專利名稱：一種dna烷化損傷的紅外光譜快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種DNA烷化損傷的紅外光譜快速檢測方法。
背景技術(shù)：
DNA損傷是癌癥等重大疾病發(fā)生的重要原因之一，導(dǎo)致DNA損傷的因素非常復(fù)雜， 如體內(nèi)代謝過程中產(chǎn)生的自由基和其它活潑中間體，DNA復(fù)制和重組過程中的自發(fā)錯誤，環(huán)境中的紫外線和離子輻射以及內(nèi)源和外源化學(xué)物質(zhì)等。在諸多 導(dǎo)致DNA損傷的因素中，活潑親電烷化劑作為一類重要的化學(xué)物質(zhì)能夠通過與細(xì)胞內(nèi)靶DNA作用，將單個(gè)烷基或復(fù)合的烷基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到DNA堿基的特殊位置上，引起堿基烷化損傷，并可進(jìn)一步導(dǎo)致堿基丟失、 核苷酸結(jié)構(gòu)變異以及DNA鏈發(fā)生斷裂、交聯(lián)，造成基因突變，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡或癌變。多種致癌物質(zhì)和臨床應(yīng)用的抗癌藥物都能夠?qū)е翫NA的烷基化損傷。環(huán)境中廣泛存在的亞硝胺、食品高溫加工過程中生成的丙烯酰胺以及汽車尾氣和卷煙煙氣中存在的1，3-丁二烯， 經(jīng)過代謝活化后均能夠生成烷基正離子與DNA堿基發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致DNA損傷并最終誘發(fā)癌癥。臨床上常用的烷化劑類抗癌藥物也是通過導(dǎo)致DNA堿基的烷基化而發(fā)揮抗癌作用，如用于治療腦瘤等的亞硝基脲類烷化劑、用于治療惡性淋巴瘤等的氮芥類烷化劑、用于治療白血病的甲基磺酸酯類烷化劑和用于治療卵巢癌的乙烯亞胺類烷化劑等。研究表明，烷化劑經(jīng)過代謝或分解生成的烷基正離子與DNA中堿基分子電子云密度較高的部位發(fā)生親電反應(yīng)，比如在鳥嘌呤的06或N7位形成烷化損傷，進(jìn)而導(dǎo)致DNA交聯(lián)或斷鏈。DNA烷化損傷作為癌癥發(fā)病的一種重要的分子標(biāo)志物，其檢測分析是癌癥防治、 分子生物學(xué)和生物化學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前，針對烷化劑導(dǎo)致DNA損傷的檢測方法主要包括熒光光譜、核磁共振和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等分析化學(xué)方法，以及凝膠電泳、彗星電泳和Southern印記雜交等生物化學(xué)和分子生物學(xué)方法。Bathaie等人(S. Z. Bathaie, et al. Spectrochim. Acta, Part A, 2008, 71 (3) :803 808)報(bào)道了鏈脲霉素導(dǎo)致的 DNA 烷化物的研究方法，該方法對抗癌藥物鏈脲霉素產(chǎn)生的DNA甲基化產(chǎn)物及其二級結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了分析。Zhou 等人(Q. Zhou，et al. Chem. Res. Toxicol. ,2011,24(3) :402 411) 報(bào)道了苯醌甲基化物導(dǎo)致DNA甲基化損傷的檢測方法，該方法使用凝膠電泳、質(zhì)譜和核磁對具有高至變性的苯醌甲基化物產(chǎn)生的DNA甲基化損傷產(chǎn)物進(jìn)行了研究。Garaguso等人(I.Garaguso，et al. Anal. Chem.，2010，82 (20) :8573 8582)報(bào)道了多環(huán)芳烴代謝物對DNA鳥嘌呤烷化損傷的質(zhì)譜分析方法，該方法使用基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜法對 DNA鳥嘌呤的烷化損傷產(chǎn)物進(jìn)行了定量檢測。