專利名稱：基于金納米片的肌鈣蛋白i自身抗體檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及基于金納米片的肌鈣蛋白I自身抗體檢測方法。
背景技術(shù)：
金納米顆粒具有基于表面等離子共振的光學(xué)特性(surface ρlasmon resonance, SPR)，該性質(zhì)源于特定波長的入射光與金納米顆粒表面的自由電子的共振耦合作用。當(dāng)金納米顆粒聚集態(tài)發(fā)生改變或者表面被不同化學(xué)分子或生物分子吸附時，其sra峰將會發(fā)生移動或峰形發(fā)生改變，這一特性可以用于分析檢測方面，并且利用通常的紫外-可見光 (UV-Vis)光譜儀即可進(jìn)行。近年來理論和實驗研究顯示，不對稱形狀的金納米顆粒的SPR 峰較之球形金納米顆粒有更高的靈敏性。然而，將不對稱形狀的金納米顆粒作為生物檢測平臺以獲得更高的檢測靈敏度的研究仍面臨著眾多的挑戰(zhàn)，其中的關(guān)鍵問題就是能否獲得膠體級、高單分散以及光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的不對稱形狀的金納米顆粒溶液。雖然具有納米厚度和微米長度的金的片狀結(jié)構(gòu)也統(tǒng)稱為金納米片，但由于它們整體的大尺寸使得其光學(xué)特性遠(yuǎn)不如三維尺寸均處于納米尺度(膠體級)的金納米片顯著。然而，現(xiàn)有報道的大部分金納米片的尺寸仍處于亞微米到幾十個微米之間。這些微米尺寸的結(jié)構(gòu)在溶液中極易因重力作用沉淀，限制了基于液相檢測方面的應(yīng)用。少數(shù)涉及小尺寸金納米片的工作常有一些其它形狀的副產(chǎn)物伴生并難以高效地純化。最近，Ha等人首次報道了利用與前述合成金納米棒相似的CTAB輔助下的“晶種”生長法制備膠體級金納米片的工作。然而，最終的反應(yīng)液中仍包含了大量的(約占總數(shù)的55% )球形金納米顆粒。心肌肌鈣蛋白I(cTnl)是心臟特異性蛋白質(zhì)，參與調(diào)控心肌的舒縮，與心臟功能緊密相關(guān)。心肌細(xì)胞損傷后cTnl釋放入血，進(jìn)入循環(huán)的cTnl可激活機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生相應(yīng)的cTnl自身抗體，并長期存在于循環(huán)中。有文獻(xiàn)報道，在心肌梗死患者血清中可檢測到 cTnl自身抗體；Haim S等對原發(fā)性擴(kuò)張型心肌病患者和缺血性心臟病患者血清進(jìn)行研究， 發(fā)現(xiàn)部分樣本血清抗心肌肌鈣蛋白I自身抗體滴度水平增高；D0rffel等對擴(kuò)張型心肌病患者進(jìn)行免疫吸附治療，發(fā)現(xiàn)這些患者的血流動力學(xué)得到明顯改善；在動物實驗中，cTnl抗體可慢性激活心肌細(xì)胞膜L型鈣通道，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高，提示cTnl抗體可能具有心肌損傷作用。但冠狀動脈硬化性心臟病患者血清中cTnl自身抗體是否具有心肌損傷的病理作用、是否與患者預(yù)后相關(guān)，有待進(jìn)一步研究。有多篇文獻(xiàn)報道，臨床檢測cTnl的標(biāo)本中存在cTnl自身抗體高達(dá)10%以上，對 cTnl的檢測結(jié)果產(chǎn)生嚴(yán)重負(fù)性干擾，應(yīng)在臨床檢驗cTnl上重視cTnl自身抗體的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于金納米片的肌鈣蛋白I自身抗體檢測方法。本發(fā)明的另一目的是提供上述金納米片的制備和純化方法。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
