專利名稱：一種用于免疫組化過程質(zhì)量檢控的陽性參照物的制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于病理學領域，具體地，本發(fā)明涉及一種用于免疫組化過程質(zhì)量檢控的陽性參照物的制備方法。
背景技術：
免疫組織化學在生物醫(yī)學研究和診斷病例學中起著日益重要的作用。特別是從在上世紀90年代開始，隨著高溫抗原修復技術的出現(xiàn)，免疫組織化學在外科病理學以及其他形態(tài)學領域的應用越來越廣泛。在過去的幾十年里，基于抗原修復、石蠟組織切片技術、抗體識別的免疫組化技術，已成為病理學中疾病診斷不可或缺的工具。特別對癌癥的診斷，免疫組化技術已經(jīng)成為必須的手段，是目前臨床上診斷出各種各樣不同癌癥主要方法。質(zhì)量控制是檢驗一項產(chǎn)品或服務的質(zhì)量的必備程序，在免疫組化的結果分析中， 最關鍵的是如何確定陽性對照。陽性對照是整個過程的最重要的檢驗標準之一，通過能產(chǎn)生一種可測量的信號來實現(xiàn)，而這種信號受免疫組化過程幾乎所有的組成部分、及工藝的影響。本發(fā)明涉及的內(nèi)容，是對現(xiàn)存質(zhì)量保證程序的重要補充，是一種對免疫組化測試進行質(zhì)量控制的新方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于免疫組化過程進行質(zhì)量的陽性參照物的制備方法。隨著免疫組化技術在臨床診斷和腫瘤轉(zhuǎn)化研究中，尤其是在當前癌癥定向治療方法的研發(fā)中的廣泛應用，醫(yī)務工作者對IHC的要求越來越強烈。腫瘤標記物和作為治療指示劑的參照物已經(jīng)成為IHC標準化涉及的兩個主要指標。其中，參照物的選擇，需要針對每一個腫瘤標記物，創(chuàng)建相應的標準參照物，解決由于不一致福爾馬林固定、修復條件、免疫反應引起的多變IHC染色結果的統(tǒng)一化，同時作為評估標本制備的質(zhì)量標準。本發(fā)明中，采用多肽玻片點樣矩陣模型作為參考標準，進行免疫組化質(zhì)量控制標準的研究。將可以與一抗發(fā)生特異性免疫反應的不同濃度的多肽預先共價吸附在玻片上，或是經(jīng)過包埋的不同濃度的多肽石蠟切片預先放置在玻片上，用于后續(xù)放置病人的組織標本。吸附在玻片的多肽與病理組織切片，同時經(jīng)歷烤片、脫蠟、抗原修復、內(nèi)源性過氧化物酶的消除、封閉、一抗反應、二抗反應、顯色等步驟。特異性標記或有或無，是目前腫瘤譜鑒定的主要特征。依賴免疫組化染色結果的個性化治療的出現(xiàn)，增加了陽性對照的需求。陽性對照和陰性對照物的設置，使得檢測不一致性的影響最小化。在每張玻片上進行對照，可以應對虛假錯誤(如錯誤的試劑配置、試劑實效、操作失誤等)發(fā)生的風險，也可有效判斷由于試劑靈敏度過高引起的假陽性結果。對同一種疾病靶位的陽性參照物(多肽)，建立標準化可重復的免疫組化多肽對照，需要對已經(jīng)在臨床上應用的商業(yè)選定的抗體結合的靶位進行鑒別。選擇的多肽表位具有與天然抗原(抗原表位)的多肽一樣的結構和特性，且與抗體結合具有抗體與天然抗原結
3合一樣的效果。使用的多肽，從結構而言，必須是天然抗原的表位，鑒別抗原表位有兩個通用方法(1)對基于天然蛋白質(zhì)序列而組成的多肽進行評估；(2)對從隨機組合的多肽庫篩選得到的多肽進行評估。多肽在玻片上的放置方式見圖1或圖2所示。將能與一抗發(fā)生免疫反應的多肽打印或手工點樣在玻片上，一個濃度的多肽在玻片上經(jīng)上樣后形成一個小圓斑。圖中的多肽， 可以是相同多肽的各種不同濃度的集合組成，也可以是幾種多肽不同方式的組合。本發(fā)明的技術方案包括下列工藝步驟
將能夠與抗體發(fā)生特異性反應的多肽或蛋白，設置不同濃度預先吸附在玻片上，或是將經(jīng)過包埋的不同濃度的多肽或蛋白石蠟切片預先放置在玻片上，與病理組織切片同時經(jīng)歷常規(guī)免疫組化步驟，多肽或蛋白的染色結果作為免疫組化過程的陽性參照物。
