專利名稱：應用底泥微生物數(shù)量預報復雜水環(huán)境綜合質量的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及水處理領域，具體地說是應用底泥微生物數(shù)量預報復雜水環(huán)境綜合質量的方法。
背景技術：
理化方法是水環(huán)境監(jiān)測與評價的主要方法，傳統(tǒng)的化學或物理指標能夠定量分析主要成分的含量，但是難于直接地、全面地反映這些成分的綜合影響。從20世紀80年代至今，生物學指標在水環(huán)境質量評價中應用日益廣泛，并以生命周期長、敏感程度高、綜合性能強的特點而成為不可或缺、甚至標準化的水質評價與監(jiān)測指標。迄今，魚、水生附著生物和應用最為廣泛的大型無脊椎動物構成了主要的水質評價與監(jiān)測生物類群，雖然對這些生物進行監(jiān)測可以更真實、全面地反映水環(huán)境的變化，但存在著時間滯后、難于量化、干擾生物的因素多等缺陷。因而，很有必要采用分布廣泛、更為敏感的水環(huán)境微生物來對復雜水環(huán)境的綜合質量進行監(jiān)測與評判。在水域生態(tài)系統(tǒng)中，微生物既是營養(yǎng)/污染物質的分解者和轉化者，又是物質/能量的貯存者，同時還是食物鏈的重要生產(chǎn)者。水環(huán)境微生物對水環(huán)境質量最為敏感，極易受其影響，水環(huán)境微生物的種類及組成會隨著水環(huán)境的污染程度而發(fā)生變化一般水環(huán)境質量退化或受損將對微生物的種類、數(shù)量產(chǎn)生負面影響，但某些耐性微生物種類在被污染環(huán)境后數(shù)量反而可能增加。一般來說，懸浮于水體的微生物只能表征水環(huán)境的瞬時質量；而穩(wěn)定的底泥是各種污染物質的最終貯存庫，可以為微生物提供一個長期的、完全不同的生態(tài)位，因此底泥微生物可以反應較長時期的水環(huán)境質量，應用底泥微生物可以對水環(huán)境的綜合質量/污染狀況起到更好的指示作用。傳統(tǒng)的微生物(形態(tài))分類學需要將不同種類的微生物分開進行實驗室純培養(yǎng)， 結果可能只有< 的好氧型種類能夠存活下來，而大多數(shù)的厭氧種類因為不能獲得嚴格的厭氧生境而死亡，因此僅僅依靠傳統(tǒng)的形態(tài)學分類有時候可能會導致錯誤的結論。20世紀80年代以來，利用分子生物學手段可以史無前例地檢測到復雜微生物類群中基因型/表型多樣性的詳細信息，但是很多、甚至大多數(shù)鑒定出來的微生物不能進行實驗室純培養(yǎng)，因而無法研究其生態(tài)功能或代謝機理，有時候微生物種類之間邊緣基因的交換還可能迷惑分子生物學手段的鑒定、分類結果。因此，盡管分子生物學手段可以鑒定出各種好氧或厭氧的微生物種類，但由于缺乏關于其生理生態(tài)方面的基本知識，也難于用來對所在生境的水環(huán)境質量進行評判。

發(fā)明內容
針對上述領域中的缺陷，本發(fā)明提供一種應用底泥微生物數(shù)量預報復雜水環(huán)境綜合質量的方法，通過指標及微生物數(shù)據(jù)來預告水環(huán)境的綜合質量，更全面，且更有現(xiàn)實意義。應用底泥微生物數(shù)量預報復雜水環(huán)境綜合質量的方法，包括如下步驟
(1)測定水域底泥的表層與亞表層的優(yōu)勢微生物數(shù)量，( 通過下式計算出評判水環(huán)境綜合質量的出現(xiàn)概率，P(bad)/P(medium) = Exp[-2. 987+8. 049X In(surf/sub)]P(good)/P(medium) = Exp[_0· 944-0. 269X In (surf/sub)]P (medium) = e0 = 1其中，P(bad)= “水環(huán)境綜合質量為差”事件的出現(xiàn)概率，P(good)= “水環(huán)境綜合質量為良”事件的出現(xiàn)概率，P (medium)= “水環(huán)境綜合質量為中”事件的出現(xiàn)概率，Surf =表層底泥中優(yōu)勢細菌種數(shù)，Sub =亞表層底泥中優(yōu)勢細菌種數(shù)。所述表層為深5cm的泥層，所述亞表層為深20cm的泥層。所述步驟(1)通過PCR-DGGE鑒定底泥表層與亞表層中的優(yōu)勢微生物的種類來實現(xiàn)。