專利名稱：同時檢測多種亞型豬流感病毒的多通道微流控芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種同時檢測多種亞型豬流感病毒的多通道微流控芯片，該豬流感病毒診斷器件是基于抗原/抗體特異性反應(yīng)來診斷豬流感病毒抗原的專用微流控芯片，屬于分析測試領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬流感病毒(Swineinfluenza vires，SIV)屬于正粘病毒科甲型流感病毒屬 (Influenza virus A)，是單股負(fù)鏈RNA病毒，其基因組由大小不等的8個獨立片段組成。 甲型流感的亞型是根據(jù)血凝素(Hemagglutinin)和神經(jīng)氨酸(Neuraminidase)的不同來分的，其可分為15種不同的H抗原亞型和9種不同的N抗原亞型。目前造成世界流行SIV血清型亞型主要有3種=H1Np H3N2和H1Ny最近以墨西哥和美國為主的全球甲型H1N1流感的暴發(fā)更加堅定了對SIV的研究和防控。因此發(fā)展快速診斷和確診SIV的方法非常迫切，在減少世界經(jīng)濟(jì)損失和提高人類衛(wèi)生健康方面，都具有深遠(yuǎn)的意義。目前傳統(tǒng)的豬流感診斷方法，大致可分為四種一是病毒分離，病毒分離被視作實驗室診斷的標(biāo)準(zhǔn)，但缺點是所耗時間較長，而且只能在專門的實驗室進(jìn)行，往往不能及時防制措施提供依據(jù)；二是檢測病毒核酸，最常用的是反轉(zhuǎn)錄PCR，若利用多對特異性引物進(jìn)行多種PCR，可以實現(xiàn)不同亞型SIV同時檢測，但影響因素多、操作復(fù)雜、耗時，同時需要專業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行操作；三是檢測病毒蛋白，如熒光抗體方法和免疫組化方法，這類方法的雖可滿足快速診斷的需要，但其靈敏度低、特異性不強(qiáng)；四是利用免疫學(xué)方法檢測血清中的特異性抗體，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)；雖有較高的靈敏度和特異性，但也有少量的假陰性和假陽性。電化學(xué)免疫傳感器具有自動化程度高、廉價、易制備、快速靈敏等獨特優(yōu)勢，配合免疫反應(yīng)的高效專一，非常適合構(gòu)建重大傳染病多重免疫分析檢測的分析儀。有“生命科學(xué)集成電路”之稱的微流控芯片(lab-on-chip)是構(gòu)建微型化、集成化的電化學(xué)免疫傳感器的理想技術(shù)。微流控芯片技術(shù)是將采樣、預(yù)處理、加試劑、反應(yīng)、分離、檢測等集成在一塊微芯片上完成的一門前沿技術(shù)，具有分析速度快、信息量大、試劑消耗少、污染小、操作費用低、儀器使用簡便等優(yōu)點。且非常適合工業(yè)化生產(chǎn)。微流控技術(shù)代表著21世紀(jì)分析儀器走向微型化、集成化的發(fā)展方向。構(gòu)建適合于重大傳染病檢測的微流控安培檢測芯片具有以下優(yōu)勢(1)通過微加工技術(shù)很容易在芯片上集成多個檢測通道和檢測電極，做到多目標(biāo)物同時分析，技術(shù)可行性高。(2)通過微流動注射技術(shù)，樣品在管路中流動保證了電極表面時刻更新，較好克服了電極易被污染，造成假陽性率高、結(jié)果平行性差等問題。