所述的多肽或蛋白，為病理組織切片中組織抗原的表位。所述的多肽或蛋白預先吸附在玻片上，是以共價或物理吸附的方式，吸附在免疫組化用的玻片上。所述的染色結果，多肽或蛋白的斑點顏色從濃度由低到高表現(xiàn)逐漸加深；再通過顯微鏡對病理組織切片進行觀察，根據(jù)病理組織切片上靶位顏色與多肽或蛋白的斑點顏色的對比進行判定。質(zhì)量控制技術在臨床檢測應用方面十分重要，對于每種檢測物的分析，至少需要一種可進行測定的對照物。對照物的對照值偏離預訂的結果，意味著測定結果可能出現(xiàn)了錯誤，需要對檢測結果進行重新評估。在免疫組化實驗中，對于如何設定參照物，保證參照物與待測組織至于同一時間和空間范圍進行檢測流程，是參照物能否最大程度保證實驗正確的前提條件。用可與抗體發(fā)生特異性反應的多肽作為陽性對照，在同一張玻片上與待測組織同時進行反應，可以有效應對虛假錯誤(如錯誤的試劑配置、試劑實效、操作錯誤)發(fā)生的風險。能與抗體發(fā)生特異性反應的多肽或蛋白作為陽性對照，具有以下的幾個優(yōu)點 (1)可重復，(2)可無限量供應，(3)抗原特異性，(4)廉價，可以大量生產(chǎn)，(5)長久保持穩(wěn)定。


圖1為多肽點樣示意圖；1表示標簽，其中第一排為陰性斑點，均為1 mg/mL的牛血清白蛋白；第二排為陽性斑點，從左至右分別為0.001 mg/mL,0. 001 mg/mL、0. 01 mg/mL, 0.01 mg/mL濃度多肽；第三排為陽性斑點，從左至右分別為0. 1 mg/mL、0. 1 mg/mL、1 mg/ mL, 1 mg/mL濃度多肽。圖2為多肽上樣示意圖；1表示標簽，其中第一排為陰性斑點，均為1 mg/mL的牛血清白蛋白；第二排為陽性斑點，從左至右分別為0.001 mg/mL、0.001 mg/mL濃度多肽；第三排為陽性斑點，從左至右分別為0. 01 mg/mL,0. 01 mg/mL濃度多肽。
具體實施例方式本發(fā)明的一種用于免疫組化過程質(zhì)量檢控的陽性參照物的制備方法，包括以下步驟1)多肽標記選擇可與目標抗體特異性反應的多肽片段，采用磷酸鹽緩沖液(PBS)配置成系列的不同稀釋度的溶液，分別采用自動點樣儀或手工將多肽打印到玻片的上部，或采用將多肽包埋于石蠟塊切片的方式置于玻片上部，其中陰性斑點用1 mg/mL的牛血清白蛋白代替多肽。具體的多肽濃度根據(jù)不同的選用抗體進行調(diào)整；
2)脫蠟和水化用上一步標記好多肽的玻片，撈取展好片的組織切片，至于玻片的中下部。將玻片在室溫中放置60分鐘或60°C恒溫箱中烘烤20分鐘。整個玻片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后再浸泡10分鐘；無水乙醇中浸泡5分鐘，95%乙醇中浸泡5 分鐘，75%乙醇中浸泡5分鐘。用PBS洗2-3次各5分鐘，用3% (80%甲醇)滴加在玻片上，室溫靜置10分鐘，滅活內(nèi)源性氧化酶，PBS洗2-3次各5分鐘。注意除特別指出，以下步驟中的浸泡過程，需要將組織切片和多肽同時浸入液體中；(如果采用細胞涂片或細胞爬片，不采用石蠟切片方式，省略步驟2));
3)抗原修復根據(jù)不同組織抗原的要求，選擇下列之一的方法進行抗原修復(組織、細胞用甲醛或福爾馬林固定，采用抗原修復步驟)
A、抗原熱修復在將玻片浸入EDTA (pM. 0)或0. Olm枸櫞酸鈉緩沖溶液(ph6. 0)中， 放置在添加水的高壓鍋中，蓋上不銹鋼鍋蓋，高壓10分鐘后，待壓力恢復至常壓，取出自然冷卻?；虿捎梦⒉t加熱方法，在微波爐里加熱0. 01枸櫞酸鈉緩沖液(ph6. 0)至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔5-10分鐘，反復1-2次。B、酶消化方法常用0. 1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預熱37°C，將玻片浸入酶液，消化時間約為5-30分鐘。適用于被固定遮蔽的抗原包括 Collagen、GFAP> Complement、Cytokeratin、CerB-2、LCA> LN 等。4)將冷卻后的玻片用PBS洗2-3次各5分鐘，滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 分鐘，甩去多余液體，滴加一抗50μ 1，4°C過夜或37°C 1小時；PBS洗3次每次2分鐘；滴加二抗45-50 μ 1，37°C 1小時；PBS洗3次各5分鐘，然后滴加DAB顯色液，室溫下DAB顯色5-10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度。PBS或自來水沖洗10分鐘，脫水、透明、封片、鏡檢。5)根據(jù)標記多肽斑點不同濃度的顏色變化，作為判斷操作流程及試劑的標準；若斑點顯示顏色與多肽從濃度由低到高表現(xiàn)出逐漸加深的趨勢，說明操作流程與試劑合格； 再通過顯微鏡對組織切片進行觀察，根據(jù)組織切片上靶位顏色與多肽斑點顏色的對比，進行判定。所述的各種溶液的配比為
1.PBS 緩沖液(ρΗ7· 2-7. 4) :NaC137mmol/L, KCl 2. 7mmol/L, Na2HPO4 4. 3mmol/L, KH2PO4 1. 4 mmol/L ；
