專利名稱：改進的組織細胞染色方法及其應用的制作方法
改進的組織細胞染色方法及其應用技術領域
本申請涉及組織學與細胞學染色方法及其應用，特別涉及宮頸鱗狀上皮細胞染色 方法及其應用。
背景技術：
宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率居全球女性惡性腫瘤的第二位，每年 均有50萬宮頸癌新發(fā)病例,其中80%的病例發(fā)生在發(fā)展中國家。在中國每年有新發(fā)病例 13. 15萬例，占世界宮頸癌新發(fā)病例總數的28. 8%。近年來，有研究發(fā)現宮頸癌的年輕病例 數有逐年增加的趨勢，發(fā)病年齡呈年輕化趨勢，而且宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有一個量變、漸變 到突變的過程，因此，早期發(fā)現、早期診斷及早期的治療宮頸癌，可降低其發(fā)病率和病死率。 篩查是目前預防和早期診斷子宮頸癌的主要手段。
自20世紀40年代George Papanicolaou的細胞涂片巴氏染色法(Pap-test) 誕生以來，持續(xù)40年的巴氏5級分類法使子宮頸癌的發(fā)病率降低70% -80%，同時因 其成本效益比高在發(fā)展中國家應用非常普及。但是由于受諸多因素影響，巴氏染色法 的假陽性率和假陰性率過高。近年來發(fā)明了很多新方法和新技術，包括液基薄片技術 (Thin Prep, Liquid-BasedMonolayers TCT)-旨在改進制片質量的技術；突光檢視法 (Speculoscopy)-應用化學發(fā)光放大技術結合Pap的方法；雜交捕獲2 (Hybrid Capture 2)技術(HC2)-檢測人乳頭狀瘤病毒(HPV)的DNA的技術；以及用免疫細胞化學法 (Immunocytochemical)檢測pl6INK4a蛋白。盡管如此，巴氏染色法仍是目前篩查宮頸癌的 主要手段。
發(fā)明概述
第一方面，本文涉及改進的宮頸鱗狀上皮細胞染色方法，包括
對所述宮頸鱗狀上皮細胞進行酸性磷酸酶染色；以及
對所述宮頸鱗狀上皮細胞進行巴氏染色。
第二方面，本文涉及改進的宮頸鱗狀上皮細胞染色試劑盒，包括
細胞酸性磷酸酶染色的試劑；以及
巴氏染色試劑。
第三方面，本文涉及診斷個體宮頸鱗狀上皮細胞癌的方法，所述方法包括，
收集個體的宮頸鱗狀上皮細胞樣品，
固定所述樣品，
對所述宮頸鱗狀上皮細胞進行酸性磷酸酶染色，
對所述宮頸鱗狀上皮細胞進行巴氏染色，以及
由病理學專業(yè)技術人員根據顯色結果判斷細胞是否為癌細胞或癌前病變。
第四方面，本文涉及個體宮頸鱗狀上皮細胞癌的診斷試劑盒，所述試劑盒包括，
固定個體的宮頸鱗狀上皮細胞樣品的試劑；
細胞酸性磷酸酶染色的試劑；
巴氏染色試劑，以及
任選地包括指導病理學專業(yè)技術人員對染色細胞進行判斷的說明書。
第五方面，本文涉及特殊的固定液，所述固定液包含
A液檸檬酸鈉緩沖液；和
B液丙酮、甲醛混合工作液。


圖1、圖2為傳統巴氏染色顯示的正常鱗狀上皮細胞(圖1、圖2分別為20X和 40X)。因鱗狀上皮細胞的嗜酸性和嗜堿性的不同而呈現出不同的顏色。
圖3、圖4為改進型巴氏染色顯示的正常鱗狀上皮細胞(圖3、圖4分別為IOX和 20X)。
