專利名稱：胰腺癌早期診斷的血清腫瘤標志物、檢測方法和診斷模型的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學診斷領域，特別涉及對胰腺癌早期診斷靈敏度、特異性高的血清腫瘤標志物、檢測方法和蛋白質指紋圖診斷模型。
背景技術：
胰腺癌是惡性程度最高、預后最差的腫瘤之一，胰腺癌患病率和病死率迅速上升， 發(fā)病年齡逐漸提前已引起普遍關注。由于臨床上缺乏好的腫瘤標志物檢測方法，絕大多數(shù)的胰腺癌患者確診時已是中晚期。早期診斷、早期治療是提高胰腺癌生存率和降低死亡率的關鍵。但是目前，胰腺癌早期診斷缺乏有效手段，目前主要手段靠影像學檢查，但結果不盡人意。在早期階段，尤其是亞臨床階段CT、MR則無能為力。腫瘤標志物的診斷是近年來研究的熱點。然而單一的腫瘤標志物往往難以反映腫瘤的全貌，從理論上講，最有可能成為理想腫瘤標志物的應是聯(lián)合數(shù)個或多個的腫瘤標志物。

發(fā)明內容
針對上述現(xiàn)有技術存在的問題，為了提高胰腺癌早期診斷水平，從而有助于改善胰腺癌患者的預后，本發(fā)明的目的旨在建立胰腺癌早期診斷的蛋白質指紋圖診斷模型，進一步可篩選出胰腺癌早期診斷的新的體液蛋白質腫瘤標志物。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案得以實施的
本發(fā)明首先提供了胰腺癌早期診斷的血清腫瘤標志物，所述的血清腫瘤標志物由11 個蛋白質質荷比峰組成6684Da、6668Da、8591Da、6471Da、4121Da、877OTa、4290Da、665OTa、 2959Da、5913Da和 5346Da。本發(fā)明還提供了一種胰腺癌早期診斷的血清腫瘤標志物的檢測方法，包括
(1)血清準備，
(2)質譜數(shù)據(jù)收集，篩選出差異蛋白峰，建立胰腺癌早期診斷的蛋白質指紋圖診斷模
型，
(3)進一步用遺傳算法結合支持向量機模型的方法篩選出血清腫瘤標志物。作為優(yōu)選方案，根據(jù)本發(fā)明所述的一種胰腺癌早期診斷的血清腫瘤標志物的檢測方法，其中，所述的步驟(2)中質譜數(shù)據(jù)收集設置激光強度為180，檢測靈敏度為6，檢測上限為100000m/Z，收集數(shù)據(jù)范圍為2000-20000 m/z，信號收集位置從20-80。本發(fā)明還提供了一種胰腺癌早期診斷的血清腫瘤標志物的蛋白質指紋圖診斷模型，其中，所述的血清腫瘤標志物由11個蛋白質質荷比峰組成6684Da、6668Da、8591Da、 6471Da、4121Da、8775Da、4290Da、6655Da、2959Da、5913Da和 5346Da,
所述的蛋白質指紋圖診斷模型按下述方法建立
(1)利用表面加強激光解吸電離-飛行時間質譜儀測定腫瘤患者與健康人血清標本的蛋白質組圖譜，
(2)結合生物信息學的方法篩選出相應的血清腫瘤標志物并建立診斷模型。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下優(yōu)點
(1)利用SELDI-T0F-MS技術從低豐度的血清樣本中檢測出血清腫瘤標志物。(2)聯(lián)合在血清中篩選的候選的腫瘤標志物，對胰腺癌患者的早期診斷提供新的途徑和方法，彌補了影像學的不足。影像學技術的進步，在早期胰腺癌患者診斷方面取得了一定的突破。(3)相關的支持向量機等生物信息學軟件的開發(fā)和應用，提高診斷的準確率。(4)本發(fā)明從一個嶄新的技術平臺和理念檢測胰腺癌的聯(lián)合蛋白質腫瘤標志物， 可望提高胰腺癌早期診斷水平，從而有助于改善胰腺癌患者的預后。說明書附圖


圖1是本發(fā)明實驗方法的流程示意圖。圖2是本發(fā)明所有樣本的遞加質譜蛋白質峰示分布意圖。圖3是早期胰腺癌組與健康人對照組兩組樣本支持向量機散點分布圖，圖中，縱坐標principal component表示主成分,橫坐標SVM predict labels表示支持向量機預測值，SVM Result Scatter Plot表示支持向量機散點分布結果。圖4是所有樣本的質譜表達圖。圖5是人胰腺癌血清樣本與相應羊抗人抗體反應過夜后經(jīng)SELDI檢測結果圖。