Kakadiya等人(R. Kakadiya，et al. Bioorg. Med. Chem. ,2010,18(6) :2285 2299)報(bào)道了氮芥-喹啉結(jié)合物的DNA烷化產(chǎn)物的研究方法，該方法使用彗星電泳法對DNA的烷化損傷產(chǎn)物進(jìn)行了檢測。Janka等人(V. Janka， et al. Acta Histochemica，2011，113 :423 427)報(bào)道了甲基亞硝基脲(MNU)所導(dǎo)致的 DNA損傷的單細(xì)胞凝膠電泳檢測法，該方法對DNA損傷的程度進(jìn)行了定量分析。Penkenth 等人(P. G. Penkenth, et al, Biochem Pharmacol. ,2000,59(3) :283 291)報(bào)道了利用熒光光譜法對氯乙基亞硝基脲(CENU)導(dǎo)致的DNA損傷產(chǎn)物的研究，該方法證實(shí)CENU能夠通過多種途徑分解成活潑親電試劑，進(jìn)而導(dǎo)致DNA堿基烷化。Bodell等人(W.J.Bodell，et al. J. Neurooncol.，2009，91 257 264)報(bào)道了利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測 CENU烷基化產(chǎn)物，該方法檢測到CENU和DNA反應(yīng)后生成至少13種DNA烷化損傷產(chǎn)物。綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)中報(bào)道的DNA烷化損傷檢測方法雖然被廣泛應(yīng)用于致癌物和抗癌藥的毒理、藥理研究中，但均不適用于DNA烷化損傷的快速檢測，此外還各自仍存在以下不足之處(1)質(zhì)譜方法檢測DNA烷化損傷，樣品需經(jīng)過脫鹽、濃縮等復(fù)雜的前處理過程，而且質(zhì)譜儀器價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜、對分析環(huán)境要求高，實(shí)驗(yàn)成本高，無法實(shí)現(xiàn)樣品的回收利用；(2)熒光方法檢測DNA烷化損傷，需要特殊的熒光染料，易受樣品雜質(zhì)干擾，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性低，不能確定烷化位點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)過程不易于操作；(3)電泳方法檢測DNA烷化損傷，最顯著的缺點(diǎn)是靈敏度低、專屬性差，不能確定烷化位點(diǎn)，需要溴化乙錠等具有致癌性的染料，容易對人體產(chǎn)生危害且不符合環(huán)保要求；(4) Southern印跡雜交方法檢測DNA烷化損傷，靈敏度低、專屬性差，對DNA的樣品量和純度要求高，不能確定烷化位點(diǎn)，分析速度慢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種靈敏度高、專屬性強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)過程簡單且安全環(huán)保，樣品便于回收且能夠直接測定DNA烷化損傷位點(diǎn)及損傷程度的紅外光譜快速檢測方法。本發(fā)明所提供的一種DNA烷化損傷的紅外光譜快速檢測方法，包括以下步驟(1)稱取小牛胸腺DNA，溶于1 20mmol/L Tris-HCl溶液中，配制成濃度為4 10mg/mL的DNA溶液，pH值為7 8，向DNA溶液中加入烷化劑乙醇溶液，烷化劑的摩爾濃度為0. 25 15mmol/L，在37°C下反應(yīng)4 IOh ；(2)采用液膜法進(jìn)行紅外光譜測定設(shè)定掃描范圍4000 400CHT1，分辨率2 4CHT1，掃描次數(shù)100 500，采用氘化三甘氨硫檢測器(DTGS)和KBr分束器，首先將Tris-HCl溶液滴于非水溶性窗片上，干燥后作為背景掃描，再將DNA空白溶液滴于非水溶性窗片上，采用差減法扣除背景后掃描即可得到DNA空白溶液的紅外光譜圖，重復(fù)測定三次取平均值；(3)將與烷化劑反應(yīng)后的DNA樣品采用與步驟⑵中DNA空白溶液相同的方法進(jìn)行測定，得到DNA樣品溶液的紅外光譜圖，將得到的所有紅外譜圖使用大氣補(bǔ)償將空氣中 CO2和H2O的吸收峰扣除，最后進(jìn)行基線校正；(4)將步驟(3)中所得的DNA空白溶液和DNA樣品溶液的特征譜峰進(jìn)行比較，根據(jù)峰位和峰強(qiáng)比的變化確定DNA烷化損傷的位點(diǎn)和程度。