專利名稱：一種檢測(cè)甲醛氣體酶生物傳感器的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種傳感器，具體是專用于探測(cè)甲醛氣體的酶生物傳感器。
背景技術(shù)：
甲醛是一種重要的有機(jī)原料，但甲醛對(duì)健康的危害主要表現(xiàn)為刺激作用、致敏作用、基因毒性和生殖毒性。目前，研究者提出了多種針對(duì)甲醛氣體檢測(cè)的傳感器，其中一些已經(jīng)進(jìn)入了市場(chǎng)。此類傳感器可分為五大類型金屬氧化物型、聲表面波型、化學(xué)發(fā)光型、電化學(xué)型和生物型。利用SnA納米晶體(張建榮，高濂.無(wú)機(jī)材料學(xué)報(bào)2005，20，465-469)、 SnCl2-hCl3氧化物薄膜(季振國(guó)等.傳感技術(shù)學(xué)報(bào)，2004，2，277-279)、La2O3摻雜納米M2O3 材料(劉如征等.電子元件與材料2006，25，15-17) ,Ag2O摻雜納米CuO氣敏材料(侯振雨等.鄭州輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)2006，20，42-4 已分別制成金屬氧化物型甲醛氣體傳感器。利用碳納米管薄膜作為氣敏材料可制成雙端聲表面波氣體傳感器(孫蕾.大連理工大學(xué)碩士學(xué)位論文2005)。利用甲醛與4-氨基-3-聯(lián)氮-5-硫基-1，2，4-三氮雜茂發(fā)生反應(yīng)時(shí)顏色的變化 (Kawamura K，et al. Sensor Actuators B 2005，105，495-501)，甲醛與納米V2Ti4O13在作用的發(fā)光(Zhou Kff, et al. Sensor Actuators B 2006，119，392-397)，以及甲酸與 TiO2-Y2O3 的發(fā)光(饒志明等.分析化學(xué)2006，34，832-834)可檢測(cè)甲醛的濃度。較為常見(jiàn)的是電化學(xué)型甲醛氣體傳感器。包括工作電極為金涂層納米薄膜 (Knake R, et al. Electroanalysis, 2001,13,631-634)、NiO 薄膜(James A, et al. Sensor Actuators B 2001,80,106-115 ；Lee CY, et al. Sensor Actuators B 2007，122，503—510) 的傳感器。市場(chǎng)上銷售的甲醛快速測(cè)定儀原理大多是基于電化學(xué)原理。上述甲醛氣體傳感器存在著選擇性差，容易受到其他氣體的干擾的不足。此外，靈敏度低和穩(wěn)定性差也是此類傳感器需要解決的問(wèn)題。將生物傳感器和流動(dòng)注射系統(tǒng)相連已制成能夠檢測(cè)水溶液中甲醛的傳感器 (Herschkovitz H, et al. J. Electroanalytical Chem. 2000，491，182-187)。酶方法的選擇性和靈敏度都很高，如果能進(jìn)一步構(gòu)建出甲醛氣體酶?jìng)鞲衅鲗⒂锌赡茉诘蜐舛鹊乃缴蠠o(wú)干擾地對(duì)去氣態(tài)甲醛進(jìn)行嗅探，可廣泛用于環(huán)境監(jiān)測(cè)和醫(yī)學(xué)檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠靈敏嗅探甲醛氣體的新型酶?jìng)鞲衅?，并設(shè)計(jì)出構(gòu)建這種傳感器的工藝方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提出了一種傳感器。這種傳感器能夠利用酶分子的高活性和高特異性的特點(diǎn)專門針對(duì)氣態(tài)甲醛進(jìn)行識(shí)別。通過(guò)一系列的氧化還原反應(yīng)甲醛在甲醛脫氫酶(FDH)的催化下將NAD+還原為NADH，NADH進(jìn)而將苯醌還原為對(duì)苯二酚，對(duì)苯二酚再奪取電極上的電子產(chǎn)生電流。通過(guò)對(duì)電流的測(cè)量即可檢測(cè)出微量氣態(tài)甲醛的濃度。
