兩性霉素B濃度，分別記為C^asi，具體色譜條件同步驟I) ；4)按以下公式計算包封率和/或回收率
包封率=C包封/C總X 100 % ;回收率=(C包封+C未包封)/C總X 100 %。本發(fā)明還提供一種測定制霉菌素脂質(zhì)體包封率的方法，所述方法采用上述方法來測定制霉菌素脂質(zhì)體的包封率。優(yōu)選地，所述測定制霉菌素脂質(zhì)體包封率的方法包括以下步驟1)采用高效液相色譜系統(tǒng)測定100 500 μ I制霉菌素脂質(zhì)體中的制霉菌素濃度，記為Cy具體色譜條件為C18色譜柱，流動相為乙腈-水(65 35)，檢測波長304nm，流速lml/min;2)采用高效液相-分子排阻色譜系統(tǒng)分離與步驟I)等量的制霉菌素脂質(zhì)體中的被包封部分和未包封部分，具體色譜條件為硅膠柱，流動相為水，檢測波長304nm，流速lml/min ；3)采用高效液相色譜系統(tǒng)分別測定步驟2)中所分離的被包封部分和未包封部分中制霉菌素濃度，分別記為，具體色譜條件同步驟I) ；4)按以下公式計算包封率和/或回收率包封
率=C包封/C總X 100 % ;回收率=(C包封+C未包封)/C總X 100 %。 在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供的測定方法采用高效分子排阻色譜測定含藥脂質(zhì)體的包封率，進(jìn)一步地采用高效液相-分子排阻色譜系統(tǒng)(HPLC-SEC)測定含藥脂質(zhì)體的包封率。所述方法包括如下步驟1)將高分子排阻硅膠柱與HPLC連接好后啟動該系統(tǒng)(記為HPLC-B系統(tǒng))，并用水作為流動相平衡系統(tǒng)；2)采用HPLC-A系統(tǒng)測定100 500 μ I制備脂質(zhì)體中藥物的總濃度，記為C,6 ；3)取與步驟2)中等量的脂質(zhì)體注入步驟I)中連接有高分子排阻硅膠柱的HPLC-B系統(tǒng)，觀察在線紫外檢測器，自含藥脂質(zhì)體開始出峰起接取流出液至量瓶中，然后采用上述HPLC-A系統(tǒng)測定所收集被包封脂質(zhì)體中藥物的濃度，記為Cilii ；4)同時更換流動相為有機相，接取后續(xù)流出液至量瓶中，采用上述HPLC-A系統(tǒng)測定所收集未包封藥物的濃度，記為；5)按以下公式計算包封率及回收率包封率=Cilii/C總X 100%;回收率=(C包封+( 包封)/C總X 100%。采用該方法測得的回收率應(yīng)為95% 105 %。此處所述HPLC-A系統(tǒng)是指高效液相色譜系統(tǒng)，HPLC-B系統(tǒng)是指高效液相-分子排阻結(jié)合色譜系統(tǒng)?？梢?，本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提出了一種使用高效分子排阻色譜法進(jìn)行包封率測定的方法，該方法使用商品化的高效液相-分子排阻結(jié)合色譜系統(tǒng)(HPLC-SEC)，從而能避免測定過程中因人工操作而帶來的誤差，保證了測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，且重現(xiàn)性好；此外，還能夠直觀地在線觀測被包封藥物脂質(zhì)體與未包封游離藥物的分離過程，一方面表明該方法專屬性好，同時也解決了現(xiàn)有技術(shù)中包封率測定方法中分離不夠直觀，僅能憑借間接指標(biāo)判斷分離終點的弊端。例如，采用葡聚糖凝膠微型凝膠柱法對疏水疏脂性脂質(zhì)體藥物進(jìn)行包封率的測定時，就難以證明在所述離心條件下，被包封的藥物脂質(zhì)體與未包封的游離藥物得到了完全且充分的分離，而本發(fā)明所采用的HPLC-SEC色譜系統(tǒng)通過采用在線檢測器能夠觀測被包封藥物脂質(zhì)體與未包封游離藥物的分離過程，從而確保了所測結(jié)果的科學(xué)性及準(zhǔn)確性。同時，由于采用的高分子排阻色譜柱的填料為一種親水性多孔性球形剛性硅膠，可以耐受甲醇等有機溶劑，由此克服了葡聚糖凝膠在有機溶劑中會發(fā)生性狀變化而導(dǎo)致分析方法難以驗證的弊端。綜上所述，本發(fā)明提供了一種測定脂質(zhì)體包封率的新方法，該方法可直觀準(zhǔn)確地對脂質(zhì)體與游離藥物進(jìn)行分離，克服了脂質(zhì)體包封率測定中普遍存在的對藥物選擇性高、無法驗證的缺陷，從而能更真實準(zhǔn)確地反映出其真實的包封情況，特別適用于納米脂質(zhì)體制劑，尤其是包封疏水疏脂性藥物的制劑。此外，該方法測定的包封率結(jié)果與給藥脂質(zhì)體后的體內(nèi)數(shù)據(jù)具有一致性，可用于體內(nèi)試驗的預(yù)測，進(jìn)一步降低了脂質(zhì)體開發(fā)的時間成本和經(jīng)濟(jì)成本。