上述步驟(1)中烷化劑為甲基亞硝基脲、乙基亞硝基脲、甲烷磺酸甲酯、甲烷磺酸乙酯、碘甲烷、碘乙烷、硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、甲基亞硝基胍或丙基亞硝基胍。上述步驟(2)中非水溶性窗片為AgBr、CaF2, ZnSe或KRS-5。上述步驟(2)中DNA空白溶液是指未加入烷化劑的DNA溶液。上述步驟(4)中特征峰的變化包括 (a)鳥嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1699 1701CHT1，表明鳥嘌呤發(fā)生了烷化損傷；(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1608 1609CHT1，表明腺嘌呤發(fā)生了烷化損傷；(c) 1088cm"1處和1228CHT1處磷酸基團(tuán)特征峰的峰強(qiáng)比1_/11228減小，表明磷酸基團(tuán)發(fā)生了烷化損傷。本發(fā)明方法與現(xiàn)有 方法相比，具有以下有益效果(1)操作方法簡單，無需復(fù)雜的樣品處理過程，可將反應(yīng)完的溶液直接進(jìn)行紅外光譜檢測，不需要對待測物質(zhì)進(jìn)行分離純化，便于推廣使用，而現(xiàn)有技術(shù)中的液質(zhì)聯(lián)用方法需要對樣品進(jìn)行酶解、離心過濾、色譜分離等復(fù)雜的前處理步驟；(2)檢測速度快，每次樣品掃描只需5分鐘即可完成，而現(xiàn)有技術(shù)中的液質(zhì)聯(lián)用方法需要8小時(shí)以上才能完成；(3)特異性強(qiáng)，靈敏度高，不同種類的DNA烷化損傷均可進(jìn)行檢測，而現(xiàn)有技術(shù)中的電泳方法靈敏度低、不能檢測損傷的位點(diǎn)，熒光方法只能檢測能夠與熒光探針特異結(jié)合的部分DNA烷化損傷；(4)本發(fā)明無需使用放射性元素和致癌性化學(xué)染料，消除了對實(shí)驗(yàn)人員的傷害，安全環(huán)保，而現(xiàn)有技術(shù)中的電泳方法需要使用溴化乙錠等致癌性化學(xué)染料，液質(zhì)聯(lián)用方法需要使用放射性同位素標(biāo)記；(5)該方法為無損檢測，樣品能夠回收利用，而現(xiàn)有技術(shù)中的電泳方法和熒光方法由于加入了化學(xué)染料，樣品不能直接回收利用，液質(zhì)聯(lián)用方法則對待測物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了破壞，無法回收利用。


圖1是DNA空白溶液的紅外光譜圖；圖2是與甲基亞硝基脲反應(yīng)后的DNA樣品溶液的紅外光譜圖；圖3是與乙基亞硝基脲反應(yīng)后的DNA樣品溶液的紅外光譜圖；圖4是與甲烷磺酸甲酯反應(yīng)后的DNA樣品溶液的紅外光譜圖；圖5是與甲烷磺酸乙酯反應(yīng)后的DNA樣品溶液的紅外光譜圖；圖6是與碘甲烷反應(yīng)后的DNA樣品溶液的紅外光譜圖；圖7是與碘乙烷反應(yīng)后的DNA樣品溶液的紅外光譜圖；圖8是與硫酸二甲酯反應(yīng)后的DNA樣品溶液的紅外光譜圖；圖9是與硫酸二乙酯反應(yīng)后的DNA樣品溶液的紅外光譜圖；圖10是與甲基亞硝基胍反應(yīng)后的DNA樣品溶液的紅外光譜圖；圖11是與丙基亞硝基胍反應(yīng)后的DNA樣品溶液的紅外光譜圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1(1)稱取50mg小牛胸腺DNA，溶于IOmL濃度為10mmol/L Tris-HCl溶液中，配制成濃度為5mg/mL的DNA溶液，pH值為7. 3，將甲基亞硝基脲(N-methyl-N_nitrosourea，MNU) 固體3mg溶于100 μ L乙醇中，配制成摩爾濃度為30mmol/L的MNU乙醇溶液，向ImL DNA溶液中加入25 μ L MNU乙醇溶液，此時(shí)反應(yīng)體系中MNU的摩爾濃度為7. 5mmol/L，在37°C下反應(yīng)4h ；(2)采用液膜法進(jìn)行紅外光譜測定
