專利名稱：基于芯片納流液相色譜/質(zhì)譜的類黃酮代謝輪廓分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分析化學(xué)領(lǐng)域，是ー種基于芯片納流液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(LC-Chip/MS)的大豆類黃酮代謝輪廓分析的方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代分析化學(xué)發(fā)展的ー個重要方向就是發(fā)展微量化、集成化的分離分析新方法。為了提高分析的靈敏度和通量，降低分析成本和樣本消耗量，發(fā)展微量化、集成化的分析方法已成為當前研究的前沿領(lǐng)域。納流液相色譜技術(shù)是上世紀九十年代發(fā)展起來的ー門技術(shù)，因其具有樣本消耗小、分析速度快和易集成化的優(yōu)點吸引了研究者的廣泛關(guān)注，成為微型化分析領(lǐng)域中的研究熱點。最近出現(xiàn)的芯片納流液相色譜/質(zhì)譜系統(tǒng)(LC-Chip/MS)把納流液相系統(tǒng)的樣本濃縮和分離功能與電噴霧質(zhì)譜儀中使用的復(fù)雜連接和噴霧器無縫地整合在一起，大幅度降低了泄漏和系統(tǒng)無效體積，簡化了工作流程，提高了分析的靈敏度和 可靠性。目前LC-Chip/MS技術(shù)已被用于蛋白質(zhì)組、寡糖等研究，其易操作、靈敏度高及樣本消耗量少的特點在代謝組學(xué)研究方面亦有很大優(yōu)勢，但迄今為止基于LC-Chip/MS的代謝組學(xué)輪廓分析技術(shù)鮮見報道。類黃酮是廣泛分布于植物中的一大類衍生化合物，目前已知的類黃酮化合物有3000-4000種，其中食品中的主要類黃酮大致分為四類，分別為黃烷酮、黃酮、黃酮醇和異黃酮。目前研究較多的是大豆中的異黃酮，其作為大豆生長過程中的一類次生代謝產(chǎn)物，因具有預(yù)防癌癥、心血管疾病及骨質(zhì)疏松癥等生理功能而備受關(guān)注。除異黃酮外，大豆中的其他黃酮類化合物也具有不同的生理功能，如對其含量及分布進行研究，并與代謝途徑相關(guān)聯(lián)，則可以獲取更加全面、完整的信息。到目前為止，對大豆中黃酮類物質(zhì)分析的文獻報道大都局限于測定某幾個黃酮類代謝物或水解后的總黃酮含量，僅有的幾篇輪廓分析的報道也需要二次提取及純化過程。而相對快速的提取及分析不僅可以減小人力物力的消耗，而且可以大大提高分析的通量。LC-Chip/MS分析系統(tǒng)作為儀器微型化的代表，除可以減小進樣量外，其關(guān)鍵組成部分-芯片也具有較強的靈活性，我們采用訂制的高富集容量芯片不僅可以大幅度提高檢測靈敏度，簡化樣品預(yù)處理過程，在優(yōu)化的分離分析條件下還可實現(xiàn)更多黃酮類化合物的分離分析。該方法具有操作簡單、靈敏度高的優(yōu)點，可對不同種植環(huán)境及遺傳背景的大豆樣本進行分析為大豆類黃酮的進ー步研究提供依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于建立ー種大豆類黃酮代謝輪廓分析的芯片納流液相色譜/質(zhì)譜方法，使預(yù)處理過程更為簡單，樣品用量更少，并可獲得更多黃酮類代謝物信息。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下—種大豆類黃酮代謝輪廓分析的芯片納流液相色譜/質(zhì)譜(LC-Chip/MS)方法(I)加入提取液的大豆種子樣本超聲離心后，上清液直接上樣分析，樣品預(yù)處理過程簡單，無須富集等預(yù)處理過程；(2)上清液直接上樣分析，采用高富集容量芯片及優(yōu)化的分離分析條件，可實現(xiàn)更多黃酮類化合物的輪廓分析，I U L樣品在22分鐘內(nèi)可獲得大豆中73種黃酮類化合物的代謝輪廓；高富集容量芯片由500nL大容量富集柱、長150mm分析柱及噴針組成，富集柱及分析柱的填充材料均為Zorbax SB-C18 ;富集柱和分析柱通過六通閥相連，噴針固接于分析柱