具體工藝如下將厚度200 300 μ m,孔隙率> 30%，孔尺寸1 5 μ m的聚四氟乙烯膜附著在厚度為1 3mm的圓形開孔泡沫炭電極上，形成透氣而阻水的工作電極。如圖1所示，傳感器的反應(yīng)室用透析膜隔為兩個(gè)空間下面的空間充滿含F(xiàn)DH、 NAD+和苯醌的緩沖液，底部用附著在工作電極上的聚四氟乙烯膜密封；上面的空間盛有含 NAD+和苯醌的緩沖液，溶液中浸入鉬絲對(duì)電極和由Ag/AgCl構(gòu)成的參比電極。三電極系統(tǒng)由電化學(xué)工作站控制。與其他傳感器不同，并不需要將酶蛋白(FDH)和電媒介體(苯醌) 固定在工作電極表面上。反應(yīng)室的氣體入口是圓筒底部的具有微孔的聚四氟乙烯膜和泡沫炭。氣體能夠從孔道進(jìn)入含酶電解液中，而電解液卻不能從孔道滲出。為了測(cè)試傳感器的性能，在實(shí)驗(yàn)中， 將一個(gè)盛有不同濃度甲醛水溶液(內(nèi)含10%的甲醇作為穩(wěn)定劑)的玻璃瓶連接在傳感器的入口處。甲醛液面距離與傳感器工作電極大約lcm。兩膜之間所充滿的含酶電解液是由來(lái)自惡臭假單胞菌的FDH、NAD+和苯醌的 KCl-KH2PO4緩沖液所構(gòu)成。如圖2所示，甲醛蒸汽透過(guò)微孔聚四氟乙烯膜和泡沫炭電極層進(jìn)入到含酶電解液中。在FDH酶的催化下甲醛被氧化成甲酸，而NAD+被還原成NADH。NADH進(jìn)而將苯醌還原為對(duì)苯二酚，而NADH自身氧化為原初的NAD+，從而完成了一次循環(huán)。最終，對(duì)苯二酚在工作電極上重新被氧化，回復(fù)成苯醌。工作電極失去電子，與對(duì)電極形成微電流。所產(chǎn)生的微電流與甲醛氣體的濃度有關(guān)，這樣就構(gòu)成了一種能夠通過(guò)測(cè)量電流而檢測(cè)甲醛氣體濃度的酶?jìng)鞲衅?。在室溫下甲醛氣相濃度由Sander編程的Henry定律常數(shù)(kH)來(lái)計(jì)算(ymi henrys-law. org)，kH = 5. IX 103M/atm。傳感器典型的響應(yīng)如圖3所示。實(shí)驗(yàn)顯示，該傳感器測(cè)量甲醛氣體的濃度下限可達(dá)到8. 3XlOVml (IOppb級(jí))，這說(shuō)明這些傳感器具有優(yōu)良的檢測(cè)極限。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1.本發(fā)明所提出的氣體傳感器是一種酶?jìng)鞲衅?。與其他類型的甲醛氣體傳感器酶相比，具有酶?jìng)鞲衅鞲哽`敏性的特點(diǎn)，靈敏度達(dá)到PPb級(jí)。2.本發(fā)明所提出的傳感器具有酶?jìng)鞲衅鞲咛禺愋缘奶攸c(diǎn)，不易受到其他氣體的干擾。3.酶?jìng)鞲衅鞫嘤糜谔綔y(cè)液體中痕量物質(zhì)(如葡萄糖溶液、乙醇溶液和H2O2溶液)， 本發(fā)明所提出酶?jìng)鞲衅鲗Ｓ糜跉怏w的探測(cè)，尤其適用于室內(nèi)甲醛污染的檢測(cè)和醫(yī)學(xué)化驗(yàn)。4.本發(fā)明所提出的傳感器采用了泡沫炭工作電極，既有利于氣體的透過(guò)，又增大了電極反應(yīng)的表面積。5.本發(fā)明所提出的傳感器構(gòu)造簡(jiǎn)單，具有氣體采集效率高，響應(yīng)速率快的特點(diǎn)。6.本發(fā)明所提出的傳感器可進(jìn)一步進(jìn)行微型化設(shè)計(jì)，以便制造專用于甲醛氣體的生物嗅探器。7.本發(fā)明所提出的傳感器可用于電催化和酶活性的研究。


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圖1是甲醛氣體傳感器結(jié)構(gòu)示意圖。1是聚四氟乙烯膜，2是泡沫炭工作電極，3是大套筒內(nèi)的含酶電解液，4是透析膜，5是小圓筒內(nèi)的電解液，6是大套筒，7是小套筒，8是鉬絲對(duì)電極，9是Ag/AgCl參比電極。圖2是甲醛氣體酶?jìng)鞲衅骰瘜W(xué)反應(yīng)原理圖3是酶?jìng)鞲衅鲗?duì)甲醛揮發(fā)氣體濃度與響應(yīng)電流之間的關(guān)系
具體實(shí)施例方式將聚四氟乙烯膜(厚度200 300 μ m,孔隙率> 30%，孔尺寸1 5 μ m)附著在泡沫炭電極(厚度為1 3mm的圓盤)上，邊緣捆扎在圓柱形有機(jī)玻璃套筒中制成工作電極。傳感器的反應(yīng)室由兩個(gè)直徑不同的圓柱形有機(jī)玻璃套筒組成，小套筒能夠恰好插入大套筒中，兩個(gè)筒壁的接觸面之間不漏液。反應(yīng)室內(nèi)含三電極系統(tǒng)。與泡沫炭片相接觸的聚四氟乙烯膜捆扎在大套筒的底端構(gòu)成工作電極，然后在大套筒內(nèi)加入含酶電解液液。將透析膜(MWC0 12 14kDa)捆扎在小套筒的底端，再將小套筒插入到大套筒的內(nèi)部，直至小套筒底部的透析膜接觸到大套筒中的酶液，用密封膠粘接兩個(gè)筒壁之間的縫隙。