設(shè)定掃描范圍4000 400cm-1，分辨率4cm—1，掃描次數(shù)128次，采用氘化三甘氨硫檢測器(DTGS)和KBr分束器，首先將所配制濃度為lOmmol/L的Tris-HCl溶液滴于KRS-5 窗片上，干燥后作為背景掃描，再將DNA空白溶液滴于KRS-5窗片上，采用差減法扣除背景后掃描即可得到DNA空白溶液的紅外光譜圖，重復(fù)測定三次取平均值；(3)將與烷化劑反應(yīng)后的DNA樣品溶 液采用與步驟(2)中DNA空白溶液相同的方法進(jìn)行測定，得到DNA樣品溶液的紅外光譜圖，將得到的所有紅外譜圖使用大氣補(bǔ)償將空氣中CO2和H2O的吸收峰扣除，最后進(jìn)行基線校正。經(jīng)處理的DNA空白溶液的紅外光譜圖如圖1所示，經(jīng)處理的與MNU反應(yīng)的DNA樣品溶液的紅外光譜圖如圖2所示；(4)將步驟(3)中所得的DNA空白溶液和DNA樣品溶液的特征譜峰進(jìn)行比較， 特征峰的變化包括(a)鳥嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1701CHT1，表明鳥嘌呤發(fā)生了烷化損傷；(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1608CHT1，表明腺嘌呤發(fā)生了烷化損傷； (c) 1088cm—1處和1228cm-1處磷酸基團(tuán)特征峰的峰強(qiáng)比I1088A1228由1. 879減小為1. 469，表明磷酸基團(tuán)發(fā)生了烷化損傷。實(shí)施例2(1)稱取50mg小牛胸腺DNA，溶于IOmL濃度為lmmol/L Tris-HCl溶液中，配制成濃度為5mg/mL的DNA溶液，pH值為7，將乙基亞硝基脲(N-ethyl-N-nitrosourea，ENU)固體7mg溶于600 μ L乙醇中，配制成摩爾濃度為60mmol/L的ENU乙醇溶液，向ImL DNA溶液中加入10 μ L ENU乙醇溶液，此時(shí)反應(yīng)體系中ENU的摩爾濃度為lmmol/L，在37°C下反應(yīng) 6h ；(2)采用液膜法進(jìn)行紅外光譜測定設(shè)定掃描范圍4000 400cm—1，分辨率2cm—1，掃描次數(shù)256次，采用氘化三甘氨硫檢測器(DTGS)和KBr分束器，首先將所配制濃度為lmmol/L的Tris-HCl溶液滴于KRS-5 窗片上，干燥后作為背景掃描，再將DNA空白溶液滴于KRS-5窗片上，采用差減法扣除背景后掃描即可得到DNA空白溶液的紅外光譜圖，重復(fù)測定三次取平均值；(3)同實(shí)施例1中步驟(3)，經(jīng)處理的與ENU反應(yīng)的DNA樣品溶液的紅外譜圖如圖 3所示；(4)將步驟(3)中所得的DNA空白溶液和DNA樣品溶液的特征譜峰進(jìn)行比較， 特征峰的變化包括(a)鳥嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1699CHT1，表明鳥嘌呤發(fā)生了烷化損傷；(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1609CHT1，表明腺嘌呤發(fā)生了烷化損傷； (c) 1088cm—1處和1228cm-1處磷酸基團(tuán)特征峰的峰強(qiáng)比I1088A1228由1. 879減小為1. 664，表明磷酸基團(tuán)發(fā)生了烷化損傷。實(shí)施例3(1)稱取70mg小牛胸腺DNA，溶于IOmL濃度為10mmol/L Tris-HCl溶液中，配制成濃度為7mg/mL的DNA溶液，pH值為7. 4，將甲烷磺酸甲酯(methane sulfonic acid methyl ester,MMS)液體10 μ L稀釋于190 μ L乙醇中，配制成摩爾濃度為100mmol/L的MMS乙醇溶液，向ImL DNA溶液中加入20 μ LMMS乙醇溶液，此時(shí)反應(yīng)體系中MMS的摩爾濃度為IOmmol/ L，在37°C下反應(yīng)5h ；(2)采用液膜法進(jìn)行紅外光譜測定設(shè)定掃描范圍4000 400cm-1，分辨率4cm—1，掃描次數(shù)192次，采用氘化三甘氨硫檢測器(DTGS)和KBr分束器，首先將所配制濃度為lOmmol/L的Tris-HCl溶液滴于CaF2窗片上，干燥后作為背景掃描，再將DNA空白溶液滴于CaF2窗片上，采用差減法扣除背景后掃描即可得到DNA空白溶液的紅外光譜圖，重復(fù)測定三次取平均值；(3)同實(shí)施例1中步驟(3)，經(jīng)處理的與匪S反應(yīng)的DNA樣品溶液的紅外譜圖如圖 4所示；