圖5、圖6為酸性磷酸酶染色結合改進的巴氏染色的新方法染色顯示的意義不明 的不典型鱗狀細胞(ASC-US)。
圖7為酸性磷酸酶染色結合改進的巴氏染色的新方法染色顯示鱗狀上皮細胞早 期異常。
圖8為酸性磷酸酶染色結合改進的巴氏染色的新方法染色顯示鱗狀上皮細胞癌 性病變(SCC)。
圖9顯示Hela細胞經傳統固定液固定后的酶染色。
圖10顯示Hela細胞經特殊固定液固定后的酶染色。
實施方案詳述
發(fā)明人驚奇地發(fā)現，利用細胞化學染色方法檢測宮頸細胞酸性磷酸酶(CAP)活性 同時結合改進的巴氏染色技術，能夠改善宮頸鱗狀上皮細胞異常的染色效果。
據此，第一方面，本文涉及改進的宮頸鱗狀上皮細胞染色方法，包括
對所述宮頸鱗狀上皮細胞進行酸性磷酸酶染色；以及
對所述宮頸鱗狀上皮細胞進行巴氏染色。
第二方面，本文涉及改進的宮頸鱗狀上皮細胞染色試劑盒，包括
細胞酸性磷酸酶染色的試劑；以及
巴氏染色試劑。
第三方面，本文涉及診斷個體宮頸鱗狀上皮細胞癌的方法，所述方法包括，
收集個體的宮頸鱗狀上皮細胞樣品；
固定所述樣品；
對所述宮頸鱗狀上皮細胞進行酸性磷酸酶染色；
對所述宮頸鱗狀上皮細胞進行巴氏染色；以及
由病理學專業(yè)技術人員根據顯色結果判斷細胞是否為癌細胞或癌前病變。
第四方面，本文涉及個體宮頸鱗狀上皮細胞癌的診斷試劑盒，所述試劑盒包括，
固定樣品的試劑；
細胞酸性磷酸酶染色的試劑；
巴氏染色試劑，以及
任選地包括指導病理學專業(yè)技術人員對染色細胞進行判斷的說明書。
第五方面，本文涉及特殊的固定液，所述固定液包含
A液檸檬酸鈉緩沖液；和
B液丙酮、甲醛混合工作液。
在一個實施方案中，所述宮頸鱗狀上皮細胞包括正常的、異常的、癌變的宮頸鱗狀 上皮細胞及其癌前病變。在另一實施方案中，所述異常、癌變或癌前病變宮頸鱗狀上皮細胞 包括，不典型鱗狀細胞(ASC)，其包含(i)意義不明的不典型鱗狀細胞(ASC-US)，(ii)不除 外上皮內高度病變的不典型鱗狀細胞(ASC-H);低度鱗狀上皮病變(LSIL);高度鱗狀上皮 病變(HSIL);鱗狀細胞癌(SCC)。
本文所用術語“個體”指哺乳動物，包括人和其他哺乳動物。在本文中，術語“個 體”與“患者”可以交叉使用，尤其指雌性哺乳動物或女性患者。
在一個實施方案中，用于所述方法和試劑盒中的巴氏染色試劑包含三種染色液， 即蘇木精染色液、橘黃G(OG)染色液和EA (Eosin Azure)染色液。
在一個實施方案中，所述蘇木精染色液可以是Harris蘇木精染色液或Gill改良 蘇木精染色液。在另一實施方案中，所述蘇木精染色液由0.6% (w/v)蘇木精、O. 06% (w/ v)碘酸鈉、5. 28 (w/v)硫酸招、25% (v/v)乙醇、6% (v/v)冰醋酸和余量的水組成。
在一個實施方案中，所述橘黃G染色液為0G-6。在一個具體的實施方案中，所 述0G-6染色液由O. 3% (w/v)橘黃G、0. 015% (w/v)磷酸鎢水合物、4. 05% (v/v)甲醇、 80. 95% (v/v)乙醇以及去離子水組成。
在一個實施方案中，所述EA染色液由伊紅、亮綠等染料配成，可以是EA36、EA50、 EA65或改良的EA染色液。在一個實施方案中所述EA-65染色液由O. 03% (w/v)淡綠SF淡 黃、O.1 % (w/v)伊紅、O. 2% (w/v)磷酸鶴、2% (v/v)冰醋酸、25% (v/v)純甲醇、70% (v/ V) 95%乙醇、以及余量的純水組成。
