專利名稱：豬肺炎支原體間接elisa抗體檢測試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動物病毒學與動物傳染病學檢測技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一 種豬肺炎支原體間接ELISA抗體檢測試劑盒及其在豬群中豬肺炎支原體抗體檢測的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬支原體肺炎俗稱豬喘氣病或豬地方流行性肺炎，廣泛分布于世界各地，以慢性、 接觸性、高度傳染性、高發(fā)病率以及低死亡率等為特點，主要表現(xiàn)為咳嗽和呼吸困難，解剖 可見肺組織呈肉變或者大理石樣病變。
豬肺炎支原體是豬呼吸道疾病綜合征的重要病原之一，可繼發(fā)感染PRRSV、PCV2 等，從而導致了多種疫苗的接種失敗。豬肺炎支原體可經(jīng)空氣傳播，此外還易與其他細菌性 疾病如豬肺疫、傳染性胸膜肺炎等并發(fā)，對養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失，是當前最常發(fā)生、最 廣流行、最難凈化的重要疫病之一。這主要是因為豬肺炎支原體能夠穿透黏膜層與纖毛粘 在一起，破壞纖毛的完整性，并分泌一些有害因子，而改變纖毛的游走性，致使纖毛大量脫 落，這為其它細菌和病毒的入侵創(chuàng)造了條件，也就致使損失加劇。
豬肺炎支原體能在豬肺中長期滯留，治療效果不佳，雖然該病引起的死亡率不高， 但是流行的廣泛性所造成的經(jīng)濟損失仍然是巨大的。據(jù)報道，豬肺炎支原體表面具有纖毛 黏附因子，其感染豬的呼吸道后，能與黏膜上皮細胞纖維發(fā)生特異性結(jié)合，使豬肺炎支原體 能夠附殖并造成致病性。Raznis (1983)研究發(fā)現(xiàn)，豬肺炎支原體的致病力及免疫原性都與 其細胞膜上的膜蛋白有關(guān)，Gear S J等(1985)從豬肺炎支原體菌株VPPll的細胞膜中分 離得到了一種致病蛋白因子，發(fā)現(xiàn)其具有明顯的免疫原性，并證實細胞膜蛋白是導致豬患 豬支原體肺炎的主要因素。根據(jù)衣阿華大學的Ross研究發(fā)現(xiàn)，豬肺炎支原體感染后淋巴細 胞產(chǎn)生抗體的能力下降，細胞免疫力下降，肺泡巨噬細胞對病原的吞噬和清除能力亦下降， 抑制性T細胞的活動增強，導致呼吸道免疫力減弱，抗病力下降，從而使其它病原體更容易 侵入。
對標準菌株和野外分離菌株的抗原分析表明，支原體肺炎含有幾種主要免疫原， 即胞內(nèi)具 LDH 活性的蛋白(P36) (Haldimann A,et al. 1993 ；Stipkovits L, et al. 1991),3 種膜蛋白(P46、P65 和 P70) (Kim M F，et al. 1990 ；Mori Y T，et al. 1988)和粘附素(P97) (Zhang Q T，et al. 1995)。這些蛋白在急性或初次感染肺炎支原體后，可刺激產(chǎn)生早期和 特異抗體。
目前關(guān)于豬支原體肺炎的診斷方法，國外研究較多，而國內(nèi)研究較少，而且主要是 間接血凝實驗(IHA)和單抗原包被的ELISA方法。但是，IHA的檢測中存在著檢測滴度低、 結(jié)果和感染的相關(guān)性低、凝集終點判定的主觀性較強以及本身固有的技術(shù)缺陷等問題，因 此IHA在商品豬群的Mhp檢測中實際應(yīng)用前景有限。ELISA是目前應(yīng)用最廣泛的檢測技術(shù)， 它具有敏感度高、特異性強和操作簡單等特點。通過研究其特異性蛋白而建立的診斷方法 是目前研究的熱點。但是只選用一種蛋白作為唯一的包被蛋白，對于Mhp感染初期的豬很 可能存在假陰性，若將Mhp的功能蛋白組合后再檢測該病，可能檢測結(jié)果更加準確可靠，易于大規(guī)模推廣應(yīng)用，具有更加廣闊的應(yīng)用前景。