(3)微流控傳感器上管路直徑只有μ m級，反應(yīng)池體積也只有μ L級，分析時所需試劑用量極少，分析物到達(dá)電極表面的擴(kuò)散距離短、因此可以大大減少溫育時間，實現(xiàn)快速聯(lián)檢目標(biāo)。⑷目前微流控傳感器多基于光學(xué)檢測系統(tǒng)，儀器昂貴體積大，全集成很難，而且檢測成本很高，限制了其推廣。而傳感器中采用電化學(xué)檢測，體積小、自動化程度高、成本低。目前，在微流控芯片技術(shù)領(lǐng)域，利用豬流感病毒(SIV)多種亞型的特異性抗體來同時檢測、快速診斷多種亞型SIV抗原的相關(guān)技術(shù)和方法尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，在微流控芯片技術(shù)這樣一個總的技術(shù)框架內(nèi)，研發(fā)出一種能夠利用SIV多種亞型的特異性抗體來對相應(yīng)的SIV抗原進(jìn)行同時檢測、快速診斷的專用微流控芯片。本發(fā)明通過如下方案解決所述技術(shù)問題，該方案提供的裝置是一種同時檢測多種亞型SIV的多通道微流控芯片，該微流控芯片的結(jié)構(gòu)包括貼合裝設(shè)在一起的兩片板狀物， 所述兩片板狀物分別是微流控芯片的蓋片以及微流控芯片的基片，在所述兩片板狀物之間的相互貼合的位置上裝設(shè)有管道，以及，三個池狀物，管道的一端經(jīng)由歧管狀流體通道分別與其中的兩個池狀物聯(lián)通，管道的另一端與余下的一個池狀物聯(lián)通，以及，依序分別裝設(shè)在所述管道內(nèi)不同位置上的工作電極以及對電極以及參比電極，所述工作電極由導(dǎo)電性電極以及貼附在所述導(dǎo)電性電極上的包埋了 SIV特異性抗體的金膠敏感膜構(gòu)成，本案特別之處在于，所述管道的構(gòu)造呈并聯(lián)構(gòu)造，所述呈并聯(lián)構(gòu)造的管道由三條分支管道并聯(lián)構(gòu)成，以及，所述工作電極的數(shù)量是三個，該三個工作電極的裝設(shè)位置分別位于所述三條分支管道內(nèi)，以及，該三個工作電極其表層金膠敏感膜結(jié)構(gòu)中的特異性抗體分別是對不同亞型SIV 抗原能特異性結(jié)合的三種不同亞型Siv抗體物質(zhì)，該三種不同亞型的特異性抗體物質(zhì)分別是H1Np H3N2和H1N2，而且每一個工作電極其形貌均呈串珠狀。所述金膠敏感膜是將殼聚糖金膠溶液與SIV特異性抗體溶液充分混合均勻，并使其干燥成膜而成。所述金膠敏感膜中的不同亞型SIV均為辣根過氧化物酶或者葡糖糖氧化酶標(biāo)記的SIV抗體，所述金膠敏感膜已包含為固定上述各SIV特異性抗體而引入其中的輔助性介質(zhì)，所述輔助性介質(zhì)例如殼聚糖、醋酸纖維素、明膠其中的一種或它們的混合物。所述微流控芯片結(jié)構(gòu)中的所述管道以及所述分支管道以及所述歧管狀流體通道， 其內(nèi)徑尺寸均可以是任意選定的尺寸，但是，出于盡量少用待測液樣以及降低試劑損耗等方面的考慮，所述管道以及所述分支管道以及所述歧管狀流體通道最好均選用毛細(xì)管級的通道，所述毛細(xì)管級的通道意即毛細(xì)管通道，其內(nèi)徑與通常意義上的毛細(xì)管的內(nèi)徑相當(dāng)。所述毛細(xì)管其內(nèi)部通道的橫截面形狀可以是任意的形狀，所述橫截面形狀例如圓形、橢圓形、 方形、矩形、條形，當(dāng)然也可以是任意的存在彎曲的線形，并且，所述毛細(xì)管的內(nèi)部形狀隨著管道的延伸，不同部位的橫截面形狀也可以允許是不同的形狀。