(4)將步驟(3)中所得的DNA空白溶液和DNA樣品溶液的特征譜峰進(jìn)行比較， 特征峰的變化包括(a)鳥嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1700CHT1，表明鳥嘌呤發(fā)生了烷化損傷；(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1608CHT1，表明腺嘌呤發(fā)生了烷化損傷； (c) 1088cm—1處和1228cm-1處磷酸基團(tuán)特征峰的峰強(qiáng)比I1088A1228由1. 879減小為1. 746，表明磷酸基團(tuán)發(fā)生了烷化損傷。實(shí)施例4(1)稱取40mg小牛胸腺DNA，溶于IOmL濃度為5mmol/L Tris-HCl溶液中，配制成濃度為4mg/mL的DNA溶液，pH值為7. 8，將甲烷磺酸乙酯(methane sulfonic acid ethyl ester, EMS)液體10 μ L稀釋于190 μ L乙醇中，配制成摩爾濃度為100mmol/L的EMS乙醇溶液，向ImL DNA溶液中加入10 μ L EMS乙醇溶液，此時(shí)反應(yīng)體系中EMS的摩爾濃度為5mmol/ L，在37°C下反應(yīng)7h ；(2)采用液膜法進(jìn)行紅外光譜測定設(shè)定掃描范圍4000 400cm—1，分辨率2cm—1，掃描次數(shù)384次，采用氘化三甘氨硫檢測器(DTGS)和KBr分束器，首先將所配制濃度為5mmol/L的Tris-HCl溶液滴于CaF2窗片上，干燥后作為背景掃描，再將DNA空白溶液滴于CaF2窗片上，采用差減法扣除背景后掃描即可得到DNA空白溶液的紅外光譜圖，重復(fù)測定三次取平均值；(3)同實(shí)施例1中步驟(3)，經(jīng)處理的與EMS反應(yīng)的DNA樣品溶液的紅外譜圖如圖 5所示；(4)將步驟(3)中所得的DNA空白溶液和DNA樣品溶液的特征譜峰進(jìn)行比較， 特征峰的變化包括(a)鳥嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1701CHT1，表明鳥嘌呤發(fā)生了烷化損傷；(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1609CHT1，表明腺嘌呤發(fā)生了烷化損傷； (c) 1088cm—1處和1228cm-1處磷酸基團(tuán)特征峰的峰強(qiáng)比I1088A1228由1. 879減小為1. 725，表明磷酸基團(tuán)發(fā)生了烷化損傷。實(shí)施例5(1)稱取60mg小牛胸腺DNA，溶于IOmL濃度為20mmol/L Tris-HCl溶液中，配制成濃度為6mg/mL的DNA溶液，pH值為7. 5，將碘甲烷(iodo methane,MeI)液體10 μ L稀釋于190 μ L乙醇中，配制成摩爾濃度為160mmol/L的MeI乙醇溶液，向ImL DNA溶液中加入 10 μ L MeI乙醇溶液，此時(shí)反應(yīng)體系中MeI的摩爾濃度為8mmol/L，在37°C下反應(yīng)6h ；(2)采用液膜法進(jìn)行紅外光譜測定設(shè)定掃描范圍4000 400cm—1，分辨率4cm—1，掃描次數(shù)320次，采用氘化三甘氨硫檢測器(DTGS)和KBr分束器，首先將所配制濃度為20mmol/L的Tris-HCl溶液滴于ZnSe 窗片上，干燥后作為背景掃描，再將DNA空白溶液滴于ZnSe窗片上，采用差減法扣除背景后掃描即可得到DNA空白溶液的紅外光譜圖，重復(fù)測定三次取平均值；(3)同實(shí)施例1中步驟(3)，經(jīng)處理的與MeI反應(yīng)的DNA樣品溶液的紅外譜圖如圖6所示；(4)將步驟(3)中所得的DNA空白溶液和DNA樣品溶液的特征譜峰進(jìn)行比較， 特征峰的變化包括(a)鳥嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1699CHT1，表明鳥嘌呤發(fā)生了烷化損傷；(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1608CHT1，表明腺嘌呤發(fā)生了烷化損傷； (c) 1088cm—1處和1228cm-1處磷酸基團(tuán)特征峰的峰強(qiáng)比I1088A1228由1. 