研究發(fā)現(xiàn)，p46蛋白是豬肺炎支原體的一種種屬特異的膜抗原，高度保守，可以誘 導早期免疫應(yīng)答，并且引起的抗體反應(yīng)的持續(xù)時間最長。其序列中3個TGA密碼子編碼Trp， 而TGA在通用密碼子中為終止密碼子，需要將TGA突變?yōu)門GG才能獲得其原核表達的蛋白。 S Futo等將P46基因克隆到載體，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進行原核表達，收獲并純化該重組 蛋白，并且將其成功地應(yīng)用于檢測豬肺炎支原體抗體的ELISA實驗，在該實驗中可以避免 與絮狀支原體、豬鼻支原體，豬滑液支原體的交叉反應(yīng)(Futo S，et al. 1995)。M F Kim等 研究發(fā)現(xiàn)，P65蛋白是豬肺炎支原體的一個重要的免疫原，它的碳端是其主要的抗原區(qū)(Kim M F,et al. 1990)。P65蛋白是一種解脂酶(lipolytic enzyme),是豬肺炎支原體主要的具 免疫原性的表面蛋白即膜蛋白之一(Jono A，et al. 2004)，其功能可能是損害肺組織中表 面活性劑，即一種由脂蛋白組成的物質(zhì)，是由肺部的肺泡細胞分泌的，可以通過減小肺部表 面的液體表面張力來維持肺組織的穩(wěn)定性(Wise K. S. et al. 1987)，還可以觸發(fā)急性或首 次感染豬肺炎支原體的斷奶仔豬及生長豬的早期免疫應(yīng)答。P65蛋白序列中也有I個TGA 密碼子需要進行定點突變才能在大腸桿菌中表達。K. Cheikh Saad Bouh等將P46基因和 P65基因克隆到載體上，在大腸桿菌中對其進行原核表達，收獲表達產(chǎn)物并對其進行復(fù)性 后免疫BALB/c小鼠，從而獲得相應(yīng)的單克隆抗體，并對該單克隆抗體進行了交叉反應(yīng)的研 究，結(jié)果顯示該蛋白具有很高的種間保守性和特異性(Cheikh Saad Bouh K, et al. 2003)。 因此，P46蛋白和P65蛋白均可以作為建立Mhp診斷方法的優(yōu)選抗原。在血清學檢測方法 中，ELISA方法具有方便、快速、敏感性和特異性高等特點，在動物疾病的檢測中得到了廣泛 的應(yīng)用。本研究克隆了 Mhp P46和P65基因，并以其表達的蛋白共同作為抗原建立了檢測 Mhp的間接ELISA方法，為臨床檢測豬肺炎支原體感染和流行病學調(diào)查奠定了初步基礎(chǔ)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)的的主要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)上存在的缺陷，提供一種豬肺炎支原體間接 ELISA抗體檢測試劑盒，以解決豬群中豬肺炎支原體抗體的檢測。
本發(fā)明的第一個目的是獲得分別表達豬支原體肺炎主要免疫原性膜蛋白p46蛋 白和p65蛋白的重組大腸桿菌菌株，重組菌株pGEX-KG-46中的p46蛋白基因中三個編碼色 氨酸的TGA密碼子均已經(jīng)定點突變?yōu)門GG，重組菌株pGEX-KG-65中的p65蛋白基因中一個 編碼色氨酸的TGA密碼子已經(jīng)定點突變?yōu)門GG，以便于這兩種蛋白的原核表達；
本發(fā)明的第二個目的是利用上述重組菌株建立一種豬肺炎支原體間接ELISA抗 體檢測方法。
本發(fā)明的第三個目的是組裝一種豬肺炎支原體間接ELISA抗體檢測試劑盒。
本發(fā)明的第四個目的是利用該試劑盒在豬群中豬肺炎支原體抗體檢測中的應(yīng)用。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)
申請人通過基因工程的方法，獲得兩株分別表達豬支原體肺炎主要免疫原性膜蛋 白p46蛋白和p65蛋白的重組的大腸桿菌(Escherichia coli)pGEX_KG_46和pGEX_KG_65, 將這兩株菌株于2011年08月22日送交湖北省武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏 中心(CCTCC)保藏，其保藏編號分別為 CCTCC NO M2011294 ；CCTCC NO :M2011295。
申請人提供了一種重組的大腸桿菌pGEX-KG-46和pGEX_KG_65的制備方法，它包括下列步驟
I)構(gòu)建重組質(zhì)粒 pGEX-46 和 pGEX-65
分別擴增豬肺炎支原體膜蛋白p46和p65的基因片斷，并將其亞克隆至原核表達 載體pGEX-KG上，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pGEX-46和pGEX_65。
