專利名稱：檢測2型豬鏈球菌89k毒力島基因的引物和探針、實(shí)時熒光定量pcr方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測2型豬鏈球菌89K毒力島基因的引物和探針、實(shí)時熒光定量 PCR方法及試劑盒，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬鏈球菌(Sti^ptococcus suis, S. suis)為革蘭陽性兼性厭氧球菌，根據(jù)莢膜多糖的抗原性，豬鏈球菌可分為35個血清型，其中1、2、1/2、7、9和14型具有致病性，并以2 型(S. suis 2)毒力最強(qiáng)，臨床檢出率最高。2型豬鏈球菌是一種重要的人畜共患傳染病病原體，不僅可導(dǎo)致豬急性敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎及急性死亡，還可通過傷口和呼吸道等傳播途徑，導(dǎo)致人的感染發(fā)病和死亡。2型豬鏈球菌呈全球性分布，不僅給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且對相關(guān)從業(yè)人員的健康亦構(gòu)成嚴(yán)重威脅，已成為重要的新發(fā)傳染病病原體。2型豬鏈球菌根據(jù)致病力的強(qiáng)弱可分為強(qiáng)毒株，弱毒株或無毒株。然而，弱毒株或無毒株2型豬鏈球菌在健康豬扁桃體的帶菌率可高達(dá)42. 6%，這就給病豬診斷和肉品檢測帶來困難——在檢疫檢驗時，檢到2型豬鏈球菌后還必須鑒定其致病力，進(jìn)而采取針對性的應(yīng)對措施，從而防止疫情爆發(fā)和蔓延。本專利申請人已針對2型豬鏈球菌主要毒力因子(CPS2、MRP、EF、Sly)建立了多重常規(guī)PCR體系檢測2型豬鏈球菌，并研制出相應(yīng)的試劑盒，在國內(nèi)率先提供快速診斷的技術(shù)手段(研究成果發(fā)表在《中華流行病學(xué)雜志》2005年9月第沈卷第九期)。通常，2型豬鏈球菌在人群中只引起散發(fā)的急性腦膜炎和敗血癥。然而，1998年在江蘇省以及2005年在四川省大規(guī)模爆發(fā)的兩起2型豬鏈球菌感染人的突發(fā)公共衛(wèi)生事件共導(dǎo)致了 240人感染，52人死亡，病人出現(xiàn)鏈球菌中毒性休克綜合征(STSQ的新臨床型別， 該型別患病致死率高達(dá)80%以上，為歷史罕見。本專利申請人率先對來自中毒休克綜合癥臨床病人的1998年江蘇分離株 (98HAH12)和2005年四川分離株(0MYH33)分別作了全序列基因測定，經(jīng)對比分析，在全世界首次發(fā)現(xiàn)這兩個中國強(qiáng)毒株比歐洲株多出一段89K序列片段，稱為89K毒力島(王長軍，A Glimpse of Streptococcal Toxic Shock Syndrome from Comparative Genomics of S. suis 2 Chinese Isolates. PLoS ONE，2007，Issue5，1-9)。本專利申請人在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)，該89K毒力島對菌株毒力因子起到全局性的調(diào)控作用(王長軍，^activation of Dipeptidyl Peptidase IV Attenuates the Virulence of Streptococcus suis Serotype 2 that Causes Streptococcal Toxic Shock Syndrome. Curr Microbiol，2009，。在敲除89K毒力島基因后，菌株的致病性顯著降低，宿主癥狀顯著改善，存活率顯著提高(王長軍，SalK/SalR，a Two-Component Signal Transduct ion System, Is Essential for Full Virulence of Highly Invasive Streptococcus suis Serotype 2. PLoS ONE，2008， Volume3，Issue5，1_12)。上述研究表明，89K毒力島應(yīng)是這兩次流行2型豬鏈球菌的一種重要致病基因，是引起我國人感染豬鏈球菌病中毒性休克綜合癥的關(guān)鍵致病基因。含有89K毒力島的2型豬鏈球菌的致病力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過傳統(tǒng)的強(qiáng)毒株2型豬鏈球菌， 但目前還沒有一種能檢測2型豬鏈球菌89K毒力島基因的技術(shù)手段，而這種技術(shù)手段對于應(yīng)對由含89K毒力島2型豬鏈球菌引起的傳染病，特別是在中國突發(fā)公共衛(wèi)生事件中早期應(yīng)急處置由含89K毒力島2型豬鏈球菌導(dǎo)致的疫情，進(jìn)而抑制疫情爆發(fā)和蔓延具有重要的