在一個實施方案中，本文所述EA染色液是改良的EA染色液，其由0.017% (w/v) 淡綠 SF、0. 05% (w/v)俾斯麥、O. 225% (w/v)伊紅、O. 2% (w/v)磷酸鶴、O. 05% (v/v)碳酸 鋰、4. 5% (v/v)甲醇、90. 5% (v/v)乙醇、和余量的去離子水組成。
在一個實施方案中，所述細胞內酸性磷酸酶的染色是基于細胞內的酸性磷酸酶在 酸性前提下，將基質中的磷酸萘酚AS-BI水解，釋放萘酚AS-BI，萘酚AS-BI與重氮鹽偶聯， 形成不溶性紅色沉淀，定位于胞質內而實現的。在一個實施方案中，用于所述酸性磷酸酶的 染色的試劑包含萘酚AS-BI磷酸鹽基液和石榴紅重氮鹽基液。在另一實施方案中，所述酸 性磷酸酶的染色的試劑還包含檸檬酸鈉緩沖液和亞硝酸鈉緩沖液。在一具體的實施方案 中，所述萘酚AS-BI磷酸鹽基液為15mg/ml溶于N，N-二甲基甲酰胺中。在一個具體的實施 方案中，所述石槽紅重氮鹽基液為10mg/ml固紅GBC (Fast Garnet GBC)溶于2-甲氧基乙醇 和鹽酸中。在一具體的實施方案中，所述醋酸鹽緩沖液的濃度為2. OmoI/L,pH = 5. O。在一 具體的實施方案中，所述亞硝酸鈉緩沖液為亞硝酸鈉40mg/ml溶于純水和TWeen20(0. 09% (v/v))。
在一實施方案中，本文所述的染色方法包括將固定之后細胞在包含萘酚AS-BI磷 酸鹽基液、石榴紅重氮鹽基液、檸檬酸鈉緩沖液和亞硝酸鈉緩沖液的染色試劑中進行酸性 磷酸酶的染色。在另一實施方案中，本文所述的染色方法包括將經酸性磷酸酶的染色的細 胞進行巴氏染色。
在一實施方案中，所述巴氏染色包括蘇木精染色的細胞核染色以及胞漿染色，胞漿染色在巴氏方法中亦稱為OG-EA染色，它包括橘黃G (OG)和EA兩部分染色。在一具體實施方案中，所述蘇木精染色液的浸染時間一般在3-5min。在另一實施方案中，所述蘇木精染色還包括分化和堿化過程，可以使用O. 25%,O. 5%或I %的鹽酸酒精分化以及飽和碳酸鋰或O. 5-3%氨水堿化，目的是分化掉胞漿上沾上的蘇木素及返藍，時間約數秒。
在一實施方案中，由于橘黃G是一種小分子染料，能夠很快地作用于胞漿，一般染色時間不宜過長，通常為l_3min。在一實施方案中，所述EA染色的染色時間為不高于3min。 在具體的實施方案中，本文所公開的改良的EA染色液的染色時間為10秒至lmin，或20至 50 秒，例如 10、20、30、40、50 和 60 秒。
在一些實施方案中，在實施本文所述的組織染色之前，對所述宮頸鱗狀上皮細胞進行固定。在一個實施方案中，用于固定細胞的固定液為常規(guī)的巴氏染色中的固定液，例如 95 %酒精。在另一實施方案中，標本涂片制片完成后，趁標本新鮮而又濕潤時，立即放入盛有95%酒精的固定缸內，固定15-30min。固定時間通常不超過I周。