879減小為1. 325，表明磷酸基團(tuán)發(fā)生了烷化損傷。實(shí)施例6(1)稱取40mg小牛胸腺DNA，溶于IOmL濃度為5mmol/L Tris-HCl溶液中，配制成濃度為6mg/mL的DNA溶液，pH值為8，將碘乙烷(iodo ethane, EtI)液體15 μ L稀釋于485 μ L乙醇中，配制成摩爾濃度為100mmol/L的EtI乙醇溶液，向ImL DNA溶液中加入 10 μ L EtI乙醇溶液，此時(shí)反應(yīng)體系中EtI的摩爾濃度為2mmol/L，在37°C下反應(yīng)IOh ；(2)采用液膜法進(jìn)行紅外光譜測定設(shè)定掃描范圍4000 400cm—1，分辨率2cm—1，掃描次數(shù)160次，采用氘化三甘氨硫檢測器(DTGS)和KBr分束器，首先將所配制濃度為5mmol/L的Tris-HCl溶液滴于ZnSe窗片上，干燥后作為背景掃描，再將DNA空白溶液滴于ZnSe窗片上，采用差減法扣除背景后掃描即可得到DNA空白溶液的紅外光譜圖，重復(fù)測定三次取平均值；(3)同實(shí)施例1中步驟(3)，經(jīng)處理的與EtI反應(yīng)的DNA樣品溶液的紅外譜圖如圖 7所示；(4)將步驟(3)中所得的DNA空白溶液和DNA樣品溶液的特征譜峰進(jìn)行比較， 特征峰的變化包括(a)鳥嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1699CHT1，表明鳥嘌呤發(fā)生了烷化損傷；(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1609CHT1，表明腺嘌呤發(fā)生了烷化損傷； (c) 1088cm—1處和1228cm-1處磷酸基團(tuán)特征峰的峰強(qiáng)比I1088A1228由1. 879減小為1. 322，表明磷酸基團(tuán)發(fā)生了烷化損傷。實(shí)施例7(1)稱取90mg小牛胸腺DNA，溶于IOmL濃度為lmmol/L Tris-HCl溶液中，配制成濃度為9mg/mL的DNA溶液，pH值為7，將硫酸二甲酯(dimethyl sulfate, DMS)液體15 μ L 稀釋于485 μ L乙醇中，配制成摩爾濃度為150mmol/L的DMS乙醇溶液，向ImL DNA溶液中加入10 μ L DMS乙醇溶液，此時(shí)反應(yīng)體系中DMS的摩爾濃度為3mmol/L，在37°C下反應(yīng)6h ；(2)采用液膜法進(jìn)行紅外光譜測定設(shè)定掃描范圍4000 400cm—1，分辨率4cm—1，掃描次數(shù)320次，采用氘化三甘氨硫檢測器(DTGS)和KBr分束器，首先將所配制濃度為lmmol/L的Tris-HCl溶液滴于AgBr窗片上，干燥后作為背景掃描，再將DNA空白溶液滴于AgBr窗片上，采用差減法扣除背景后掃描即可得到DNA空白溶液的紅外光譜圖，重復(fù)測定三次取平均值；(3)同實(shí)施例1中步驟(3)，經(jīng)處理的與DMS反應(yīng)的DNA樣品溶液的紅外譜圖如圖 8所示；(4)將步驟(3)中所得的DNA空白溶液和DNA樣品溶液的特征譜峰進(jìn)行比較， 特征峰的變化包括(a)鳥嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1701CHT1，表明鳥嘌呤發(fā)生了烷化損傷；(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1609CHT1，表明腺嘌呤發(fā)生了烷化損傷； (c) 1088cm—1處和1228cm—1處磷酸基團(tuán)特征峰的峰強(qiáng)比I1088A1228由1. 