眉、ο

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種檢測2型豬鏈球菌89K 毒力島基因的引物和探針。本發(fā)明的第二目的是提供一種檢測2型豬鏈球菌89K毒力島基因的實(shí)時熒光定量PCR方法。本發(fā)明的第三目的是提供一種檢測2型豬鏈球菌89K毒力島基因的試劑盒。申請人:經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，2型豬鏈球菌89K毒力島的二元信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)基因MlK和IV 型分泌系統(tǒng)毒力基因virB4-89K均對2型豬鏈球菌的致病力起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。結(jié)合上述研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第一目的的技術(shù)方案如下一種檢測2型豬鏈球菌89K毒力島基因的引物和探針，其特征是，包括由引物對 SalK-F和&11K-R、及探針MlK-probe組成的&ι1Κ引物探針序列集；其中，引物&ilK_F的序列如SEQ ID No. 1所示，引物SalK-R的序列如SEQ ID No. 2所示，探針SalK-probe的序列如SEQ ID No. 3所示；所述探針SalK-probe的5'端標(biāo)記有報告熒光基團(tuán)、3'端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)；所述報告熒光基團(tuán)選自FAM、J0E、Cy3、Cy5、TRAMA、TET、R0X、HEX之一，所述淬滅熒光基團(tuán)為BHQ、ECLIPSE之一。進(jìn)一步地，還包括由引物對virB4-89K-F和virB4_89K_R、及探針 virB4-89K-probe組成的virB4_89K引物探針序列集，和/或由引物對cps2J_F和cps2J-R、 及探針cps2J-probe組成的cps2J引物探針序列集；其中，引物virB4_89K_F的序列如SEQ ID No. 4所示，引物virB4H-R的序列如SEQ ID No. 5所示，探針virB4_89K-probe的序列如SEQ ID No. 6所示；引物cps2J-F的序列如SEQ ID No. 7所示，引物cps2J-R的序列如SEQ ID No. 8 所示，探針 cps2J-probe 的序列如 SEQ ID No. 9 所示；所述探針 virB4_89K-probe、 探針cpS2J-probe的5'端標(biāo)記有報告熒光基團(tuán)、3'端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)。2型豬鏈球菌普遍含有基因cps2J，采用cps2J引物探針序列集可以確認(rèn)2型豬鏈球菌。采用上述引物和探針進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)，即可快速確定2型豬鏈球菌中是否含有89K毒力島基因。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第二目的的技術(shù)方案如下一種檢測2型豬鏈球菌89K毒力島基因的實(shí)時熒光定量PCR方法，其特征是，包括以下步驟(1)選擇引物探針序列集選擇由SEQ ID No. 1-3組成的MlK引物探針序列集； 其中，探針MlK-probe的5'端標(biāo)記有報告熒光基團(tuán)、3‘端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)；所述報告熒光基團(tuán)選自FAM、JOE、Cy3、Cy5、TRAMA, ΤΕΤ、ROX, HEX之一，所述淬滅熒光基團(tuán)為BHQ、ECLIPSE 之一；(2)實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)以待測樣品的基因組DNA為擴(kuò)增模板，根據(jù)所選引物探針序列集的探針上所標(biāo)記的報告熒光基團(tuán)選擇熒光通道，利用所選引物探針序列集的引物對和探針進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)，同時記錄熒光曲線和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)CT ；其中，所述2型豬鏈球菌89K毒力島的基因MlK的陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)是當(dāng)CT彡35、 且熒光曲線呈S形時，判斷為陽性；否則，判斷為陰性。