在一實施方案中，所述用于固定細胞的固定液是本文公開的特殊固定液，其包括 A液和B液兩個部分，A液為檸檬酸鈉緩沖液，B液為丙酮、甲醛混合工作液。在一個具體的實施方案中，所述特殊固定液A液為O. 05-0. 2,0. 8-0. 15、或O. 1M/L的檸檬酸鈉緩沖液，？!1為2.0、2.5、3.0、3.5或4.0。在另一具體的實施方案中，所述特殊固定液B液含有 50% _70%、50%、55%、60%、65%或 70%丙酮和 O. 5-3%,O. 5,1. 0,1. 5,2. O、或 3. 0%福爾馬林(37-40%甲醛溶液)。在另一具體的實施方案中，所述特殊固定液A液為O. 1M/L的檸檬酸鈉緩沖液，pH為3. O ;所述特殊固定液B液含有70%丙酮和1. 0%福爾馬林。
在另一實施方案中，本文所述染色方法還包括對固定的樣品進行常規(guī)的透明和封片的步驟。
在一些實施方案中，使用本文公開的特殊固定液固定的樣品可在4°C冰箱里保存至少1-2周，在常溫下保存I周，而不明顯影響后續(xù)的染色效果和細胞形態(tài)。
在另一實施方案中，使用本文公開的特殊固定液能夠使得后續(xù)的染色效果更加清晰，尤其是能夠使得酸性磷酸酶的染色效果更加清晰。
在另一實施方案中，使用本文公開的特殊固定液能夠使固定的細胞不易從樣品涂片上脫落。
在一些實施方案中，本文所公開的方法或試劑盒，經臨床應用，與傳統巴氏染色法相比，診斷宮頸鱗狀上皮細胞癌或癌前病變的靈敏度提高。
在另一實施方案中，所述靈敏度提高至少約10%、20%或30%。
在一些實施方案中，本文所公開的方法或試劑盒，經臨床應用，與傳統巴氏染色法相比，診斷宮頸鱗狀上皮細胞癌或癌前病變的假陰性率降低。
在另一實施方案中，所述假陽性率降低至近5%或0%。
在另一些實施方案中，利用本文所公開的方法或試劑盒，可以發(fā)現宮頸鱗狀上皮細胞非常早期的異常變化。
在實施方案中，本文公開的改良的巴氏染色液及染色方法，使得巴氏染色結果在整體細胞染色上呈現出藍色背景，同時保持了巴氏染色對細胞結構及層次的染色效果，使得酸性磷酸酶的染色效果可以清晰的在改進后巴氏染色的效果下顯示出來。
利用這種技術檢測的結果顯示了異常宮頸鱗狀上皮細胞胞質內CAP有活性表達， 其效果顯示在經過改進的巴氏染色背景下，異常鱗狀上皮細胞胞漿內CAP活性表達呈現出 紅色顆粒狀的沉淀物，正常上皮細胞總是顯示陰性。這項研究明確了 CAP的活性表達在宮 頸上皮細胞異常增生的各個階段包括ASC-US、ASC-H、LSIL、HSIL和SCC都出現陽性。
本領域技術人員可以理解，本文公開的術語“一個實施方案”、“一實施方案” “另一 實施方案”、“ 一些實施方案”、“另一些實施方案”以及“具體的實施方案”，僅是為了說明的 目的，例舉了本文所公開發(fā)明的實施方式，并不是對所公開發(fā)明的限制。在能實現在本文所 公開的發(fā)明的情況下，本領域技術人員可以對其修改和替換。而且，在能實現本文所公開的 發(fā)明的情況下，上述實施方案中的元件、試劑、步驟和方法可以任意地組合和替換。
以下實施例是對所公開發(fā)明的示例性說明，并不能理解對所述發(fā)明的限制。實施例
標本來源
所有臨床標本均來源于安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，由該院專業(yè)技術人員根據婦 科常規(guī)操作采集標本并涂片。Hela細胞購自中國科學院上海生命科學研究院。
材料與方法
1.固定液
特殊固定液:包括A、B液兩個部分。
A液檸檬酸鈉緩沖液O. 1M/L，pH = 3. O