2.0. Olmol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH6. 0，1000ml)檸檬酸三鈉3g，檸檬酸0. 4g ；
3.0. 5mol/L EDTA 緩沖液(pH9. 0) :700ml 水中溶解 186. Ig EDTAX2H20，用 10mmol/L NaOH調(diào)至pH 9. 0，加去離子水至1000ml ；
4.酶消化液a.0. 1%胰蛋白酶用0. l%CaCl 12 (pH 7. 8)配制。b. 0. 4%胃蛋白酶液 用0. lmol/L的HCl配制；
5.3%甲醇一 H2A溶液用30% H2O2和80%甲醇溶液配制。所述的多肽配置成系列的不同稀釋度的溶液，是指根據(jù)不同的抗體反應的親和
5力，配置出能在玻片上顯出系列由淺到濃的顏色濃度范圍。由于不同的抗體反應效果有差異，因此針對不同的抗體，需要配置不同系列的多肽濃度；
所述的多肽，是通過篩選得到的能與檢測組織所用的特異性一抗能發(fā)生特異性反應的氨基酸聚合物，與組織中靶位蛋白或靶位蛋白中的一段序列一致。下面結合具體實施例對本發(fā)明進行詳細的說明，以下的實施例是為了進一步說明本發(fā)明，但不應視為限制本發(fā)明。以下所用生化試劑除特別標明外均購自生工生物工程(上海)有限公司，抗體均購自福州邁新生物科技開發(fā)公司。實施例中的臨床組織石蠟切片，為福州邁新生物科技開發(fā)公司提供。實施例1
Κ 67噬菌體多肽文庫，采用PCR方式構建。從胃癌細胞H印G2細胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后，從NCBI網(wǎng)站獲取人Ki67蛋白的mRNA序列，根據(jù)序列設計引物，采用PCR擴增Ki67的 cDNA序列，然后以獲得的cDNA序列為模板，再用半巢式PCR擴增。擴增后的引物用Eco/Pl 和Η / III內(nèi)切酶(購自生工生物工程(上海)有限公司)酶切，按照NewEnglandBiolabs公司噬菌體展示肽庫試劑盒中指導書的的指導，連入到噬菌體中，進行多肽的表達(所有的步驟均按New England Biolabs公司噬菌體展示肽庫試劑盒中指導書進行，試劑盒購自美國 New England Biolabs 公司)
實驗中引物(生工生物工程(上海)有限公司合成)序列如下表所示 表1 PCR所用引物
權利要求
1.一種用于免疫組化過程質(zhì)量檢控的陽性參照物的制備方法，其特征在于，包括下列工藝步驟將能夠與抗體發(fā)生特異性反應的多肽或蛋白，設置不同濃度預先吸附在玻片上， 或是將經(jīng)過包埋的不同濃度的多肽或蛋白石蠟切片預先放置在玻片上，與病理組織切片同時經(jīng)歷常規(guī)免疫組化步驟，多肽或蛋白的染色結果作為免疫組化過程的陽性參照。
2.根據(jù)權利要求1所述的用于免疫組化過程質(zhì)量檢控的陽性參照物的制備方法，其特征在于，所述的多肽或蛋白，為病理組織切片中組織抗原的表位。
3.根據(jù)權利要求1所述的用于免疫組化過程質(zhì)量檢控的陽性參照物的制備方法，其特征在于，所述的多肽或蛋白預先吸附在玻片上，是以共價或物理吸附的方式，吸附在免疫組化用的玻片上。
4.根據(jù)權利要求1所述的用于免疫組化過程質(zhì)量檢控的陽性參照物的制備方法，其特征在于，所述的染色結果，多肽或蛋白的斑點顏色從濃度由低到高表現(xiàn)逐漸加深；再通過顯微鏡對病理組織切片進行觀察，根據(jù)病理組織切片上靶位顏色與多肽或蛋白的斑點顏色的對比進行判定。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于免疫組化過程質(zhì)量檢控的陽性參照物的制備方法，該方法將能夠與抗體發(fā)生特異性反應的多肽或蛋白，設置不同濃度預先吸附在玻片上，或是將經(jīng)過包埋的不同濃度的多肽或蛋白石蠟切片預先放置在玻片上，與病理組織切片同時經(jīng)歷常規(guī)免疫組化步驟，多肽或蛋白的染色結果作為免疫組化過程的陽性參照。本發(fā)明采用在玻片上設置陽性對照蛋白或多肽的方法，實現(xiàn)陽性對照和指控標準，本發(fā)明是對現(xiàn)存質(zhì)量保證程序的重要補充，是一種對免疫組化測試進行質(zhì)量控制的新方法。
文檔編號G01N33/531GK102435728SQ20111026373
公開日2012年5月2日 申請日期2011年9月7日 優(yōu)先權日2011年9月7日
發(fā)明者孟春, 王航, 郭養(yǎng)浩, 黃以鵬 申請人:福州大學