879減小為1. 355，表明磷酸基團(tuán)發(fā)生了烷化損傷。實(shí)施例8(1)稱取90mg小牛胸腺DNA，溶于IOmL濃度為15mmol/L Tris-HCl溶液中，配制成濃度為9mg/mL的DNA溶液，pH值為7. 5，將硫酸二乙酯(diethyl sulfate,DES)液體10 μ L 稀釋于1. 5mL乙醇中，配制成摩爾濃度為75mmol/L的DES乙醇溶液，向ImL DNA溶液中加入10 μ L DES乙醇溶液，此時(shí)反應(yīng)體系中DES的摩爾濃度為0. 5mmol/L，在37°C下反應(yīng)4h ；(2)采用液膜法進(jìn)行紅外光譜測定設(shè)定掃描范圍4000 400cm—1，分辨率4cm—1，掃描次數(shù)320次，采用氘化三甘氨硫檢測器(DTGS)和KBr分束器，首先將所配制濃度為15mmol/L的Tris-HCl溶液滴于AgBr 窗片上，干燥后作為背景掃描，再將DNA空白溶液滴于AgBr窗片上，采用差減法扣除背景后掃描即可得到DNA空白溶液的紅外光譜圖，重復(fù)測定三次取平均值；(3)同實(shí)施例1中步驟(3)，經(jīng)處理的與DES反應(yīng)的DNA樣品溶液的紅外譜圖如圖 9所示；(4)將步驟(3)中所得的DNA空白溶液和DNA樣品溶液的特征譜峰進(jìn)行比較， 特征峰的變化包括(a)鳥嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1699CHT1，表明鳥嘌呤發(fā)生了烷化損傷；(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1608CHT1，表明腺嘌呤發(fā)生了烷化損傷； (c) 1088cm—1處和1228cm-1處磷酸基團(tuán)特征峰的峰強(qiáng)比I1088A1228由1. 879減小為1. 559，表明磷酸基團(tuán)發(fā)生了烷化損傷。實(shí)施例9(1)稱取80mg小牛胸腺DNA，溶于IOmL濃度為15mmol/L Tris-HCl溶液中，配制成濃度為8mg/mL的DNA溶液，pH值為7. 2，將甲基亞硝基胍(N-methyl-N，-nitro-N-nitr oso-guanidine, MNNG)固體3mg溶于100 μ L乙醇中，配制成摩爾濃度為20mmol/L的MNNG 乙醇溶液，向ImL DNA溶液中加入25 μ L MNNG乙醇溶液，此時(shí)反應(yīng)體系中MNNG的摩爾濃度為5mmol/L，在37°C下反應(yīng)9h ；(2)采用液膜法進(jìn)行紅外光譜測定設(shè)定掃描范圍4000 400cm—1，分辨率2cm—1，掃描次數(shù)326次，采用氘化三甘氨硫檢測器(DTGS)和KBr分束器，首先將所配制濃度為15mmol/L的Tris-HCl溶液滴于ZnSe 窗片上，干燥后作為背景掃描，再將DNA空白溶液滴于ZnSe窗片上，采用差減法扣除背景后掃描即可得到DNA空白溶液的紅外光譜圖，重復(fù)測定三次取平均值；(3)同實(shí)施例1中步驟(3)，經(jīng)處理的與MNNG反應(yīng)的DNA樣品溶液的紅外譜圖如圖10所示；(4)將步驟(3)中所得的DNA空白溶液和DNA樣品溶液的特征譜峰進(jìn)行比較， 特征峰的變化包括(a)鳥嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1701CHT1，表明鳥嘌呤發(fā)生了烷化損傷；(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1608CHT1，表明腺嘌呤發(fā)生了烷化損傷； (c) 1088cm—1處和1228cm-1處磷酸基團(tuán)特征峰的峰強(qiáng)比I1088A1228由1. 879減小為1. 523，表明磷酸基團(tuán)發(fā)生了烷化損傷。實(shí)施例10(1)稱取40mg小牛胸腺DNA，溶于IOmL濃度為5mmol/L Tris-HCl溶液中，配制成濃度為8mg/mL的DNA溶液，pH值為7. 7，將丙基亞硝基胍(N-propyl-N，-nitro-N-nitrosoguanidine,PNNG)固體9mg溶于2mL乙醇中，配制成摩爾濃度為125mmol/L的PNNG乙醇溶液， 向ImL DNA溶液中加入4 μ LPNNG乙醇溶液，此時(shí)反應(yīng)體系中PNNG的摩爾濃度為0. 