所用引物對的DNA序列如下所示(引物的下劃線部分為酶切位點):
p46 正向引物CCCGGATCCATGAAAAAAATGCTTA (5' — 3')，
p46 反向引物CCCAAGCTTTTAGGCATCAGGATTA (5' — 3')；
p65 正向引物AAAGGATCCATGGCAAAAGAA (5' — 3')，
d65 反向引物=CCCAAGCTTAATCCTGCTTGAh' —3')；
2)利用三個引物對將豬肺炎支原體的p46蛋白基因片斷中210bp、303bp和662bp 處的堿基A人工定點突變?yōu)閴A基G，所用引物對的DNA序列如下所示
正向引物AATCCTCGATGGATTAGTGCCC—3')，
反向引物CCATCGAGGATTATCCGGAT(5' — 3')；
正向引物CAAAATAACTGGCTCACTCAG(5' — 3')，
反向引物CCAGTTATTTTGTGCATCCTG(5' — 3')；
正向引物TCCCAGGATGGAATTATGGAA(5' — 3')，
反向引物CCATCCTGGGACATAAACAGC(5' — 3')；
利用一個引物對將豬肺炎支原體的p65蛋白基因片斷633bp處的堿基A人工定點 突變?yōu)閴A基G，所用引物對的DNA序列如下所示
正向引物CCCTTGTAAATTGGCTTGTTAAA(5' — 3')，
反向引物CCCCCAATTTACAATTTCATTAT(5' — 3')；
3)用上述突變之后的重組質(zhì)粒pGEX-46和pGEX_65轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM105，進行PCR 和酶切鑒定并測序。將突變正確的菌株命名為大腸桿菌(Escherichia coli)pGEX-KG-46 和pGEX-KG-65，于2011年08月22日送交湖北省武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏 中心(CCTCC)保藏，其保藏編號分別為CCTCC NO M2011294 ；CCTCC NO :M2011295 (其詳細 構(gòu)建過程參見圖2)。
將上述重組的大腸桿菌經(jīng)IPTG誘導后收集菌體進行超聲波破碎提取豬肺炎支原 體p46蛋白和p65蛋白，所提取的p46蛋白和p65蛋白經(jīng)過親和層析純化后可用于制備檢 測豬肺炎支原體間接ELISA抗體檢測試劑盒。
申請人獲得兩種能分別原核表達豬肺炎支原體主要免疫原性膜蛋白p46和p65的 基因片段，將編碼色氨酸的密碼子TGA定點突變?yōu)門GG，p46蛋白和p65蛋白的基因片段的 核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1，表SEQ ID N0:3所示。
申請人利用所述的兩株重組菌株pGEX-KG-46和pGEX_KG_65所表達純化的p46蛋 白和P65蛋白為包被抗原制備成間接ELISA核心試劑，組裝了一種用于快速檢測適用于豬 群的豬肺炎支原體間接ELISA抗體檢測試劑盒。本發(fā)明的試劑盒是由包被板、樣品稀釋液、 陽性對照血清、陰性對照血清、洗滌液、羊抗豬酶標二抗、底物顯色液A、底物顯色液B、終止 液，其中所述的包被板包被有由保藏號為CCTCC NO :M2011294和CCTCC NO M2011295的重 組的大腸桿菌pGEX-KG-46和pGEX-KG-65表達的p46和p65蛋白共同包被的抗原，所述的 樣品稀釋液、洗滌液、羊抗豬酶標二抗、底物顯色液A、底物顯色液B、終止液、陽性對照血清和陰性對照血清的成分和制備步驟如下所示
樣品稀釋液牛血清白蛋白5g、Tween-20 O. 5ml、氯化鈉8. Og,磷酸二氫鉀O. 2g, 十二水磷酸氫二鈉2. 9g,氯化鉀O. 2g和硫柳汞鈉O. 2g ;先用注射用水溶解并定容至 1000ml，再用O. 22 μ m濾膜過濾除菌，無菌分裝后置2 8°C保存?zhèn)溆茫?br> 濃縮洗滌液NaCl 170g, Tween-20 IOml ;加注射用水溶解并定容至1000ml，用 O. 22 μ m濾膜過濾除菌，得到20倍濃縮洗滌液，無菌分裝后置2 8°C保存?zhèn)溆茫?br> 羊抗豬酶標二抗將羊抗豬IgG-HRP酶標抗體，用保護劑按體積比1: 15000稀釋成工作濃度，再用O. 22 μ m濾膜過濾除菌，無菌分裝后置2 8°C保存?zhèn)溆茫?br> 底物顯色液A Na2HP04. 