進(jìn)一步地，所述步驟(1)中還選擇由SEQ ID No. 4_6組成的virB4_89K引物探針序列集，和/或由SEQ ID No. 7-9組成的cps2J引物探針序列集；其中探針virB4-89K-probe、 探針cpS2J-probe的5'端標(biāo)記有報告熒光基團(tuán)、3'端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)；其中，所述2型豬鏈球菌89K毒力島的基因virB4_89K、所述2型豬鏈球菌的基因 cps2J的陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)均為當(dāng)CTS35、且熒光曲線呈S形時，判斷為陽性；否則，判斷為陰性。更進(jìn)一步地，所述實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)的程序為第一階段初期變性，93°C -95°C 30秒-120秒；第二階段PCR反應(yīng)，93°C _95°C變性5_15秒，60°C退火并延伸觀_40秒，同時監(jiān)測熒光曲線；重復(fù)30-50個循環(huán)。再進(jìn)一步地，所述實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)的體系由以下組分構(gòu)成體系終濃度為 1. 25U/20 μ 1的I^remix Ex Taq聚合酶，體系終濃度為5mmol/L的鎂離子，體系終濃度為 0. 2 μ mol/L的各引物，體系終濃度為0. 5 μ mol/L的各探針，體系終濃度為0. 2 μ mol/L的 ROX Reference Dye II，待測樣品基因組DNA溶液4 μ 1，雙蒸水適量；整個體系的總體積為 20 μ 1。實(shí)時熒光定量PCR是通過熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，可實(shí)時監(jiān)控反應(yīng)過程，具有特異性更好、假陽性低、靈敏度更高(是常規(guī)PCR的100倍以上)、 操作簡便、交叉污染和污染環(huán)境機(jī)會少等優(yōu)點(diǎn)，而且整個反應(yīng)可在0.5- 內(nèi)完成。多重實(shí)時熒光定量PCR是在同一個反應(yīng)系中加入多個引物和熒光標(biāo)記探針，同時檢測多個目的基因的方法，該方法可以方便的進(jìn)行一管多檢，從而達(dá)到省時省力的目的。采用上述方法可以在很短的時間內(nèi)確定2型豬鏈球菌中是否含有89K毒力島基因，從而為應(yīng)對疫情爭取更多的時間。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第三目的的技術(shù)方案如下一種檢測2型豬鏈球菌89K毒力島基因的試劑盒，其特征是，包括由SEQ ID No. 1-3組成的MlK引物探針序列集；其中，探針MlK-probe的5'端標(biāo)記有報告熒光基團(tuán)、3'端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)；所述報告熒光基團(tuán)選自FAM、JOE、Cy3、Cy5、TRAMA、ΤΕΤ、 ROX, HEX之一，所述淬滅熒光基團(tuán)為BHQ、ECLIPSE之一。進(jìn)一步地，還包括由SEQ ID No. 4_6組成的virB4_89K引物探針序列集，和/ 或由SEQ ID No. 7-9組成的cps2J引物探針序列集；其中探針virB4-89K-probe、探針 cpS2J-probe的5'端標(biāo)記有報告熒光基團(tuán)、3'端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)。更進(jìn)一步地，還包括2XPremix Ex Taq聚合酶、25mM鎂離子溶液、及50XR0X Reference Dye II。采用上述試劑盒可快速確定2型豬鏈球菌中是否含有89K毒力島基因。


圖1為本發(fā)明實(shí)時熒光定量PCR方法的檢測原理圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例4的熒光曲線示意圖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例5的熒光曲線示意圖。圖4為本發(fā)明實(shí)施例6的熒光曲線示意圖。