的一端。具體步驟如下，(I)稱取一定量的大豆種子樣本 于玻璃管中，向每支管中加入含內(nèi)標柚皮素、異槲皮苷及蘆丁各0. 5-2 u g/mL的提取溶劑(含甲醇10-30%的水溶液)，超聲10-20分鐘后離心，將上清液移至進樣瓶中用于芯片納流液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用分析。(2)LC-Chip/MS分析方法的具體參數(shù)為本分析最終選用的是高富集容量芯片，該芯片由大容量富集柱(500nL，ID 75iim)、分析柱(75 y mX 150mm)及噴針(10 y m ID)組成，富集柱及分析柱的填充材料均為Zorbax SB-C18 (5 y m)。富集柱和分析柱通過六通閥相連，富集柱的兩端分別與六通閥的接ロ①④相連，分析柱的一端與六通閥的接ロ③相連，噴針固接于分析柱的另一端，六通閥的接ロ②作為流動相端、其通過nano泵與流動相A和B相連，六通閥的接ロ⑥廢液端、即廢液出ロ端，六通閥的接ロ⑤作為試樣端、其通過毛細管泵與洗脫液和試樣存儲容器相連。富集時，芯片通過毛細管泵接通試樣端和廢液端引入試樣存儲容器中的樣品并在富集柱上實現(xiàn)富集，此時六通閥的接ロ⑤、④、①、⑥依次連通，試樣端洗脫液為含體積2%的こ腈水；樣品分析時，通過nano泵接通流動相端和分析柱，樣品進入分析通道，此時六通閥的接ロ②、①、④、③依次連通；分析流動相A為含體積0. 1%甲酸的水溶液，B為含體積
0.I % 甲酸的 ZJ青；梯度洗脫條件=Omin 時 90/10 (A/B, V/V)，13min 時 70/30 (A/B, V/V)，18min 時 5/95 (A/B，V/V)并保持 4min，22. Imin 時 90/10 (A/B，V/V)，隨后起始梯度 90/10 (A/B，V/V)平衡8min ;其中0_13min為第一段線性梯度洗脫、13_18min為第二段線性梯度洗脫，18-22. Imin為第三段梯度洗脫；毛細管泵的流速為4-6 V- L/min, nano泵的流速0. 3-0. 6 u L/min ;進樣量為
0.1-1 U L，進樣后富集柱沖洗體積為3-4 y L ;分析柱的柱后流出液未經(jīng)分流導(dǎo)入質(zhì)譜系統(tǒng)檢測；質(zhì)譜條件為電噴霧離子源，采用正離子模式檢測；使用高純N2輔助噴霧電離與脫溶劑，干燥氣溫度300°C，干燥氣流速為4L/min ;毛細管電壓為1800-1900V ;Centroid模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)；質(zhì)量掃描范圍m/z 100 1000 ;在上述條件下可獲得大豆類黃酮的代謝輪廓譜，即大豆類黃酮LC-Chip/MS分析的TIC圖(圖I)。本發(fā)明具有的效果是樣本的儲存、預(yù)處理及分析均采用自主建立的標準化程序，避免引入人為誤差。所采用的預(yù)處理過程簡單，不需要二次富集及純化，可避免目的化合物的部分損失，同時減小了預(yù)處理過程誤差，保證了分析方法的穩(wěn)定性。采用微型化分析儀器及自主訂制的高容量富集芯片，在優(yōu)化的分析條件下節(jié)省了分析時間和樣品用量，提高了分析通量，與預(yù)處理過程相結(jié)合可鑒定更多的目標化合物。另外，采用不同類型的內(nèi)標及質(zhì)量控制樣本校正預(yù)處理過程和實驗中儀器響應(yīng)微小漂移帶來的誤差，進ー步確保了該方法的穩(wěn)定性。對樣本中9個特征離子的方法重復(fù)性考察結(jié)果見表1，其相對標準偏差為I. 50-7. 66%,進ー步證明了本專利所闡述方法的穩(wěn)定性。