以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方案，其中圖I為實施例I中被包封藥物脂質(zhì)體與未包封游離藥物的分離驗證，其中圖IA為被包封藥物脂質(zhì)體，圖IB為未包封游離藥物。圖2為實施例2中被包封藥物脂質(zhì)體與未包封游離藥物的分離驗證，其中圖2A為被包封藥物脂質(zhì)體，圖2B為未包封游離藥物。
具體實施例方式以下參照具體的實施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例I本實施例提供了采用本發(fā)明提供的方法測定兩性霉素B脂質(zhì)體的包封率。I)制備兩性霉素B脂質(zhì)體采用薄膜分散法制備兩性霉素B脂質(zhì)體。具體操作如下取兩性霉素B O. 5g，磷脂酰甘油O. Sg置于200ml燒杯中，加入氯仿-甲醇(I I)溶液使溶解，作為溶液A ;再取磷脂酰膽堿2. Og,膽固醇O. 5g及維生素E O. 5mg置于200ml燒杯中，加入氯仿-甲醇(I I)溶液使溶解，作為溶液B;將溶液A與溶液B混合后于60°C攪拌，再通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑形成脂質(zhì)干膜，之后加入PBS緩沖液(pH 6.0)水化脂質(zhì)干膜，最后用高壓均質(zhì)機對水化溶液進(jìn)行整粒，即得脂質(zhì)體成品，充氮氣后冷藏備用。2)測定脂質(zhì)體包封率具體操作如下(I)將高分子排阻硅膠柱(TSK-GEL G2000SW)與HPLC連接好后啟動該系統(tǒng)(記為HPLC-B系統(tǒng))，并用水作為流動相平衡系統(tǒng)。(2)采用HPLC-A系統(tǒng)測定100 μ I上述已制備脂質(zhì)體中兩性霉素B藥物的總濃度，記為C總。測定的具體色譜條件為所述HPLC系統(tǒng)為島津LC-20，色譜柱為Kromasil-C18，流動相為乙腈-水(7 3)，檢測波長405nm，流速lml/min。(3)再取100 μ I脂質(zhì)體注入上述連接有高分子排阻硅膠柱的HPLC-B系統(tǒng)，以水為流動相，流速lml/min，觀察在線紫外檢測器(觀測波長為405nm)，自兩性霉素B脂質(zhì)體開始出峰起接取流出液20ml至量瓶中，采用HPLC-A系統(tǒng)測定所收集被包封脂質(zhì)體中兩性霉素B藥物的濃度，記為Cilii，具體色譜條件同步驟(2)中測定C,6的條件；同時更換流動相為甲醇，接取80ml后續(xù)流出液至量瓶中，采用HPLC-A系統(tǒng)測定所收集未包封兩性霉素B藥物的濃度，記為，具體色譜條件同步驟⑵中測定C,6的條件。(4)按以下公式計算包封率及回收率包封率=C包封/C總X 100% ;回收率=(C包封+C未包封)/C總X 100%。
3)包封率測定結(jié)果對同一批脂質(zhì)體樣品(批號090412)進(jìn)行多次測定，其結(jié)果如表I所示，該批脂質(zhì)體樣品的平均包封率為99. 6%, RSD = O. 19% ;平均回收率為100. 6%, RSD = O. 25%。所測結(jié)果表明該包封率測定方法重現(xiàn)性好。表I包封率測定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種測定脂質(zhì)體藥物包封率的方法，其特征在于，所述方法采用高效液相色譜與分子排阻色譜相結(jié)合來測定脂質(zhì)體藥物的包封率。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 1)采用高效液相色譜系統(tǒng)測定100 500iil脂質(zhì)體藥物中的藥物濃度，記為C&； 2)采用高效液相_分子排阻結(jié)合色譜系統(tǒng)分離與步驟I)等量的脂質(zhì)體藥物中的被包封部分和未包封部分； 3)采用高效液相色譜系統(tǒng)測定步驟2)中所分離的被包封部分的藥物濃度，記為Cfia; 4)按以下公式計算包封率包封率=Cfia/C,e、X100%。