12H20 14. 6g、檸檬酸9. 33g、過氧化氫脲O. 52g，加注射用水溶解并定容至1000ml，調(diào)pH值至5. O 5. 4，用O. 22 μ m濾膜過濾除菌，無菌分裝后置 2 8°C保存?zhèn)溆茫?br> 底物顯色液B :四甲基聯(lián)苯胺20mg,加入無水乙醇IOml溶解,再用注射用水定容至 IOOOmL, O. 22 um濾膜過濾除菌，無菌分裝后置2 8°C保存?zhèn)溆茫?br> 終止液將2. 5ml氫氟酸加到900ml注射用水中，定容至IOOOmL,用O. 22 μ m濾膜過濾除菌，無菌分裝后置2 8°C保存?zhèn)溆茫?br> 保護劑BSA0. 5g、蔗糖2g，加注射用水溶解并定容至100ml，置2 8°C保存?zhèn)溆谩?br> 所述的陽性對照血清是感染豬支原體肺炎的豬血清；
所述的陰性對照血清是未感染豬支原體肺炎的豬血清。
本發(fā)明的主要優(yōu)點是
1、本發(fā)明的試劑盒能直接對豬肺炎支原體進行檢測，具有特異性強，靈敏度高，檢測時間短的特點，可用于豬肺炎支原體抗體的臨床大規(guī)模檢測和流行病學調(diào)查，具有廣闊的市場前景。
2、本發(fā)明將所需的各種試劑組裝成試劑盒，操作簡單易行，不需由專業(yè)人員操作。 本發(fā)明的試劑盒穩(wěn)定性好、保存期長，在2 8°C條件下放置半年不會影響其敏感性。
3、目前國內(nèi)市場上還沒有同時應(yīng)用Mhp的兩種功能蛋白作為包被抗原檢測豬肺炎支原體抗體的間接ELISA試劑盒。
更詳細的技術(shù)方案見實施例所述。


序列表SEQ ID NO :1是本發(fā)明克隆的豬肺炎支原體免疫原性膜蛋白p46的基因片段，序列全長為1260bp，在210bp、303bp和662bp處存在堿基的人工定點突變。
序列表SEQ ID NO :2是克隆的豬肺炎支原體免疫原性膜蛋白p46的基因片段編碼的蛋白質(zhì)的序列，它編碼419個氨基酸。
序列表SEQ ID NO :3是本發(fā)明克隆的豬肺炎支原體免疫原性膜蛋白p65的基因片段，序列全長為1803bp，存在一個A633-G633的人工定點突變。
序列表SEQ ID NO :4是克隆的豬肺 炎支原體免疫原性膜蛋白p65的基因片段編碼的蛋白質(zhì)的序列，它編碼600個氨基酸。
圖1 :本發(fā)明總體技術(shù)路線圖。
圖2 :本發(fā)明制備的能夠原核表達的p46和p65基因片段的流程圖。
圖3 :本發(fā)明擴增的p46和p65基因片段的PCR鑒定圖其中，圖3A p46片段的 PCR擴增的膠圖3B p65片段的PCR擴增的膠圖。
圖4 :本發(fā)明制備的p46基因210bp、303bp和662bp處A-G突變后的PCR鑒定圖和p65基因A633突變?yōu)镚633的PCR鑒定圖。其中，圖4A :突變后p46片段的PCR擴增的膠圖；圖4B :突變后p65片段的PCR擴增的膠圖。
圖5 :本發(fā)明制備的p46基因210bp、303bp和662bp處A-G突變后的重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖和P65基因A633突變?yōu)镚633的重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖。其中，圖5A p46經(jīng)定點突變后的酶切鑒定的膠圖；圖5B p65經(jīng)定點突變后的酶切鑒定的膠圖。
圖6 :本發(fā)明制備豬肺炎支原體p46基因和p65基因突變前后的BLAST圖。其中， 圖6A p46經(jīng)定點突變后的測序結(jié)果；圖6B p65經(jīng)定點突變后的測序結(jié)果。
圖7 :本發(fā)明制備的p46和p65重組蛋白的表達。其中，圖7A :p46蛋白表達的 SDS-PAGE分析；圖7B p65蛋白表達的SDS-PAGE分析。
圖8 :本發(fā)明制備的p46和p65重組蛋白的親和層析純化。其中，圖8A:重組p46 蛋白的SDS-PAGE分析；圖8B :重組p65蛋白的SDS-PAGE分析。
圖9 :本發(fā)明制備的p46和p65重組蛋白的Western-blot分析。其中，圖9A: ffestern-blot鑒定p46蛋白的表達；圖9B ffestern-blot鑒定p65蛋白的表達。