具體實(shí)施例方式下面參照附圖并結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。但是本發(fā)明不限于所給出的例子。以下內(nèi)容中涉及的實(shí)驗操作，如未注明具體實(shí)驗條件，則按照常規(guī)條件進(jìn)行，例如，可參照SAMBR00K. J等編著的《分子克隆實(shí)驗指南》第3版(Molecular Cloning =A Laboratory Manual ；NEW York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中述及的條件，或參照制造廠商所建議的條件。以下內(nèi)容中涉及的實(shí)驗材料和試劑，如未特別說明則為市售品。實(shí)施例1. SalK, virB4_89K、cps2J引物探針序列集通過分析NCBI (美國國立生物技術(shù)信息中心WenBank數(shù)據(jù)庫中2型豬鏈球菌的 SalK, virB4_89K、cps2J基因序列，使用Beacon Designer等多種生物學(xué)軟件，結(jié)合經(jīng)驗判斷和人工比對、修正，進(jìn)行比較分析，選擇無二級結(jié)構(gòu)且高度保守的核苷酸區(qū)域設(shè)計三對引物和探針(本發(fā)明采用的是TaqMan探針)。引物長度一般為20_30個堿基，探針的長度一般為15-30個堿基(均為DNA堿基)。引物間和引物內(nèi)無互補(bǔ)序列，而且應(yīng)分別特異性地針對各靶基因，相互間不存在交叉反應(yīng)，可以在同一套反應(yīng)體系中同時應(yīng)用于檢測和區(qū)分 &ilK、virB4-89K、CpS2J三組基因。具體的引物對、探針序列見表1。表1引物對、探針序列
權(quán)利要求
1.一種檢測2型豬鏈球菌89K毒力島基因的引物和探針，其特征是，包括由引物對 SalK-F和&11K-R、及探針MlK-probe組成的&ι1Κ引物探針序列集；其中，引物&ilK_F的序列如SEQ ID No. 1所示，引物SalK-R的序列如SEQ ID No. 2所示，探針SalK-probe的序列如SEQ ID No. 3所示；所述探針MlK-probe的5'端標(biāo)記有報告熒光基團(tuán)、3'端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)；所述報告熒光基團(tuán)選自FAM、J0E、Cy3、Cy5、TRAMA、TET、R0X、HEX之一，所述淬滅熒光基團(tuán)為BHQ、ECLIPSE之一。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測2型豬鏈球菌89K毒力島基因的引物和探針，其特征是，還包括由引物對 virB4-89K-F 和 virB4_89K_R、及探針 virB4_89K-probe 組成的 virB4_89K 引物探針序列集，和/或由引物對cps2J-F和cps2J-R、及探針cpS2J-probe組成的cps2J引物探針序列集；其中，引物virB4-89K-F的序列如SEQ ID No. 4所示，引物virB4_89K_R的序列如SEQ ID No. 5所示，探針virB4-89K-probe的序列如SEQ ID No. 6所示；引物cps2J_F 的序列如SEQ ID No. 7所示，引物cps2J-R的序列如SEQ ID No. 8所示，探針cps2J-probe 的序列如SEQ ID No. 9所示；所述探針virB4-89K-probe、探針cps2J-probe的5'端標(biāo)記有報告熒光基團(tuán)、3'端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)。
3.—種檢測2型豬鏈球菌89K毒力島基因的實(shí)時熒光定量PCR方法，其特征是，包括以下步驟(1)選擇引物探針序列集選擇由SEQID No. 1-3組成的MlK引物探針序列集；其中， 探針MlK-probe的5'端標(biāo)記有報告熒光基團(tuán)、3'端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)；所述報告熒光基團(tuán)選自 FAM、JOE、Cy3、Cy5、TRAMA, ΤΕΤ、ROX, HEX 之一，所述淬滅熒光基團(tuán)為 BHQ、ECLIPSE 之一；(2)實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)以待測樣品的基因組DNA為擴(kuò)增模板，根據(jù)所選引物探針序列集的探針上所標(biāo)記的報告熒光基團(tuán)選擇熒光通道，利用所選引物探針序列集的引物對和探針進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)，同時記錄熒光曲線和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)CT ；其中，所述2型豬鏈球菌89K毒力島的基因MlK的陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)是當(dāng)CT ( 