一種基于金納米片的心肌肌鈣蛋白I自身抗體檢測方法，在金納米片上包被心肌肌鈣蛋白I抗原，利用金納米片上包被的心肌肌鈣蛋白I抗原與待測樣品中心肌肌鈣蛋白I 自身抗體的特異性結(jié)合，通過光譜儀檢測金納米片，實現(xiàn)心肌肌鈣蛋白I自身抗體的檢測。所述的納米金片優(yōu)選三維棱柱狀結(jié)構(gòu)體，底面為邊長為50 300nm的三角形，上下底邊平行，厚度為2 20nm。所述的金納米片通過如下方法制備并純化得到(1)在三甲基十六烷基溴化銨和碘離子的輔助下，通過“晶種”生長法制備納米金片與球形金納米顆粒的混合液；(2)將混合液于30°C靜置22 ^h，納米金片與球形金納米顆粒的混合液發(fā)生相分離，金納米片沉積在容器底部，倒出上清液即可得到純化的金納米片。所述的心肌肌鈣蛋白I抗原為純化的牛心肌肌鈣蛋白I。所述的光譜儀為UV-vis光譜儀。一種制備并純化金納米片的方法，包括如下步驟(1)在三甲基十六烷基溴化銨和碘離子的輔助下，通過“晶種”生長法制備納米金片與球形金納米顆粒的混合液；(2)將混合液于30°C靜置22 ^h，納米金片與球形金納米顆粒的混合液發(fā)生相分離，金納米片沉積在容器底部，倒出上清液即可得到純化的金納米片。有益效果本發(fā)明利用相分離效應(yīng)，在不需要離心和過濾的情況下，從制備的金納米片與球形金納米顆粒的混合液中原位地高純度分離出金納米片，其純度可達(dá)97%。所獲得的金納米片可以看作一類上下底邊平行，具有納米尺度的三維棱柱狀結(jié)構(gòu)體。因其立體結(jié)構(gòu)的高度不對稱性而導(dǎo)致其sra表現(xiàn)為多重吸收峰，其長波方向的sra峰可以通過調(diào)控納米片的尺度而延伸到近紅外區(qū)。金納米片的光學(xué)特性使其在光學(xué)(雙光子)熒光、表面增強(qiáng)拉曼散射、光學(xué)涂層等方面具有廣泛的應(yīng)用前景，為金納米片應(yīng)用于抗體或抗原的檢測掃清了技術(shù)障礙。進(jìn)而將該純化的不對稱形狀的金納米片包被心肌鈣蛋白ι后運(yùn)用于心肌鈣蛋白I自身抗體的檢測，相比現(xiàn)有酶聯(lián)免疫法，有利于CTnI自身抗體的快速檢測，靈敏度更高，具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，操作簡便。


圖1.粗曲線為金納米片在300 IlOOnm波長的光吸收曲線，細(xì)曲線為球形金納米顆粒在300 IlOOnm波長的光吸收曲線，相對于球形金納米顆粒溶液只呈現(xiàn)單個的SPR 峰，高純度的金納米片由于其高度不對稱的形狀而呈現(xiàn)兩個SI3R峰一個弱峰位于760nm， 另一個強(qiáng)峰位于1055nm。圖2.利用相分離效應(yīng)分離出金納米片，a)為相分離后上清液中球形金納米顆粒的TEM照片；b)為相分離后沉淀中金納米片的TEM照片.插圖中標(biāo)尺為200nm ；c)金納米片的高分辨電鏡照片；d)與圖c)中金納米片相應(yīng)選區(qū)的電子衍射花樣，以方塊、圓形以及三角形標(biāo)記的衍射點分別對應(yīng)著1/3 {422}， {220}和{422}的衍射點。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。實施例1高純度金納米片的制備及獲取金納米片的制備是基于在碘離子(Γ)和三甲基十六烷基溴化銨(CTAB)存在下的 “晶種”生長法策略，首先將ImL IOmM的檸檬酸鈉加入37. 6mL的水中，再加入0. 4mL 25mM 的氯金酸(HAuCl4)溶液，最后快速加入ImLmo. IM硼氫化鈉(NaHB4)溶液。反應(yīng)液顏色立刻由淡黃色轉(zhuǎn)為橘紅色，表明金納米顆粒的生成，以此作為晶種。典型的生成金納米片的步驟如下將IOOmL含有0. 25mMHAuCl4和0. 05M CTAB的生長液置于250mL的燒瓶中，對此生長液中依次加入55 μ L的0. IM碘化鉀(KI)，0. 55mL的0. IM L-抗壞血酸(AA)和0. 5mL的 0. IM NaOH(NaOH在此處的作用是對AA去質(zhì)子化以獲得更高效的還原能力)。最后，再向生長溶液中加入0. ImL的“晶種”以引發(fā)金納米片的生長。反應(yīng)體系在30°C的水浴中進(jìn)行。 然后將整個反應(yīng)體系無擾動地靜置Mh。