僅就毛細(xì)管一詞而言，其技術(shù)含義是公知的。結(jié)構(gòu)中涉及的對電極以及參比電極均為微小尺寸的電極，其電極形狀均可以是任意選定的形狀，所述任意選定的形狀例如方片形狀、矩形片狀、條狀或圓形片狀等等。本案芯片中的工作電極呈串珠狀，其串珠狀電極外形有助于大幅度地擴(kuò)展它的有效工作界面，并且，進(jìn)一步地，串珠狀形貌還使得該工作電極具有良好的擾流性，這有助于強(qiáng)化工作電極與流經(jīng)其周邊的被測物液流之間的接觸。本案微流控芯片結(jié)構(gòu)中涉及若干個池狀物，所述池狀物是用于過渡性儲液的池形或囊形構(gòu)造，其中的每一個池狀物的內(nèi)腔其形狀均可以是任意選定的形狀，所述內(nèi)腔形狀例如圓柱形空腔狀、方柱形空腔狀、橢圓形空腔狀或球形空腔狀等等。所述池狀物的尺寸可以是任意選定的尺寸，但是，為了能夠盡量少用待測液樣以及降低試劑損耗，所述池狀物最好是能夠與毛細(xì)管匹配的微小型的池狀物。本案裝置當(dāng)然還可以進(jìn)一步包括一些附件，所述附件例如多道電化學(xué)工作站以及微流動泵等等，所述多道電化學(xué)工作站的技術(shù)含義以及微流動泵的技術(shù)含義是公知的。本案微流控芯片結(jié)構(gòu)中涉及的各個串珠狀工作電極以及對電極以及參比電極等，可以分別經(jīng)由相應(yīng)的專用串線與所述多道電化學(xué)工作站的相應(yīng)接口進(jìn)行聯(lián)接。所述專用串線是用來將各所述電極與所述多道電化學(xué)工作站的各相應(yīng)接口進(jìn)行相互聯(lián)接的專用電纜。所述微流動泵專用于驅(qū)動微量液體流動，所述微流動泵可以與按需選定的任意一個所述池狀物聯(lián)通。所述形貌呈串珠狀的工作電極，既可以是一體化壓制成型的串珠狀導(dǎo)電性電極， 也可以是澆注成型的串珠狀導(dǎo)電性電極；所述工作電極其結(jié)構(gòu)當(dāng)然也可以允許是導(dǎo)電性的磁珠串結(jié)構(gòu)，在這一情形下，所述形貌呈串珠狀的工作電極其材質(zhì)是具有導(dǎo)電能力的四氧化三鐵材質(zhì)，以及，所述形貌呈串珠狀的工作電極是由許多的四氧化三鐵材質(zhì)的磁珠在外加磁場條件弓I導(dǎo)下相互拼接而成的準(zhǔn)一維導(dǎo)電性電極。所述形貌呈串珠狀的工作電極，即所述磁珠串結(jié)構(gòu)的工作電極，其結(jié)構(gòu)中的磁珠直徑不限，所述磁珠的直徑可以是根據(jù)需要設(shè)定的任意的尺寸，但是，所述磁珠的優(yōu)選直徑范圍是介于20納米至2000納米之間，以及，每一個所述工作電極的結(jié)構(gòu)中所含有的相互拼接在一起的磁珠的個數(shù)可以允許是根據(jù)需要設(shè)定的任意的個數(shù)，所述個數(shù)不限，但是，構(gòu)成一個所述工作電極的磁珠的個數(shù)的優(yōu)選值是在100個至100000個之間。鑒于每一支所述串珠狀工作電極占用的空間寬度較小，該工作電極能夠允許被直接安置于毛細(xì)管通道內(nèi)，相對窄小的流體通道更有利于展現(xiàn)串珠狀電極的對周邊流動液體的擾動能力，并且，還有利于將其有效工作界面的潛力充分發(fā)揮出來。