圖10 :本發(fā)明克隆的豬肺炎支原體免疫原膜蛋白p46和p65基因片段。括號內(nèi)顯示的是突變的堿基的位置。其中，圖1OA :p46基因片段；圖10B:p65基因片段。
具體實施方式
以下結(jié)合說明書附圖對本發(fā)明作進一步的說明，本發(fā)明的技術(shù)流程如圖1所示
實施例1豬肺炎支原體p46蛋白和p65蛋白的基因片段的克隆
1、豬肺炎支原體p46和p65蛋白基因片段的克隆方法見圖2所示。
制備能夠原核表達的p46基因片段所需的引物如表I所述。
表I制備能夠原核表達的p46基因片段所需的引物
權(quán)利要求
1.一種重組的大腸桿菌pGEX-KG-46和pGEX_KG_65，其特征在于，所述的大腸桿菌pGEX-KG-46和pGEX-KG-65保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號分別為CCTCC NO M2011294和CCTCC NO :M2011295，所述的大腸桿菌分別表達豬肺炎支原體主要免疫原性膜蛋白p46和p65，其編碼的蛋白質(zhì)的序列分別如序列表SEQ ID NO :2和SEQ ID N0:4所示。
2.—種重組的大腸桿菌pGEX-KG-46和pGEX_KG_65的制備方法，它包括下列步驟1)分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-46和pGEX-65，用如下所示的兩個引物對分別擴增豬肺炎支原體膜蛋白P46和p65的基因片斷，所述的p46和p65的基因片斷的核苷酸序列如SEQID NO 1 和 SEQ ID NO 3 所示；所用引物對的DNA序列分別如下所示p46 正向引物CCCGGATCCATGAAAAAAATGCTTA (5' — 3')，p46 反向引物CCCAAGCTITTAGGCATCAGGATTA (5' — 3')；p65 正向引物AAAGGATCCATGGCAAAAGAA (5' — 3')，p65 反向引物CCCAAGCTTAATCCTGCTTGAC —3');分別將其亞克隆至原核表達載體pGEX-KG上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-46和pGEX_65，其中重組質(zhì)粒pGEX-46包含如序列表SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列；重組質(zhì)粒pGEX_65包含如序列表SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列；2)利用三個弓I物對將豬肺炎支原體的P46蛋白基因片斷中2IObp、303bp和662bp處的堿基A人工定點突變?yōu)閴A基G，所用引物對的DNA序列如下所示其中擴增SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的210bp處堿基突變的引物對的DNA序列如下所示正向引物AATCCTCGATGGATTAGTGCC (5' — 3')，反向引物CCATCGAGGATTATCCGGAT(5' —3');擴增SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的303bp處堿基突變的引物對的DNA序列如下所示正向引物CAAAATAACTGGCTCACTCAG (5' — 3')，反向引物CCAGTTATTTTGTGCATCCTG (5; — 3')；擴增SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的662bp處堿基突變的引物對的DNA序列如下所示正向引物TCCCAGGATGGAATTATGGAA (5' — 3')，反向引物CCATCCTGGGACATAAACAGC (5' — 3')；利用一個引物對將豬肺炎支原體的P65蛋白基因片斷中633bp處的堿基A人工定點突變?yōu)閴A基G，所用引物對的DNA序列如下所示正向引物CCCTTGTAAATTGGCTTGTTAAA (5' — 3')，反向引物CCCCCAATTTACAATTTCATTAT (5' — 3')。