圖I大豆類黃酮LC-Chip/MS分析的TIC圖(A)及典型離子的EIC圖⑶。圖2不同種植地點大豆樣本的PLS-DA得分圖。每個點表示ー 個樣本，t表示樣本在主成分投影值。 :種植地點濟南，▲:種植地點吉林。 圖3為本發(fā)明中高富集容量芯片結(jié)構(gòu)示意圖。圖中I洗脫液，2廢液，3富集柱，4流動相，5分析柱，6噴針。
具體實施例方式實施例II.大豆種子樣本采集5個大豆品種分別為吉育73、長農(nóng)16、九農(nóng)30、荷豆12、中黃13。其中吉育73、長農(nóng)16和九農(nóng)30的種植地點為吉林。荷豆12和中黃13的種植地點為濟南。大豆種子樣本采集后放在_80°C冰箱保存。2.分析方法2. I大豆種子樣本預(yù)處理大豆種子樣本從_80°C冰箱中取出，在干燥器中等待其溫度恢復(fù)至室溫。將每種大豆種子樣本放在粉碎機中粉碎，過60目篩，得到粒徑均一的粉末。將大豆種子粉末分裝至塑料管中，備用。稱取5個品種大豆種子樣本各3份(姆份0. Ig),分別置于5mL玻璃管中。稱取每種大豆種子樣本0. 5g，混合均勻，作為質(zhì)量控制(QC)樣本。然后稱取QC樣本6份(姆份0. Ig),分別置于5mL玻璃管中。稱取內(nèi)標柚皮素0. 4mg及異槲皮苷、蘆丁各I. 6mg于I. 5mL離心管中，加入ImL乙腈。斡旋，超聲，使之完全溶解，獲得濃度分別為柚皮素0. 4mg/mL、異槲皮苷I. 6mg/mL、蘆丁I. 6mg/mL的混標溶液。取IOmL 7欠，39. 95mL甲醇，超聲混勻作為提取溶剤，向提取溶劑中加入上述混標溶液50 u L，混勻后共50mL提取溶剤。向每個玻璃管中加入2mL提取溶劑，超聲20分鐘。取出ImL移至eppendorf管中，于4°C，14000rpm下離心10分鐘，將上清液移至進樣瓶。2. 2芯片納流液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用分析如圖3所示，高富集容量芯片由大容量富集柱(500nL，ID 75iim)、分析柱(75 V- mX 150mm)及噴針(10 y m ID)組成，富集柱及分析柱的填充材料均為ZorbaxSB-C18(80A, 5iim)。富集柱和分析柱通過六通閥相連，富集柱的兩端分別與六通閥的接ロ①④相連，分析柱的一端與六通閥的接ロ③相連，噴針固接于分析柱的另一端，六通閥的接ロ②作為流動相端、其通過nano泵與流動相A和B相連，六通閥的接ロ⑥廢液端、即廢液出ロ端，六通閥的接ロ⑤作為試樣端、其通過毛細管泵與洗脫液和試樣存儲容器相連；芯片通過毛細管泵接通試樣端和廢液端引入樣品(試樣存儲容器)并在富集柱上實現(xiàn)富集，此時六通閥的接ロ⑤、④、①、⑥依次連通，試樣端洗脫液為含體積2%的こ腈水；樣品分析時，通過nano泵接通流動相端和分析柱，樣品進入分析通道，此時六通閥的接ロ②、①、④、③依次連通。分析流動相A為含體積0.1%甲酸的水溶液，B為含體積0.1%甲酸的こ臆。梯度洗脫條件(其中0-13min為第一段線性梯度洗脫、13-18min為第二段線性梯度洗脫，18-22. Imin為第三段梯度洗脫)0min時90/10 (A/B, V/V)，13min時 70/30 (A/B, V/V)，18min 時 5/95 (A/B, V/V)并保持 4min, 22. Imin 時 90/10 (A/B, V/V)，隨后起始梯度90/10 (A/B，V/V)平衡8min。毛細管泵的流速為4 y L/min，nano泵的流速