經(jīng)過上述操作后，絕大部分的金納米片沉積在容器底部，可通過倒出上清液進(jìn)行搜集。上清液為球形金納米顆粒的膠體溶液，金納米片的沉淀用5mM的CTAB溶液重懸為膠體溶液。利用UV-vis光譜儀檢測二者的300 IlOOnm波長吸收曲線進(jìn)行分析。如圖1所示，相對于球形金納米顆粒膠體溶液只呈現(xiàn)單個的SI^R峰，高純度的金納米片由于其高度不對稱的形狀而呈現(xiàn)兩個SPR峰一個弱峰位于760nm，另一個強(qiáng)峰位于1055nm。實施例2制備的金納米片做電鏡表征角形納米金片與球形金納米顆粒的電鏡觀察結(jié)果如圖2所示，三角形納米金片與球形金納米顆粒的混合液分離后，二者都具有較窄的尺寸分布。球形金納米顆粒的平均直徑為30士2nm。三角形金納米片的平均側(cè)邊長度為140士25nm，厚度為8士2nm.由金納米片的TEM照片進(jìn)行統(tǒng)計可知，金納米片的數(shù)量占所有顆?？倲?shù)的97%以上。對單個金納米片的基面進(jìn)行高分辨電鏡表征(圖2c)，其取向相同，間距相同的晶格紋路顯示這些金納米片具有單晶的性質(zhì)。對金納米片的基面用垂直電子束照射所獲得的呈正六邊形的對稱點陣的電子衍射花樣(圖2d)顯示這些金納米片是以{111}晶面為基面的單晶晶體。實施例3cTnI抗原分別包被金納米片、球形金納米顆粒離心金納米片的重懸液以除去溶液中游離的CTAB分子，在結(jié)合抗原之前，先用聚苯乙烯磺酸鈉(PSQ對金納米片表面的CTAB雙分子層進(jìn)行表面修飾。操作步驟如下在攪拌下向30mL，長波STO峰的光學(xué)強(qiáng)度為1. 0的金納米片溶液中加入2. 4mL 2. 5mg/mL的PSS 溶液，之后靜置15分鐘。溶液體系中游離的PSS分子經(jīng)由離心過程除去。沉淀用相同體積的去離子水重懸，并以0. 2M的K2CO3溶液調(diào)節(jié)pH值為8. 2.然后將PSS包覆的金納米片溶液與過量的cTnl抗原(SOyg/mL)作用30min。之后加入1 %的小牛血清蛋白(BSA)的1Tris 緩沖液將未結(jié)合的位點進(jìn)行封閉。然后將混合體系離心兩次以去除游離的抗原，并用Tris 緩沖液(PH = 8. 2)重懸至光學(xué)強(qiáng)度為1. 0.按照上述方法，制備cTnl抗原包被的球形金納米顆粒溶液。實施例4通過結(jié)合cTnl抗原的金納米片檢測鼠抗人cTnl抗體在常溫下將不同濃度(0、l、2、4、8、16、32、64、128、256、512、10Mng/mL)的鼠抗人 cTnl抗體分別加入到1. OmL的結(jié)合cTnl抗原的金納米片溶液和1. OmL的結(jié)合cTnl抗原的球形金納米顆粒溶液。之后每個混合液室溫孵育15min，然后用UV-vis光譜儀檢測300 IlOOnm波長吸收曲線進(jìn)行分析。金納米片的長波SI5R峰(1055nm)的光學(xué)強(qiáng)度隨著溶液中cTnl抗體濃度的增加而逐漸降低，上述現(xiàn)象可以歸因于由于抗原-抗體特異性識別作用而導(dǎo)致了金納米片聚集。而球形金納米顆粒的波峰(520nm)的光學(xué)強(qiáng)度，隨著溶液中cTnl抗體濃度增加到256ng/ml以上才有降低。上述基于金納米片的肌鈣蛋白I自身抗體檢測方法能夠檢測出cTnl抗體的最低濃度為l.Ong/ml，比現(xiàn)有酶聯(lián)免疫法的靈敏度(2. 5ng/ml)更高，遠(yuǎn)高于基于球形金納米顆粒的肌鈣蛋白I自身抗體檢測方法的靈敏度056ng/ml)。不同濃度(O、1、2、4、8、16、32、64、 128、256、512、10Mng/mL)的鼠抗人cTnl抗體經(jīng)10次重復(fù)檢測，CV < 10%，而現(xiàn)有酶聯(lián)免疫法的CV達(dá)15%。所以基于金納米片的肌鈣蛋白I自身抗體檢測方法有利于cTnl自身抗體的快速檢測，具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，操作簡便。