35、且熒光曲線呈S形時，判斷為陽性；否則，判斷為陰性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述檢測2型豬鏈球菌89K毒力島基因的實(shí)時熒光定量PCR方法， 其特征是，所述步驟(1)中還選擇由SEQ ID似.4-6組成的“沖4-891(引物探針序列集， 和/或由SEQ ID No. 7-9組成的cps2J引物探針序列集；其中探針virB4_89K-probe、探針 cpS2J-probe的5'端標(biāo)記有報告熒光基團(tuán)、3'端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)；其中，所述2型豬鏈球菌89K毒力島的基因virB4-89K、所述2型豬鏈球菌的基因cps2J 的陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)均為當(dāng)CT ( 35、且熒光曲線呈S形時，判斷為陽性；否則，判斷為陰性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測2型豬鏈球菌89K毒力島基因的實(shí)時熒光定量PCR方法， 其特征是，所述實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)的程序為第一階段初期變性，93°C -95°C 30秒-120秒；第二階段PCR反應(yīng)，93°C _95°C變性5-15秒，60°C退火并延伸觀_40秒，同時監(jiān)測熒光曲線；重復(fù)30-50個循環(huán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述檢測2型豬鏈球菌89K毒力島基因的實(shí)時熒光定量PCR方法， 其特征是，所述實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)的體系由以下組分構(gòu)成體系終濃度為1. 25U/20y 1 的I^remix Ex Taq聚合酶，體系終濃度為5mmol/L的鎂離子，體系終濃度為0. 2 μ mol/L的各引物，體系終濃度為0. 5 μ mol/L的各探針，體系終濃度為0. 2 μ mol/L的ROX Reference Dye II，待測樣品基因組DNA溶液4 μ 1，雙蒸水適量；整個體系的總體積為20μ 1。
7.一種檢測2型豬鏈球菌89Κ毒力島基因的試劑盒，其特征是，包括由SEQ ID No. 1-3 組成的MlK引物探針序列集；其中，探針MlK-probe的5'端標(biāo)記有報告熒光基團(tuán)、3'端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)；所述報告熒光基團(tuán)選自FAM、JOE、Cy3、Cy5、TRAMA, ΤΕΤ、ROX, HEX之一，所述淬滅熒光基團(tuán)為BHQ、ECLIPSE之一。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述檢測2型豬鏈球菌89K毒力島基因的試劑盒，其特征是，還包括由SEQ ID No. 4-6組成的virB4_89K引物探針序列集，和/或由SEQ ID No. 7-9組成的 cps2J引物探針序列集；其中探針virB4-89K-probe、探針cpS2J-probe的5'端標(biāo)記有報告熒光基團(tuán)、3'端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述檢測2型豬鏈球菌89K毒力島基因的試劑盒，其特征是，還包括 2XPremix Ex Taq 聚合酶、25mM 鎂離子溶液、及 50XROX Reference Dye II。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測2型豬鏈球菌89K毒力島基因的引物和探針、實(shí)時熒光定量PCR方法及試劑盒。該引物和探針包括SalK、virB4-89K、cps2J引物探針序列集。該方法包括選擇引物探針序列集、實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)。該試劑盒包括SalK、virB4-89K、cps2J引物探針序列集和其它相關(guān)試劑。本發(fā)明的引物和探針、PCR方法及試劑盒可在在很短的時間內(nèi)確定2型豬鏈球菌中是否含有89K毒力島基因，從而為應(yīng)對疫情爭取更多的時間。
文檔編號G01N21/64GK102312013SQ20111030750
公開日2012年1月11日 申請日期2011年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月11日
發(fā)明者唐家琦, 張錦海, 朱靜, 潘秀珍, 王長軍, 胡丹 申請人:中國人民解放軍南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所