具體實施例方式下面結合實施例，更具體地說明本發(fā)明的內容。應當理解，本發(fā)明的實施并不局限于下面的實施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護范圍。在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設備和原料等均可從市場購得或是本行業(yè)常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規(guī)方法。實施例1
1、樣本和資料
胰腺癌患者共M例(早期22、晚期3 ，術后病理確診，平均年齡65歲。健康對照組共20例，來源于體檢，平均年齡為63歲。共分兩組進行血清的蛋白質譜分析對比
①早期胰腺癌組vs健康人對照組，
②早期胰腺癌VS晚期胰腺癌組。各組年齡和性別均配對，有相似的暴露史，無影響血清中蛋白質含量的其他相關疾病，于清晨空腹采集健康人及患者治療前外周靜脈全血5ml，4°C靜置1-池，3000 r/min 條件下離心lOmin，分離血清，-80°C冰箱保存?zhèn)溆谩?、實驗方法主要儀器設備及試劑
1 Ciphergen PBS- II -PLUS 型 SELDI-TOF-MS 系統(tǒng) 1 蛋白質芯片CMlO芯片實驗試劑的配制
41.U9血清變性溶液9 mol/1尿素，2 % CHAPS, 1 % DTT。配制完成后分裝，-80°C低溫冰箱保存。2. 50% 飽和 SPA 溶液=SPA 的溶劑為 50% H2O + 50% 乙腈+ 0. 5% TFA。將 SPA 溶解于其溶劑中直至過飽和，13，OOOrpm離心1分鐘后取上清液，與溶劑1 :1混合即可。室溫避
光保存。3. CMlO 芯片 Binding Buffer :50 mmol/1 乙酸鈉(pH = 4. 0)。乙酸鈉 2. 051g 溶于去離子水中，HCl調節(jié)pH值至4.0，定容為500ml。實驗方法(流程圖見附圖1) 芯片的預處理
1 每孑L中力口入 200 μ 1 Binding Buffer
1搖床上振蕩(600rpm，室溫)5分鐘使充分平衡后去除液體，重復平衡一次。血清的預處理
1 冰浴上緩慢融解血清(30 60分鐘)，IOOOOrpm離心5分鐘(4°C )。1 10 μ 1 U9血清變性溶液中加入血清5yL，搖床上振蕩使充分混合(600rpm， 4°〇，30分鐘)。1 用Binding Buffer將U9處理后的血清稀釋至200 μ 1用于上樣，搖床上振蕩使充分混合(600rpm，4°C，2分鐘)。至此血清被稀釋約40倍。蛋白質與芯片結合
1取上述經(jīng)U9處理并稀釋過的血清100 μ 1加到芯片上，仔細檢查并去除每個孔中的氣泡以免其影響蛋白質與芯片的結合。1芯片與血清充分反應1小時(600rpm搖床上振蕩，4°C)后去除樣品。結合后沖洗
1 每孔加入200 μ 1相應的Binding Buffer，搖床上振蕩5分鐘(600rpm，室溫)后除
去液體。重復該過程2次。1 用水(純度朋⑶級力⑷^ 1快速清洗每個孔1次，用力甩干并將Bio-processor 倒扣在清潔的吸水紙上輕拍以去除多余的水。1 將芯片從Bio-processor中取出，自然干燥。加能量吸收分子(EAM)
每孔點加50%飽和的SPA溶液1 μ 1，待其自然干燥后重復點加1次。自然干燥即可上機檢測。數(shù)據(jù)采集及統(tǒng)計學處理
SELDI質譜儀參數(shù)設置及原始數(shù)據(jù)采集和輸出
首先用已知分子量的標準蛋白質芯片All-in-One將SELDI質譜系統(tǒng)的分子量誤差校正到<0. 1%，再將結合好蛋白質的芯片放入質譜儀中進行檢測。原始數(shù)據(jù)由ftOteinchip Software 3. 2軟件采集，設置激光強度為180，檢測靈敏度6，檢測上限100，000 Λ，優(yōu)化收集數(shù)據(jù)范圍2000 20000 ，信號收集位置從20 80，每個樣本取168個點所收集信號的平均值。用ftOteinchip Software 3. 2軟件將原始數(shù)據(jù)以xlm的格式輸出。數(shù)據(jù)處理