B液丙酮、甲醛混合工作液，即，29%雙蒸水、70%丙酮(acetone)和1%福爾馬林 (37-40% 甲醛)。
常規(guī)固定液:95%酒精或95%酒精與乙醚等量混合液。
2.酶化學染色液
包括A、B、C和D液
A 液醋酸鹽緩沖液2. OmoI/L, pH = 5. O
B液萘酚AS-BI磷酸鹽基液15mg/ml溶于N，N- 二甲基甲酰胺中
C液石槽紅重氮鹽基液10mg/ml固紅GBC(Fast Garnet GBC)溶于2_甲氧基乙 醇和鹽酸中
D液亞硝酸鈉緩沖液亞硝酸鈉40mg/ml溶于純水和Tween20 (O. 09% (v/v))。
3.巴氏染色液
改講型巴氏染色液
蘇木精染色液0. 6% (w/v)蘇木精、O. 06% (w/v)碘酸鈉、5. 28 (w/v)硫酸招、 25% (v/v)乙醇、6% (v/v)冰醋酸、余量的去離子水。
0G-6 染色液0. 3% (w/v)橘黃 G、0. 015% (w/v)磷酸鎢水合物、4. 05% (v/v)甲 醇、80. 95% (v/v)乙醇以及余量的去離子水。
改進型EA 染色液0. 017% (w/v)淡綠、O. 05% (w/v)俾斯麥、O. 225% (w/v)伊 紅、O. 2% (w/v)磷酸鶴、O. 05% (v/v)碳酸鋰、4. 5% (v/v)甲醇、90. 5% (v/v)乙醇、余量 的去離子水。
對照巴氏染色液
蘇木精染色液0. 6% (w/v)蘇木精、O. 06% (w/v)碘酸鈉、5. 28 (w/v)硫酸招、 25% (v/v)乙醇、6% (v/v)冰醋酸、余量的去離子水。
0G-6 染色液0. 3% (w/v)橘黃 G、0. 015% (w/v)磷酸鎢水合物、4. 05% (v/v)甲 醇、80. 95% (v/v)乙醇以及余量的去離子水。
常規(guī)EA-50染色液3%亮綠水溶液5ml、20%伊紅Y IOmUO. 2% (w/v)磷酸鎢lg、 冰醋酸10ml、純甲醇125ml、95%乙醇350ml?；旌虾蟮渭犹妓徜囷柡腿芤骸?br> 實施例1固定
常規(guī)固定
將涂片(未干時)放入95%酒精或95%酒精與乙醚等量混合液中固定至少15分鐘。
依次置入80%、70%、50%酒精內半分鐘。然后置入和蒸餾水中2分鐘以上。
特殊固定液固定
標本涂片固定取7. 5ml A液加42. 5ml B液混合成特殊固定液。迅速將標本涂 片放入所述固定液中50秒，取出立即在純化水缸中上下漂洗10次。可在4°C冰箱里保存2周。
實施例2染色
一、傳統巴氏染色步驟
(I)用蘇木素染色固定后的樣品涂片5-10分鐘，至胞核著色明顯為止，然后用蒸 餾水沖洗干凈。
(2)用O. 25%或O. 5%鹽酸酒精脫去胞漿內多余的蘇木素，至涂片轉為淡紅，即刻 用蒸餾水沖洗干凈，操作必須迅速，通常幾秒鐘。若脫色時間過長會使蘇木素全部消失。
(3)置飽和碳酸鋰溶液中堿化約I分鐘，至涂片轉為淡藍色，再用蒸餾水洗凈。
(4)依次置入50%、70%、80%酒精內半分鐘。然后置入95%酒精中至少2分鐘以 脫水。
(5)在橙黃G-6染液中染3分鐘。
(6)分別在兩個95%酒精缸中各上下漂洗6次。
(7)在EA-50染液中染2_3分鐘至胞漿著色鮮明為止。
(8)用95%酒精洗滌二、三次去掉多余的顏色，再置純酒精中去水，然后在二甲苯 中洗兩次，最后用樹膠封固。