隨后，在小套筒內(nèi)加入含苯醌電媒介體的KCl-KH2PO4緩沖液(0. IM KCl, 0. 1ΚΗ2Ρ04ρΗ8. 0)，再將由鉬絲構(gòu)成對(duì)電極和Ag/AgCl構(gòu)成的參比電極浸入到緩沖液中。并不需要將電媒介體固定在電極表面上。這樣，就制成了一個(gè)圓筒形傳感器，圓筒的底部由泡沫炭(工作電極)的聚四氟乙烯膜封蓋；圓筒中部由透析膜將圓筒分隔為兩個(gè)區(qū)域，兩膜之間充滿含酶電解液，透析隔膜之上盛有電解液和浸在電解液中的對(duì)電極和參比電極。三電極系統(tǒng)由電化學(xué)工作站控制。反應(yīng)室的氣體入口是捆扎在大套筒上的聚四氟乙烯膜。為了測(cè)試傳感器的性能， 在實(shí)驗(yàn)中，將一個(gè)盛有不同濃度甲醛水溶液(內(nèi)含10%的甲醇作為穩(wěn)定劑)的玻璃瓶連接在傳感器的入口處。甲醛液面距離與傳感器工作電極大約1cm。在大小套筒之間的酶液由來(lái)自惡臭假單胞菌的甲醛脫氫酶(FDH) (EC1.2. 1.46， 凍干酶活性3 4U/mg蛋白)、NAD+和含苯醌電媒介體的KCl-KH2PO4緩沖液(0. IM KCl， 0. 1ΚΗ2Ρ04ρΗ8. 0)所構(gòu)成。在檢測(cè)期間，甲醛蒸汽透過(guò)聚四氟乙烯膜和泡沫炭電極層進(jìn)入到含酶電解液中。 通過(guò)FDH酶的催化下甲醛、NAD+和苯醌的氧化還原反應(yīng)將電子進(jìn)行傳遞，使工作電極與對(duì)電極之間形成微電流。所產(chǎn)生的微電流與甲醛氣體的濃度有關(guān)。這樣就能夠通過(guò)測(cè)量電流值來(lái)估算甲醛氣體的濃度，并通過(guò)連續(xù)記錄電流的變化來(lái)監(jiān)測(cè)甲醛氣體濃度的變化。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)甲醛氣體的酶生物傳感器，它包括氣體擴(kuò)散膜，電極系統(tǒng)和含酶電解液，其特征是在圓筒形容器上，底部由氣體擴(kuò)散膜所封，圓筒內(nèi)部的膜面上附著工作電極；中部由透析膜將圓筒分隔為兩個(gè)區(qū)域，氣體擴(kuò)散膜與透析膜之間充滿了含酶電解液，透析膜之上的空間盛有電解液，以及浸泡在電解液中的對(duì)電極和參比電極。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲醛氣體酶生物傳感器，其特征是氣體擴(kuò)散膜由厚度 200 300 μ m，孔隙率> 30%，孔尺寸1 5 μ m的微孔聚四氟乙烯膜所構(gòu)成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲醛氣體酶?jìng)鞲衅?，其特征是電極系統(tǒng)為三電極系統(tǒng)；工作電極由泡沫炭構(gòu)成；對(duì)電極由鉬絲構(gòu)成；參比電極由Ag/AgCl電極構(gòu)成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲醛氣體酶生物傳感器，其特征是含酶電解液由NAD型甲醛脫氫酶、NAD和苯醌的水溶液所構(gòu)成；電解液由NAD和苯醌的水溶液所構(gòu)成。
全文摘要
本發(fā)明所述的一種檢測(cè)甲醛氣體的酶生物傳感器，它利用酶的高催化活性和高度特異性，通過(guò)微孔聚四氟乙烯膜采集，用于對(duì)痕量氣態(tài)甲醛濃度的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)。甲醛氣體透過(guò)微孔膜和泡沫炭進(jìn)入傳感器反應(yīng)室，在甲醛脫氫酶的催化下，經(jīng)NAD+和苯醌傳遞泡沫炭電極中的電子，通過(guò)電流檢測(cè)可對(duì)甲醛氣體的濃度進(jìn)行測(cè)量。該傳感器具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、靈敏度高和不易受其他氣體影響的特點(diǎn)，適用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)和室內(nèi)甲醛污染的連續(xù)監(jiān)測(cè)。
文檔編號(hào)G01N27/413GK102435652SQ20111026429
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月8日
發(fā)明者邢達(dá)杰, 黃積濤, 黃薇 申請(qǐng)人:南開大學(xué)