所述PCR-DGGE的方法步驟如下A、提取底泥中的微生物DNA，B、用采用通用引物對GC-F338和R518，PCR擴增目的片段，所述引物GC-F338 5' -CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GTAC GGG AGG CAG CAG-3‘，R518 5' -ATT ACC GCG GCT GCT GG-3'；C、DGGE電泳分離PCR產(chǎn)物，D、DGGE條帶的切膠回收后重新PCR，所述引物為F338和R518，所述引物F338 :5，-TAC GGGAGG CAG CAG-3 ‘，R518 5' -ATT ACC GCG GCT GCT GG-3'；E、回收二次PCR產(chǎn)物，與表達載體連接，轉化，培養(yǎng)，提取質粒，PCT檢測，所述PCR 檢測中所述引物為M13-47和RV-M，所述引物M13-47 5' -CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3‘，RV-M 5' -GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC ACA AGG-3‘。F、陽性質粒測序，確定所含微生物的種類。所述表達載體為Rndl8-T載體。所述轉化所用生物體為DH5 α感受態(tài)細胞。所述步驟還包括以水中化學指標評定的水環(huán)境綜合質量為參照。所述水中化學指標評定的水環(huán)境綜合質量的方法測定水中化學指標，與以 《GB3838-2002》V類為基準，計算各樣點對應的各項水質指標與V類標準值的商，而后將各商加權求均值，令GX = X/VX其中，GX為各水質指標與《GB3838-2002》V類標準之商，即TP/VTP、TN/Vtn、NH4-N/ Vra4_N、Cr/Vtt.....Pb/V Pb、Cd/Vcd ；VX為各水質指標對應的《GB3838-2002》V類標準；又令Gaverage = (GTP+GTNXO. 5+GNH4_NX 0. 5+GCr+. . . +GZn+GCu+GPb+GCd)/i其中，i為水質指標數(shù)量；進而進行評判分級，具體如下GIII/V = (mTP/VTP+mTN/VTNX0.5+IIINH4_N/VNH4_NX0.5+IIICr/VCr+...+IIIZn/Vzn+III Cu /Vcu+III Pb /Vpb+III Cd /Vcd)/i ；GV/V = (VTP/VTP+VTN/VTNX0. 5+VNH4_N/VNH4_NX 0. 5+VCr/VCr+. · · +VZn/VZn+VCu/VCu+VPb/ VPb+Vcd/Vcd)/i = 1 ；GB/V = (Btp/Vtp+Btn/VtnX0. 5+Bnh4_n/Vnh4_nX0. 5+BCr/VCr+. · · +BZn/VZn+BCu/VCu+BPb/ VPA/Vcd)/L其中，B為《GB18918-2002》一級(B)標準，若(Average < GIII/V，水環(huán)境綜合質量判為優(yōu)；若 GIII/V < Gaverage < GV/V，判為良；若 GV/V < Gaverage < GB/V，判為中； 若(^average > GB/V，判為差。本發(fā)明的方法具體如下一、應用化學指標對水環(huán)境綜合質量進行評判，作為對照。參考“地表水環(huán)境質量標準(GB3838_20(^)，，和“城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標準 (GB18918-2002) ”的分級標準與對應功能，首次建立了適宜各種水質、各類水體的復雜水環(huán)境質量綜合評價模式，具體如下。以《GB3838-2002》V類為基準，計算各樣點對應的各項水質指標與V類標準值的商，而后將各商加權求均值。令GX = X/VX其中，GX為各水質指標與《GB3838-2002》V類標準之商，即TP/VTP、TN/Vtn、NH4-N/ Vra4_N、Cr/Vtt.....Pb/V Pb、Cd/Vcd ；VX為各水質指標對應的《GB3838-2002》V類標準。又令Gaverage = (GTP+GTNXO. 5+GNH4_NX 0. 5+GCr+. . . +GZn+GCu+GPb+GCd)/i其中，i為水質指標數(shù)量。進而進行評判分級，具體如下。GIII/V = (mTP/VTP+mTN/VTNX0.5+IIINH4_N/VNH4_NX0.5+IIICr/VCr+...+IIIZn/