二、新方法染色酶染色與改良巴氏染色結合的染色步驟
酸件磷酸酶染色
(I)在染色缸中加入46ml已加熱至37°C的去離子水，然后加入2. 5mlA液。在1.5ml或2ml離心管中加入10滴B液和10滴C液并輕搖30秒后放置在室溫下3分鐘,倒 入含A液的染色瓶中搖勻。
(2)將10滴D液加入步驟(I)的染色缸中混勻，將已固定標本涂片放入染色缸中 并蓋上缸蓋放入37 °C恒溫水浴箱中避光45分鐘。
(3)將標本涂片取出，在自來水下漂洗5分鐘，再在純水中漂洗一次后，轉到PBS緩 沖液中漂洗10次，再在自來水下輕輕漂洗一下。
改良的巴氏染代
(I)將酸性磷酸酶染色后的樣品涂片放入盛有蘇木精染色液的染色缸中5分鐘。
(2)取出標本片在自來水下漂洗后在O. 5%氨水(新鮮配制)缸中上下3次，自來 水漂洗，接著用純化水漂洗，再分別在50 %，70 %，80 %和95 %的酒精缸中各上下漂洗6次。
(3)將標本片放入含0G-6染色液的染色缸中3分鐘，分別在兩個95%酒精缸中各 上下漂洗6次。
(4)將標本片放入含改進型EA染色液的染色缸中15秒鐘，再分別在兩個95%酒 精缸中各上下漂洗6次。
(5)取出標本片在自來水下漂洗后在O. 5%氨水(新鮮配制)缸中上下3次。
(6)將標本片用自來水漂洗后放入含自來水的染色缸中放置I小時。取出待干后 封片即可讀片。
供病理學醫(yī)牛參考的診斷標準
1.由于在宮頸管內細胞包括腺細胞、柱狀細胞及單核細胞均含有高活性的酸性磷 酸酶表達，因此在評估NM-PAP染色結果時首先需從細胞形態(tài)學上加以區(qū)分并忽略。
2.對成熟上皮細胞、中層細胞及近基底層細胞胞漿中出現紅色顆粒狀沉淀物視為 陽性，同時根據其核的增大和異常依據2001年修訂的TBS分期加以分級
(I)不典型鱗狀細胞(ASC)
(I)意義不明的不典型鱗狀細胞(ASC-US)，
(II)不除外上皮內高度病變的不典型鱗狀細胞(ASC-H)；
(2)低度鱗狀上皮病變(LSIL)；
(3)高度鱗狀上皮病變(HSIL)；
(4)鱗狀細胞癌(SCC)。
3.建議對細胞形態(tài)變化輕微但有NM-PAP陽性表達同時陽性細胞數少于3個的病 例給予“上皮細胞早期輕微異?！钡脑\斷結果。
結果
圖1、圖2為傳統巴氏染色顯示的正常鱗狀上皮細胞。因鱗狀上皮細胞的嗜酸性和 嗜堿性的不同而呈現出不同的顏色。
圖3、圖4為單獨的改進型巴氏染色顯示的正常鱗狀上皮細胞?？梢娊y一的藍色背 景，細胞結構和層次清晰。
圖5、圖6為新方法染色顯示的意義不明的不典型鱗狀細胞(ASC-US)。從中清晰 可見異常細胞胞漿內有紅色顆粒狀沉淀物，胞核與正常細胞比較有明顯的增大。
圖7為新方法染色顯示鱗狀上皮細胞早期異常，整張涂片僅有此單個細胞異常， 可見胞漿紅色顆粒沉淀及胞核增大。
圖8為新方法染色顯示鱗狀上皮細胞癌性病變(SSC)，胞漿內密布紅色顆粒沉淀 物，胞核明顯增大。
圖9Hela細胞經傳統固定液(95%酒精)固定后的酶的顯色，其顯色不佳。
圖1OHela細胞經特殊固定液固定后的酶顯色，化學染色呈現紅色顆粒。