25mmol/ L，在37°C下反應(yīng)8h ；(2)采用液膜法進(jìn)行紅外光譜測定設(shè)定掃描范圍4000 400cm—1，分辨率2cm—1，掃描次數(shù)326次，采用氘化三甘氨硫檢測器(DTGS)和KBr分束器，首先將所配制濃度為5mmol/L的Tris-HCl溶液滴于ZnSe窗片上，干燥后作為背景掃描，再將DNA空白溶液滴于ZnSe窗片上，采用差減法扣除背景后掃描即可得到DNA空白溶液的紅外光譜圖，重復(fù)測定三次取平均值；(3)同實(shí)施例1中步驟(3)，經(jīng)處理的與PNNG反應(yīng)的DNA樣品溶液的紅外譜圖如圖11所示；(4)將步驟(3)中所得的DNA空白溶液和DNA樣品溶液的特征譜峰進(jìn)行比較， 特征峰的變化包括(a)鳥嘌呤特征峰由1714CHT1位移至1699CHT1，表明鳥嘌呤發(fā)生了烷化損傷；(b)腺嘌呤特征峰由1613CHT1位移至1609CHT1，表明腺嘌呤發(fā)生了烷化損傷； (c) 1088cm—1處和1228cm-1處磷酸基團(tuán)特征峰的峰強(qiáng)比I1088A1228由1. 879減小為1. 596，表明磷酸基團(tuán)發(fā)生了烷化損傷。
權(quán)利要求
1.一種DNA烷化損傷的紅外光譜快速檢測方法，包括以下步驟(1)稱取小牛胸腺DNA，溶于1 20mmol/LTris-HCl溶液中，配制成濃度為4 IOmg/ mL的DNA溶液，pH值為7 8，向DNA溶液中加入烷化劑乙醇溶液，烷化劑的摩爾濃度為 0. 25 15mmol/L，在 37°C下反應(yīng) 4 IOh ；(2)采用液膜法進(jìn)行紅外光譜測定設(shè)定掃描范圍4000 400cm-1，分辨率2 4cm—1，掃描次數(shù)100 500，采用氘化三甘氨硫檢測器(DTGS)和KBr分束器，首先將Tris-HCl溶液滴于非水溶性窗片上，干燥后作為背景掃描，再將DNA空白溶液滴于非水溶性窗片上，采用差減法扣除背景后掃描即可得到DNA 空白溶液的紅外光譜圖，重復(fù)測定三次取平均值；(3)將與烷化劑反應(yīng)后的DNA樣品采用與步驟(2)中DNA空白溶液相同的方法進(jìn)行測定，得到DNA樣品溶液的紅外光譜圖，將得到的所有紅外譜圖使用大氣補(bǔ)償將空氣中CO2和 H2O的吸收峰扣除，最后進(jìn)行基線校正；(4)將步驟(3)中所得的DNA空白溶液和DNA樣品溶液的特征譜峰進(jìn)行比較，根據(jù)峰位和峰強(qiáng)比的變化確定DNA烷化損傷的位點(diǎn)和程度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于步驟(1)中所述烷化劑為甲基亞硝基脲、乙基亞硝基脲、甲烷磺酸甲酯、甲烷磺酸乙酯、碘甲烷、碘乙烷、硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、甲基亞硝基胍或丙基亞硝基胍。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于步驟(2)中所述非水溶性窗片為AgBr、CaF2, ZnSe 或 KRS-5。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種DNA烷化損傷的紅外光譜快速檢測方法。該方法是利用紅外光譜法檢測DNA與烷化劑反應(yīng)后的紅外光譜圖，并與空白DNA溶液的紅外光譜圖進(jìn)行比較，得到峰位和峰強(qiáng)比發(fā)生變化的特征基團(tuán)，從而確定DNA烷化損傷位點(diǎn)及程度。本發(fā)明方法具有操作方法簡單且樣品便于回收、專屬性強(qiáng)、靈敏度高、檢測速度快以及安全環(huán)保等突出特點(diǎn)，可直接對DNA損傷進(jìn)行快速檢測。
文檔編號G01N21/35GK102353647SQ20111030678
公開日2012年2月15日 申請日期2011年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月11日
發(fā)明者李莉莉, 趙麗嬌, 鄭大威, 鐘儒剛 申請人:北京工業(yè)大學(xué)