Vzn+III Cu /Vcu+ΠΙ Pb /Vpb+III Cd /VJ/i ；GV/V = (VTP/VTP+VTN/VTNX0. 5+VNH4_N/VNH4_NX 0. 5+VCr/VCr+. · · +VZn/VZn+VCu/VCu+VPb/ VPb+Vcd/Vcd)/i = 1 ； GB/V = (Btp/Vtp+Btn/VtnX 0. 5+BNH4_N/VNH4_NX 0. 5+BCr/VCr+. · · +BZn/VZn+BCu/VCu+BPb/ VPb+Bcd/Vcd)/i其中，B為((GB18918-2002)) 一級(B)標準。因此，若(Average < GIII/V，水環(huán)境綜合質量判為優(yōu)；若GIII/V < Gaverage < GV/V,判為良；若 GV/V < Gaverage < GB/V,判為中；若 Gaverage > GB/V,判為差(劣于城鎮(zhèn)污水處理廠出水)。二、應用PCR-DGGE手段對底泥微生物進行鑒定采集底泥樣品放入_20°C冰箱保存待用。1.提取底泥中的微生物基因組DNA具體操作參照Fast DNA SPIN Kit for Soil 試劑盒步驟(www.mpbio.com)。2. PCR擴增目的片段采用GC-F338引物(其中通用引物F338R518由博邁得生物公司設計合成，并根據(jù) DGGE電泳的分離特點在F338端加入一段GC夾子)、通過PCR將所需16SRNA片段擴增出來， 所得PCR產(chǎn)物為長度在ISObp左右的片段。
引物 GC-F338 5' -CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GTAC GGG AGG CAG CAG-3‘，R518 :5，-ATT ACC GCG GCT GCT GG—3，。3. PCR產(chǎn)物的純化具體操作步驟參照PCR產(chǎn)物純化試劑盒說明書(北京博邁得公司產(chǎn)品)。4. DGGE電泳分離PCR產(chǎn)物DGGE電流分離的原理在于，根據(jù)基因基序列的不同而將DNA序列分開。在雙鏈的 DNA分子中，A-T堿基之間有2個氫鍵，而G-C堿基之間有3個氫鍵連接，因此A-T堿基對對變性劑的耐受性要低于G-C堿基對。由于這4種堿基的組成和排列差異，使不同序列雙鏈DNA分子具有不同的解鏈溫度。當雙鏈DNA片段在含有梯度變性劑(尿素、甲酞胺)的聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，解鏈的速度、程度與其序列密切相關，當某一雙鏈DNA序列遷移到變性凝膠的一定位置、并達到解鏈溫度時，即開始部分解鏈，部分解鏈的DNA片段的遷移速度隨解鏈程度的增大而減小，從而使不同序列的DNA片段滯留于凝膠的不同位置，經(jīng)過染色后凝膠形成為指紋帶譜。理論上，只要選擇的電泳條件(變性劑梯度、電泳時間、電壓等)足夠精細，僅有單一堿基差異的DNA片段也可能夠被分開。5. DGGE條帶的切膠回收將DGGE凝膠的清晰條帶，用消毒鑷子切下，條帶盡量切得細膩均勻，將切膠條帶置于一個干凈的EP管中，并加入40 μ L無菌水，4°C、放置12 Mh。6. DGGE條帶的切膠回收后的重新PCR以第5步的無菌水為模板，擴增引物使用F338和R518。引物 F338 5' -TAC GGG AGG CAG CAG-3‘，R518 :5，-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3，。7.重新PCR產(chǎn)物的回收(使用博邁得試劑盒純化)具體操作步驟參照北京博邁得生物公司凝膠回收純化試劑盒說明書。8.第7步回收產(chǎn)物與Rndl8-T載體(Takara)的連接。9.轉化DH5a感受態(tài)細胞。10.挑取白色的單菌落，搖菌，提取質粒，PCR檢測。11.陽性樣品送公司測序(測序工作由北京博邁得生物公司完成)。由于對常規(guī)的PCR-DGGE常規(guī)方法進行了優(yōu)化，因為其檢測的優(yōu)勢細菌種數(shù)目與實際存在的更接近。三、應用底泥微生物數(shù)量對復雜水環(huán)境綜合質量進行預報水環(huán)境底泥表層(5cm)與亞表層QOcm)底泥中優(yōu)勢細菌種數(shù)比是表征水環(huán)境質量的關鍵因子，并存在如下量化關系。P(bad)/P(medium) = Exp[-2. 987+8. 049X In(surf/sub)]
P(good)/P(medium) = Exp[_0· 944-0. 269X In (surf/sub)]P (medium) = e0 = 1其中，P (bad)= “水環(huán)境綜合質量為差”事件的出現(xiàn)概率，P (good)= “水環(huán)境綜合質量為良”事件的出現(xiàn)概率，POiiedium)= “水環(huán)境綜合質量為中”事件的出現(xiàn)概率。Surf =表層底泥(深5cm)中優(yōu)勢細菌種數(shù)，Sub =亞表層底泥(深20cm)中優(yōu)勢細菌種數(shù)。本發(fā)明具有如下優(yōu)點