0.30 u L/min ;進樣量為I y L，進樣后富集柱沖洗體積為4 y L，分析采用反沖模式以減小譜帶展寬；柱后流出液未經(jīng)分流導(dǎo)入質(zhì)譜系統(tǒng)檢測。質(zhì)譜條件為電噴霧離子源(ES I)，采 用正離子模式檢測；使用高純N2輔助噴霧電離與脫溶剤，干燥氣溫度300°C，干燥氣流速為4L/min ;毛細管電壓為1800-1900V ;Centroid模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)；質(zhì)量掃描范圍m/zlOO 1000。在上述條件下可獲得大豆類黃酮LC-Chip/MS分析的TIC圖。15個大豆種子樣本的芯片納流液相色譜/質(zhì)譜分析順序為隨機進行，在分析過程中,先將QC樣進樣一次，然后每分析3個樣本后，再將QC樣進樣一次，通過保證QC樣本保留時間和響應(yīng)信號的重現(xiàn)性，確保實驗過程中芯片納流液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀有較好的穩(wěn)定性。結(jié)果提示，整個分析時間內(nèi)QC樣本的重復(fù)性良好，沒有出現(xiàn)明顯的組分變化，保留時間沒有出現(xiàn)飄移，表I和表2為方法重復(fù)性和儀器精密度的考察結(jié)果。3.模式識別及標志物篩選為了考察不同種植地點的大豆類黃酮代謝輪廓差別，我們采用定性分析軟件(MassHunter Qualitative Analysis)對所有大豆種子樣本的黃酮類化合物進行峰提取形成ー個數(shù)據(jù)矩陣，即把每個樣本的測量數(shù)據(jù)匹配成ー張由保留時間、質(zhì)量數(shù)和峰面積構(gòu)成的峰表，同時通過總峰面積歸ー化來減少系統(tǒng)誤差。然后利用SMCA-P 11.5(Umetrics,Umea, Sweden)進行 PLS-DA 分析。非參數(shù)檢驗采用 SPSS 13. 0 (SPSS Inc. , Chicago, IL)進行。圖2是不同種植地點大豆的PLS-DA得分圖。從中可知，9個種植地點為吉林的大豆樣本和6個種植地點為濟南的大豆樣本的投影在第一主成分上可以得到很好的分離，表明不同種植地點的大豆樣本的類黃酮代謝輪廓存在明顯的區(qū)別。將VIP > I. 0的信息提取并進行獨立樣本非參數(shù)檢驗，通過非參數(shù)檢驗的變量(P < 0. 05)認為是對分類有重要貢獻的化合物，它們分別是 glycitein 0-hexoside，genistein 0-hexoside，daidzeinO-hexosidemalonylated, daidzein 0-hexoside malonylated 等黃酮類物質(zhì)(表3)?；诒痉椒ú僮骱唵?、靈敏度高的優(yōu)點，可對不同品種及遺傳背景的大豆樣本中的類黃酮做進ー步分析，為其深入研究提供依據(jù)。表I大豆類黃酮LC-Chip/MS分析方法的重復(fù)性考察(n = 4)
權(quán)利要求