采用 ZJU-PDAS (ProteinChip Data Analyze System)軟件分析，整個流程如下1.原始質譜圖上傳到服務器，
2.先用小波變換(UDWTundecimated discrete wavelet transform)去除質譜儀器本身造成的噪音，
3.修正去除噪音后的質譜圖的基線，
4.校正整個圖譜的分子量值，
5.用局部極值法找出蛋白值峰，用信噪比和這個峰在各個樣本中出現(xiàn)的比率過濾蛋白質峰，
6.均一化所有樣本數(shù)據(jù)，
7.對預處理完篩選出來的蛋白質峰做進一步的檢驗分析，篩選出P<0.05差異蛋白峰，
8.對篩選的差異蛋白峰進一步用遺傳算法結合支持向量機模型的方法篩選最佳模型， 用留一法評估模型的預測效果，選出建立支持向量機模型預測的約登指數(shù)最高的組合作為最終的候選標志物，建立的模型和留一法交叉驗證的結果作為最終的結果。9.輸出各種統(tǒng)計結果和圖片。結果
1、早期胰腺癌組(陽性組)vs健康人對照組
22例早期胰腺癌組和20例健康人對照組進行t檢驗，篩查ρ值小于0. 05的差異蛋白質。共檢測到153個經(jīng)過信噪比和強調過濾的高質量質譜蛋白質峰，發(fā)現(xiàn)有14個蛋白質峰含量有統(tǒng)計學差異O°<0. 05)，從中篩選出11個蛋白質峰用于建立SVM判別模型。所有樣本的遞加質譜蛋白質峰示分布意圖見圖2。兩組樣本支持向量機散點分布圖，見圖3，每一點表示一個樣本，縱坐標為主成分，橫坐標為SVM預測值，兩組可清晰的區(qū)分。 表1: P值小于0.05的所有14個峰的統(tǒng)計結果
權利要求
1.胰腺癌早期診斷的血清腫瘤標志物，其特征在于，所述的血清腫瘤標志物由11個蛋白質質荷比峰組成:6684Da、6668Da、8591Da、6471Da、4121Da、877OTa、4290Da、6655Da、 2959Da、5913Da和 5346Da。
2.一種胰腺癌早期診斷的血清腫瘤標志物的檢測方法，其特征在于，所述的檢測方法包括(1)血清準備，(2)質譜數(shù)據(jù)收集，篩選出差異蛋白峰，建立胰腺癌早期診斷的蛋白質指紋圖診斷模型，(3)進一步用遺傳算法結合支持向量機模型的方法篩選出血清腫瘤標志物。
3.根據(jù)權利要求2所述的一種胰腺癌早期診斷的血清腫瘤標志物的檢測方法，其特征在于，所述的步驟(2)中質譜數(shù)據(jù)收集設置激光強度為180，檢測靈敏度為6，檢測上限為 100000m/z，收集數(shù)據(jù)范圍為2000-20000 m/z，信號收集位置從20-80。
4.一種胰腺癌早期診斷的血清腫瘤標志物的蛋白質指紋圖診斷模型，其特征在于， 所述的血清腫瘤標志物由11個蛋白質質荷比峰組成6684Da、6668Da、8591Da、6471Da、 4121Da、8775Da、4290Da、6655Da、2959Da、5913Da 和 5346Da,所述的蛋白質指紋圖診斷模型按下述方法建立(1)利用表面加強激光解吸電離-飛行時間質譜儀測定腫瘤患者與健康人血清標本的蛋白質組圖譜，(2)結合生物信息學的方法篩選出相應的血清腫瘤標志物并建立診斷模型。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)學診斷領域，特別涉及一種胰腺癌早期診斷的血清腫瘤標志物，所述的血清腫瘤標志物由11個蛋白質質荷比峰組成6684Da、6668Da、8591Da、6471Da、4121Da、8775Da、4290Da、6655Da、2959Da、5913Da和5346Da。本發(fā)明還提供了胰腺癌早期診斷的血清腫瘤標志物的檢測方法和診斷模型。本發(fā)明利用SELDI-TOF-MS技術從低豐度的血清樣本中檢測出聯(lián)合腫瘤標志物，建立了胰腺癌早期診斷的蛋白質指紋圖診斷模型，對胰腺癌患者的早期診斷提供了新的途徑和方法，彌補了影像學的不足，可望提高胰腺癌早期診斷水平，從而有助于改善胰腺癌患者的預后。
文檔編號G01N27/64GK102435665SQ20111028638
公開日2012年5月2日 申請日期2011年9月23日 優(yōu)先權日2011年9月23日
發(fā)明者劉建 申請人:浙江省新華醫(yī)院