1.本申請以最新國家標準一《地表水環(huán)境質量標準(GB3838_20(^)》為基礎，既有中國特色，也符合我國國情；并且引入了《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標準 (GB18918-2002)》相關標準，適用范圍寬，從清潔水體到重度污染的水環(huán)境均可作為參照適用。2.本申請選用的水質理化指標數(shù)量及選項并不固定，可根據(jù)評判目的、有選擇性地從國家相關標準中選??；計算結果既有定量化的水環(huán)境綜合質量指數(shù)，也可以根據(jù)國家標準計算結果進行定性評判，而且該評判標準還可以隨著國家標準的更新而更新，具有很強的適應性和生命力。3.水環(huán)境中雖然微生物種類繁多，但是占總類群大多數(shù)的厭氧種類無法在常規(guī)實驗條件下按照傳統(tǒng)模式進行純培養(yǎng)；分子生物手段雖然可以鑒定出微生物種類，但是往往只能對優(yōu)勢微生物定性鑒定、難于知曉其生態(tài)功能；即使是可以純培養(yǎng)的菌種，往往也只能查找到該菌種所在屬、科的生理特征、生態(tài)功能，由于同科/屬菌種之間可能存在的巨大差異，也就難于依據(jù)生理特征或生態(tài)功能來評判其所在生境的水環(huán)境質量。本申請繞開了菌種純培養(yǎng)、菌種生理特征或生態(tài)功能這些數(shù)據(jù)溝壑或技術壁壘，直接采用優(yōu)勢細菌種數(shù)作為考查指標，首次成功找到了河流底泥優(yōu)勢細菌種類與水環(huán)境質量之間的量化響應關系， 突破了微觀分子生物學研究與宏觀水環(huán)境質量評價之間的傳統(tǒng)鴻溝。


(填寫下面的圖名稱，及把詳細的信息放置有圖名下面。圖 1 基因組提取從左至右 94# 97# 20# 76# 83# 86# 78# 62# 175a 64a 79a 67# 77# I #表示樣點包括表層和亞表層，a表示表層b表示亞表層圖2 基因組PCR 從左至右20# 62# 76#圖 3 液體純化從左至右 39# 123# 20# 35# 62# 64# 76# 79# 83# 86# 94# 97# 175a圖4 DGGE電泳圖譜圖 5 DGGE 后 PCR 從左至右 6 (bl b2 b3 b4 abl ab2 ab3 ab4 ab5 ab6 ab7 ab8 ab9 ablO)64#(la_8a)括號內與DGGE切膠條帶對應，a代表表層b代表亞表層ab表示表層和亞表層共有。圖 6 固體純化從左至右 35# (abl ab2 bl b2 ab3 b3 ab4)62#(bl b2 b3 b4 abl ab2 ab3 ab4 ab5ab6 ab7 ab8 ab9 ablO)括號內與DGGE切膠條帶對應，a代表表層b代表亞表層ab表示表層和亞表層共有。圖7克隆后菌落圖 8 菌落 PCR 從左至右 175#(la_6a)62#(bl b2 b3 b4 abl ab2 ab3 ab4 ab5 ab6 ab7 ab8 ab9abl0)括號內與DGGE切膠條帶對應，a代表表層b代表亞表層ab表示表層和亞表層共有圖9測序圖譜(北京博邁得生物公司)
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。實施例1
一、根據(jù)水質化學指標對某樣點(潮白河62#)水環(huán)境綜合質量進行評判
在潮白河北京段，采集水樣并分析TP、TN、NH3-N, Cr、Zn、Cu、Pb、Cd指標如表1所示。
表1湖白河北京段某樣點水質
權利要求
1.應用底泥微生物數(shù)量預報復雜水環(huán)境綜合質量的方法，包括如下步驟(1)測定水域底泥的表層與亞表層的優(yōu)勢微生物數(shù)量，( 通過下式計算出評判水環(huán)境綜合質量的出現(xiàn)概率，P(bad)/P (medium) = Exp[-2. 987+8. 049X In(surf/sub)]， P(good)/P(medium) = Exp[-0. 944-0. 269X In(surf/sub)]， P (medium) = e0 = 1，其中，P(bad)= “水環(huán)境綜合質量為差”事件的出現(xiàn)概率，P(good)= “水環(huán)境綜合質量為良”事件的出現(xiàn)概率，P(medium)= “水環(huán)境綜合質量為中”事件的出現(xiàn)概率，Surf = 表層底泥中優(yōu)勢細菌種數(shù)，Sub =亞表層底泥中優(yōu)勢細菌種數(shù)。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，所述表層為深5cm的泥層，所述亞表層為深20cm的泥層。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，所述步驟(1)通過PCR-DGGE鑒定底泥表層與亞表層中的優(yōu)勢微生物的種類來實現(xiàn)。