3.P46蛋白和p65蛋白的基因片段在表達豬肺炎支原體主要免疫原性膜蛋白中的應(yīng)用，其特征在于，所述的P46蛋白的基因片段的核苷酸序列如下所示ATGAAAAAAA TGCTTAGAAA AAAATTCTTG TATTCATCAG CTATTTATGC AACTTCGCTT
4.一種適用于豬肺炎支原體抗體檢測的間接ELISA試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括包被板、樣品稀釋液、陽性對照血清、陰性對照血清、洗滌液、羊抗豬酶標二抗、底物顯色液A、底物顯色液B、終止液，其中所述的包被板包被有由保藏號為CCTCC NO :M2011294和CCTCC NO M2011295的重組的大腸桿菌pGEX-KG-46和pGEX_KG_65表達的p46和p65蛋白共同包被的抗原，所述的樣品稀釋液、洗滌液、羊抗豬酶標二抗、底物顯色液A、底物顯色液B、終止液、陽性對照血清和陰性對照血清的成分和制備步驟如下所示樣品稀釋液牛血清白蛋白5g、Tween-20 O. 5ml、氯化鈉8. Og,磷酸二氫鉀O. 2g,十二水磷酸氫二鈉2. 9g，氯化鉀O. 2g和硫柳汞鈉O. 2g ;先用注射用水溶解并定容至1000ml，再用O. 22 μ m濾膜過濾除菌，無菌分裝后置2 8°C保存?zhèn)溆?；濃縮洗滌液NaCl 170g, Tween-20 IOml ;加注射用水溶解并定容至1000ml，用O.22 μ m濾膜過濾除菌，得到20倍濃縮洗滌液，無菌分裝后置2 8°C保存?zhèn)溆?；羊抗豬酶標二抗將羊抗豬IgG-HRP酶標抗體，用保護劑按體積比1: 15000稀釋成工作濃度，再用O. 22 μ m濾膜過濾除菌，無菌分裝后置2 8°C保存?zhèn)溆?；底物顯色液A =Na2HPO4. 12H20 14. 6g、檸檬酸9. 33g、過氧化氫脲O. 52g，加注射用水溶解并定容至1000ml,調(diào)pH值至5. O 5. 4,用O. 22 μ m濾膜過濾除菌,無菌分裝后置2 8°C保存?zhèn)溆?；底物顯色液B:四甲基聯(lián)苯胺20mg，加入無水乙醇IOml溶解，再用注射用水定容至IOOOmL, O. 22 μ m濾膜過濾除菌，無菌分裝后置2 8°C保存?zhèn)溆茫唤K止液將2. 5ml氫氟酸加到900ml注射用水中，定容至IOOOmL,用O. 22 μ m濾膜過濾除菌，無菌分裝后置2 8°C保存?zhèn)溆?；保護劑BSA0. 5g、蔗糖2g，加注射用水溶解并定容至100ml，置2 8°C保存?zhèn)溆谩Ｋ龅年栃詫φ昭迨歉腥矩i支原體肺炎的豬血清；所述的陰性對照血清是未感染豬支原體肺炎的豬血清。
5.權(quán)利要求1所述的大腸桿菌pGEX-KG-46和pGEX-KG-65表達的抗原蛋白在制備豬肺炎支原體間接ELISA抗體檢測試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于動物病毒學與動物傳染病學檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬肺炎支原體間接ELISA抗體檢測試劑盒及應(yīng)用。本發(fā)明通過基因工程重組技術(shù)得到兩株表達豬肺炎支原體p46蛋白和p65蛋白的重組的大腸桿菌pGEX-KG-46和pGEX-KG-65。本發(fā)明的試劑盒包括以突變后豬肺炎支原體膜蛋白P46和P65基因表達蛋白共同作為抗原包被的酶標板和其他核心試劑。本發(fā)明公開了豬肺炎支原體膜蛋白P46和P65基因的克隆，定點突變以及P46和P65蛋白的表達及純化方法。還公開了豬肺炎支原體間接ELISA抗體檢測方法。本發(fā)明制備的間接ELISA抗體檢測試劑盒可用于豬肺炎支原體抗體的臨床大規(guī)模檢測和流行病學調(diào)查，具有廣闊的市場前景。
文檔編號G01N33/531GK103018442SQ20111028691
公開日2013年4月3日 申請日期2011年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月23日
發(fā)明者何啟蓋, 馬豐英, 李燕, 庫旭鋼, 鄒浩勇, 陳煥春, 郭愛珍, 徐高原 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學, 武漢科前動物生物制品有限責任公司