以上結果表明并經臨床驗證，本文公開的酸性磷酸酶染色結合改良的巴氏染色， 這種新的染色方法與傳統巴氏染色法相比，宮頸鱗狀上皮細胞癌或癌前病變的診斷敏感度 提高，可提高至約30%?；蛘?，本文公開的新的染色方法可使宮頸鱗狀上皮細胞癌或癌前病變的診斷的假陰性率降低至近0%。本文公開的新的固定液能夠進一步確保所述新的染色方法的上述效果，能縮短固定時間，或可以改進染色效果，例如改進酸性磷酸酶的染色效果。此外，所述新的方法還可以發(fā)現宮頸鱗狀上皮細胞非常早期的異常變化，這在傳統巴氏染色 方法的診斷中單純依據細胞形態(tài)學的變化幾乎無法實現。
權利要求
1.宮頸鱗狀上皮細胞染色方法，包括 利用細胞酸性磷酸酶染色的試劑對所述宮頸鱗狀上皮細胞進行酸性磷酸酶染色；以及 利用巴氏染色試劑對所述宮頸鱗狀上皮細胞進行巴氏染色。
2.宮頸鱗狀上皮細胞染色試劑盒，包括 細胞酸性磷酸酶染色的試劑；以及 巴氏染色試劑。
3.個體宮頸鱗狀上皮細胞癌的診斷試劑盒，所述試劑盒包括， 固定個體宮頸鱗狀上皮細胞樣品的試劑； 細胞酸性磷酸酶染色的試劑； 巴氏染色試劑，以及 任選地包括指導病理學專業(yè)技術人員對染色細胞進行判斷的說明書。
4.用于宮頸鱗狀上皮細胞染色的固定試劑，所述固定試劑包含 A液檸檬酸鈉緩沖液；和 B液丙酮、甲醛混合工作液。
5.如權利要求1所述方法、權利要求2所述試劑盒、權利要求4所述固定液，其中所述宮頸鱗狀上皮細胞包括正常的、異常的、癌變的宮頸鱗狀上皮細胞及其癌前病變。
6.權利要求1-5任一項所述方法、試劑盒或固定液,其中所述巴氏染色試劑包含蘇木精染色液、橘黃G(OG)染色液和EA(Eosin Azure)染色液，其中所述EA染色液是改良的EA染色液，其由 O. 017% (w/v)淡綠 SF、0. 05% (w/v)俾斯麥、O. 225% (w/v)伊紅、O. 2% (w/v)磷酸鶴、O. 05% (v/v)碳酸鋰、4. 5% (v/v)甲醇、90. 5% (v/v)乙醇、和余量的去離子水組成。
7.如權利要求1-6任一項所述方法、試劑盒或固定液，其中所述改良的EA染色液的染色時間為10秒至lmin，或20至50秒，例如10、20、30、40、50和60秒。
8.如權利要求1-5任一項所述方法或試劑盒，其中所述方法還包括對所述宮頸鱗狀上皮細胞染色之前，用固定試劑對所述宮頸鱗狀上皮細胞進行固定，或者，所述試劑盒還包括固定試劑。
9.如權利要求8所述方法或試劑盒，其中所述固定試劑是權利要求4所述固定試劑。
10.如權利要求所述9方法或試劑盒，其中所述 A 液為 O. 05-0. 2,0. 8-0. 15、或 O. 1M/L 的檸檬酸鈉緩沖液，pH 為 2. 0,2. 5,3. 0,3. 5或4. O ;和/或 所述 B 液含有 50% _70%、50%、55%、60%、65%或 70%丙酮以及 O. 5-3%,O. 5、L O、1.5,2. O、或3. 0%福爾馬林。
全文摘要
本發(fā)明涉及改進的宮頸鱗狀上皮細胞染色方法、試劑盒及其在診斷個體宮頸鱗狀上皮細胞癌方法中的應用。所述方法或試劑盒包括細胞酸性磷酸酶染色的試劑、以及改良的巴氏染色試劑及其應用。本發(fā)明還涉及診斷個體宮頸鱗狀上皮細胞癌或癌前病變的試劑盒。
文檔編號G01N1/30GK103033409SQ20111030218
公開日2013年4月10日 申請日期2011年10月9日 優(yōu)先權日2011年10月9日
發(fā)明者李戈, 趙艷梅 申請人:安徽新標志科技有限公司