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，所述PCR-DGGE的方法步驟如下A、提取底泥中的微生物DNA，B、用采用通用引物對GC-F338和R518，PCR擴增目的片段，所述引物 GC-F338 5' -CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GTAC GGG AGG CAG CAG-3‘，R518 5' -ATT ACC GCG GCT GCT GG-3'；C、DGGE電泳分離PCR產(chǎn)物，D、DGGE條帶的切膠回收后重新PCR，所述引物為F338和R518， 所述引物 F338 :5，-TAC GGG AGG CAG CAG-3‘，R518 5' -ATT ACC GCG GCT GCT GG-3'；E、回收二次PCR產(chǎn)物，與表達載體連接，轉化，培養(yǎng)，提取質粒，PCT檢測，所述引物為 Ml3-47 和 RV-M，所述引物 M13-47 5' -CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3‘， RV-M 5' -GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC ACA AGG-3‘。F、陽性質粒測序，確定所含微生物的種類。
5.根據(jù)權利要求4所述的方法，所述表達載體為RiidlS-T載體。
6.根據(jù)權利要求4所述的方法，所述轉化所用生物體為DH5α感受態(tài)細胞。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，所述步驟還包括以水中化學指標評定的水環(huán)境綜合質量為參照。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，所述水中化學指標評定的水環(huán)境綜合質量的方法a、 測定水中化學指標，b、與以《GB3838-2002》V類為基準，計算各樣點對應的各項水質指標與 V類標準值的商，而后將各商加權求均值，令 GX = X/VX其中，GX為各水質指標與《GB3838-2002》V類標準之商，即TP/Vtp、TN/Vtn、NH4_N/Vnh4_n、 Cr/Vcr, · · ·、Pb/V Pb、Cd/Vcd ；VX 為各水質指標對應的((GB3838-2002)) V 類標準； 又令 Gaverage = (GTP+GTNXO. 5+GNH4_NX0. 5+GCr+. . . +GZn+GCu+GPb+GCd)/i其中，i為水質指標數(shù)量； C、進而進行評判分級，具體如下GIII/V = (IIITp/VTp+IIITN/VTNX0. 5+III冊4_N/V冊4_ΝΧ0· 5+IIICr/VCr+. · · +IIIzn/Vzn+III Cu /Vcu+ΠΙ Pb /Vpb+III Cd /VJ/i ；GV/V = (VTP/VTP+VTN/VTNX0. 5+V刪/V刪 X0. 5+VCr/VCr+. · · +Vzn/Vzn+Vcu/Vcu+Vpb/Vpb+Vcd/Vcd)/i = 1 ；GB/V = (Btp/Vtp+Btn/VtnX0. 5+B麗4_n/V麗4_nX0. 5+BCr/VCr+. · · +Bzn/Vzn+Bcu/Vcu+Bpb/Vpb+Bcd/Vcd)/i ；其中，B為《GB18918-2002》一級(B)標準，若(Average < GIII/V，水環(huán)境綜合質量判為優(yōu)；若 GIII/V < Gaverage < GV/V，判為良；若 GV/V < Gaverage < GB/V，判為中；若 Gaverage > GB/V，判為差。
全文摘要
本發(fā)明的應用底泥微生物數(shù)量預報復雜水環(huán)境綜合質量的方法屬于水處理領域。本發(fā)明通過PCR-DGGE手段鑒定了底泥優(yōu)勢細菌種類；最終找到了表層、亞表層底泥優(yōu)勢細菌種類的數(shù)量比對水環(huán)境綜合質量的量化響應關系，突破了微觀分子生物學研究與宏觀水環(huán)境質量評價之間的傳統(tǒng)鴻溝，能適用各類水體、各種污染程度的復雜水環(huán)境綜合質量預報與評判。同進依據(jù)我國水環(huán)境質量相關國家標準，建立了復雜水環(huán)境綜合質量定量/性化評判模式以用于參照，該參照也能獨立預測水環(huán)境綜合質量的情況。
文檔編號G01N33/18GK102507885SQ20111029415
公開日2012年6月20日 申請日期2011年9月28日 優(yōu)先權日2011年9月28日
發(fā)明者單保慶, 靖德兵 申請人:首都師范大學