1.基于芯片納流液相色譜/質(zhì)譜的類黃酮代謝輪廓分析方法，其特征在于 (I)加入提取液的大豆種子樣本超聲離心后，上清液直接上樣分析；(2)上清液直接上樣分析，高富集容量芯片分離分析條件高富集容量芯片由500nL大容量富集柱、長150_分析柱及噴針組成，富集柱及分析柱的填充材料均為Zorbax SB-C18 ;富集柱和分析柱通過六通閥相連，噴針固接于分析柱的一端。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法，其特征在于步驟(I)中稱取大豆種子樣本于玻璃管中，向每支管中加入含內(nèi)標柚皮素、異槲皮苷及蘆丁各O. 5-2μ g/mL的提取溶劑，提取溶劑為含甲醇10-30%的水溶液，超聲10-20分鐘后離心，上清液用于LC-Chip/MS分析。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法，其特征在于 富集柱和分析柱通過六通閥相連，富集柱的兩端分別與六通閥的接口①④相連，分析柱的一端與六通閥的接口③相連，噴針固接于分析柱的另一端，六通閥的接口②作為流動相端、其通過nano泵與流動相A和B相連，六通閥的接口⑥廢液端、即廢液出口端，六通閥的接口⑤作為試樣端、其通過毛細管泵與洗脫液和試樣存儲容器相連。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于 步驟(2)選用的是高富集容量芯片，該芯片由大容量富集柱(500nL，ID 75μπι)、分析柱(75ymX150mm)及噴針(ΙΟμπι ID)組成，富集柱及分析柱的填充材料均為ZorbaxSB-C18(80A,5um)； 富集時，芯片通過毛細管泵接通試樣端和廢液端引入試樣存儲容器中的樣品并在富集柱上實現(xiàn)富集,此時六通閥的接口⑤、④、①、⑥依次連通,試樣端洗脫液為含體積2%的乙腈水； 樣品分析時，通過nano泵接通流動相端和分析柱，樣品進入分析通道，此時六通閥的接口②、①、④、③依次連通；分析流動相A為含體積O. 1%甲酸的水溶液，B為含體積O. 1%甲酸的乙腈；梯度洗脫條件=Omin 時 90/10 (A/B, V/V)，13min 時 70/30 (A/B, V/V)，18min 時5/95 (A/B,V/V)并保持 4min，22. Imin 時 90/10 (A/B，V/V)，隨后起始梯度 90/10 (A/B，V/V)；其中0-13min為第一段線性梯度洗脫、13_18min為第二段線性梯度洗脫，18-22. Imin為第二段梯度洗脫； 毛細管泵的流速為4-6 μ L/min, nano泵的流速O. 3-0. 6 μ L/min ;進樣量為O. 1-1 μ L,進樣后富集柱沖洗體積為3-4 μ L ;分析柱的柱后流出液未經(jīng)分流導(dǎo)入質(zhì)譜系統(tǒng)檢測； 質(zhì)譜條件為電噴霧離子源，采用正離子模式檢測；使用高純Ν2輔助噴霧電離與脫溶齊U，干燥氣溫度300°C，干燥氣流速為4L/min ;毛細管電壓為1800-1900V ;質(zhì)量掃描范圍m/Z 100 1000 ;在上述條件下可獲得大豆類黃酮的代謝輪廓譜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大豆類黃酮代謝輪廓分析的芯片納流液相色譜/質(zhì)譜方法，采用簡單的樣本預(yù)處理方法，在高富集容量芯片及優(yōu)化的分離分析條件下，微小進樣量即可實現(xiàn)73種黃酮類化合物的輪廓分析。本發(fā)明的分析方法簡單、快速，樣本用量小且重復(fù)性好，適合于實際樣本的批量分析。
文檔編號G01N30/02GK102768246SQ20111027378
公開日2012年11月7日 申請日期2011年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月6日
發(fā)明者吳澤明, 周佳, 常玉瑋, 許國旺, 趙春霞, 路鑫 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所