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述方法還包括以下步驟 5)采用高效液相色譜系統(tǒng)測定步驟2)中所分離的未包封部分的藥物濃度，記為封，按以下公式計算回收率回收率=(C包封+C未包封)/C總X 100 。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中采用高效液相_分子排阻結(jié)合色譜系統(tǒng)分離脂質(zhì)體藥物中的被包封部分時以水為流動相，分離脂質(zhì)體藥物中的未包封部分時以有機溶劑為流動相；優(yōu)選地，所述有機溶劑選自甲醇或乙腈或異丙醇中的一種或幾種。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一項所述的方法，其特征在于，所述脂質(zhì)體藥物為納米脂質(zhì)體制劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一項所述的方法，其特征在于，所述脂質(zhì)體藥物中所包封的藥物為疏水疏脂性藥物；優(yōu)選地，所述藥物為兩性霉素B或制霉菌素。
7.一種測定兩性霉素B脂質(zhì)體包封率的方法，其特征在于，所述方法采用權(quán)利要求I至6中任一項所述方法來測定兩性霉素B脂質(zhì)體的包封率。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 1)采用高效液相色譜系統(tǒng)測定100 500Ul兩性霉素B脂質(zhì)體中的兩性霉素B濃度，記為C總； 2)采用高效液相_分子排阻結(jié)合色譜系統(tǒng)分離與步驟I)等量的兩性霉素B脂質(zhì)體中的被包封部分和未包封部分； 3)采用高效液相色譜系統(tǒng)分別測定步驟2)中所分離的被包封部分和未包封部分的兩性霉素B濃度，分別記為(_和； 4)按以下公式計算包封率和/或回收率 包封率=C包封/C總X 100% ； 回收率=(C包封+C未包封)/C總X 100 。
9.一種測定制霉菌素脂質(zhì)體包封率的方法，其特征在于，所述方法采用權(quán)利要求I至6中任一項所述方法來測定制霉菌素脂質(zhì)體的包封率。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 1)采用高效液相色譜系統(tǒng)測定100 500ill制霉菌素脂質(zhì)體中的兩性霉素B濃度，記為C總； 2)采用高效液相_分子排阻結(jié)合色譜系統(tǒng)分離與步驟I)等量的制霉菌素脂質(zhì)體中的被包封部分和未包封部分； 3)采用高效液相色譜系統(tǒng)分別測定步驟2)中所分離的被包封部分和未包封部分的制霉菌素濃度，分別記為 C包封和C未包封； 4)按以下公式計算包封率和/或回收率包封率=C包封/C總X 100% ； 回收率=(C包封+C未包封)/C總X 100 % ο
全文摘要
本發(fā)明提供一種測定脂質(zhì)體藥物包封率的方法。本發(fā)明提供的方法采用高效液相色譜與分子排阻色譜相結(jié)合來測定脂質(zhì)體藥物的包封率，特別適用于包封疏水疏脂性藥物的納米脂質(zhì)體制劑。本發(fā)明提供的方法解決了脂質(zhì)體包封率測定方法中重現(xiàn)性差、無法驗證的缺陷，同時體內(nèi)外測定的包封率相關(guān)性高，可用體外數(shù)據(jù)預(yù)測體內(nèi)數(shù)據(jù)。該方法還具有分離直觀、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確性好、可驗證、耗時短、實驗成本低的優(yōu)點，能夠更加真實準(zhǔn)確的反應(yīng)出脂質(zhì)體實際的包封情況。
文檔編號G01N30/88GK102980963SQ20111026356
公開日2013年3月20日 申請日期2011年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月7日
發(fā)明者劉紅星, 張揚, 張波, 趙焰平, 張偉強, 魏祥 申請人:北京泰德制藥股份有限公司