實施例5通過結(jié)合cTnl抗原的金納米片檢測cTnl自身抗體收集50例心肌梗死患者血清標(biāo)本，所有患者均參照中華醫(yī)學(xué)會心血管病分會 2001年心肌梗死診斷及治療指南明確診斷。收集131例健康體檢者血清作為對照。所有標(biāo)本分別加入到1. OmL的結(jié)合cTnl抗原的金納米片溶液中，之后每個混合液室溫孵育15min， 然后用UV-vis光譜儀檢測3001 IOOnm波長吸收曲線進(jìn)行分析。50例心肌梗死患者中有9 例cTnl自身抗體陽性(現(xiàn)有酶聯(lián)免疫法檢測出7例cTnl自身抗體陽性)，陽性率為18%， 對照組無cTnl自身抗體陽性。cTnl自身抗體陽性患者中男女?dāng)?shù)比為5 4，cTnl自身抗體陰性心肌梗死患者中男女比為33 8，與自身免疫系統(tǒng)疾病女性發(fā)病率高于男性發(fā)病率的流行病學(xué)特征相符合。
權(quán)利要求
1.一種基于金納米片的心肌肌鈣蛋白I自身抗體檢測方法，其特征在于在金納米片上包被心肌肌鈣蛋白I抗原，利用金納米片上包被的心肌肌鈣蛋白I抗原與待測樣品中心肌肌鈣蛋白I自身抗體的特異性結(jié)合，通過光譜儀檢測，實現(xiàn)心肌肌鈣蛋白I自身抗體的檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于金納米片的心肌肌鈣蛋白I自身抗體檢測方法，其特征在于所述的納米金片為三維棱柱狀結(jié)構(gòu)體，底面為邊長為50 300nm的三角形，上下底邊平行，厚度為2 20nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于金納米片的心肌肌鈣蛋白I自身抗體檢測方法，其特征在于所述的金納米片通過如下方法制備并純化得到(1)在三甲基十六烷基溴化銨和碘離子的輔助下，通過“晶種”生長法制備納米金片與球形金納米顆粒的混合液；(2)將混合液于30°C靜置22 ^h，納米金片與球形金納米顆粒的混合液發(fā)生相分離， 金納米片沉積在容器底部，倒出上清液即可得到純化的金納米片。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于金納米片的心肌肌鈣蛋白I自身抗體檢測方法，其特征在于所述的心肌肌鈣蛋白I抗原為純化的牛心肌肌鈣蛋白I。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于金納米片的心肌肌鈣蛋白I自身抗體檢測方法，其特征在于所述的光譜儀為UV-vis光譜儀。
6.一種制備并純化金納米片的方法，其特征在于包括如下步驟(1)在三甲基十六烷基溴化銨和碘離子的輔助下，通過“晶種”生長法制備納米金片與球形金納米顆粒的混合液；(2)將混合液于30°C靜置22 ^h，納米金片與球形金納米顆粒的混合液發(fā)生相分離， 金納米片沉積在容器底部，倒出上清液即可得到純化的金納米片。
全文摘要
本發(fā)明屬于納米生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，公開了基于金納米片的肌鈣蛋白I自身抗體檢測方法。該方法是在金納米片上包被心肌肌鈣蛋白I抗原，利用金納米片上包被的心肌肌鈣蛋白I抗原與待測樣品中心肌肌鈣蛋白I自身抗體的特異性結(jié)合，通過光譜儀檢測金納米片，實現(xiàn)心肌肌鈣蛋白I自身抗體的定量檢測。該檢測方法具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性且操作簡便，為金納米片在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用開辟了一條新途徑。
文檔編號G01N21/33GK102435570SQ20111027424
公開日2012年5月2日 申請日期2011年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月15日
發(fā)明者卞智萍, 吳恒芳, 徐晉妉, 楊笛, 郭志睿, 陳相健, 顧春榮 申請人:南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院