通過噴涂或點樣儀點樣或其它合適工藝涂布裝設(shè)于所述工作電極表面層的所述金膠敏感膜，其膜層厚度可以允許是任意設(shè)定的可對待測樣液發(fā)生電性信號響應(yīng)的厚度， 但是，推薦的厚度或者說是優(yōu)選的厚度是介于10納米與200納米之間。芯片結(jié)構(gòu)中的所述蓋片及基片，其材質(zhì)可以允許是任何的電絕緣性材質(zhì)，例如聚丙烯、玻璃，等等，優(yōu)選的材質(zhì)是聚甲基丙烯酸甲酯。結(jié)構(gòu)中的所述蓋片及基片其寬度可以允許是能夠達(dá)成相關(guān)測試目的的任意設(shè)定的寬度值，但是，優(yōu)選的所述寬度值是均介于2厘米與4厘米之間；所述蓋片及基片的長度值也一樣可以允許是任意設(shè)定的能夠達(dá)成相關(guān)測試目的的長度值，但是，優(yōu)選的長度值或曰推薦的長度值是介于3厘米與6厘米之間。所述蓋片及基片其厚度可以允許是任意設(shè)定的便于器件裝配的厚度，推薦的厚度或曰優(yōu)選的厚度是介于0. 5毫米與5毫米之間。較小的厚度有利于節(jié)省材料。本案微流控芯片的使用方法采用外加微泵驅(qū)動液流在三通道微流控芯片的毛細(xì)管通道中穩(wěn)定流動，利用三通道電化學(xué)分析儀器分別對不同亞型SIV診斷抗原加以檢測。本案微流控芯片的具體檢測使用步驟如下1、在微管路中加入血清樣品液，在外加微泵驅(qū)動下，各種不同亞型SIV抗原分子被各通道中電極表面上金膠敏感膜包埋的相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的SIV特異性抗體捕獲。2、辣根過氧化物酶標(biāo)記的SIV特異性抗體與血清樣品中的相應(yīng)的SIV抗原形成免疫復(fù)合物。3、采用多通道電化學(xué)分析儀，加入鄰苯二酚等電子媒介體，采用安培法檢測上述反應(yīng)引起的電流變化，由此獲得各種分析物的種類和含量。4、將結(jié)果進(jìn)行綜合分析，對不同亞型SIV抗原進(jìn)行診斷。本發(fā)明的優(yōu)點是，在一塊物理器件即微流控芯片上集成了分別包覆有三種不同亞型的豬流感病毒特異性抗體物質(zhì)的三個串珠狀工作電極，該三個串珠狀工作電極分別針對三種不同亞型SIV的特征抗原進(jìn)行檢測，本案微流控芯片是一種能夠利用多種不同亞型 SIV特異性抗體進(jìn)行同時檢測的微流控芯片，其集成構(gòu)造的結(jié)構(gòu)特點以及特異的串珠狀工作電極形貌有助于提高豬流感病毒診斷效率、降低診斷費用。


圖1是本案微流控芯片實施例構(gòu)造示意圖，所展示的是該例結(jié)構(gòu)的俯視角度下的透視的形態(tài)，圖中未描繪出所述附件，并且，圖中也未對所述串珠狀工作電極的詳細(xì)形貌進(jìn)行放大描繪、展示。圖中，1、2、8分別是三個裝設(shè)位置不同的池狀物，3是歧管狀流體通道，4、9、12分別是裝設(shè)位置不同但相互并聯(lián)形成并聯(lián)聯(lián)通結(jié)構(gòu)的三條分支管道，5是裝設(shè)在分支管道4 內(nèi)的其表層金膠敏感膜結(jié)構(gòu)中的特異性抗體物質(zhì)是亞型H1N1豬流感病毒特異性抗體的串珠狀工作電極，10是裝設(shè)在分支管道9內(nèi)的其表層金膠敏感膜結(jié)構(gòu)中的特異性抗體物質(zhì)是亞型H3N2豬流感病毒特異性抗體的串珠狀工作電極，11是裝設(shè)在分支管道12內(nèi)的其表層金膠敏感膜結(jié)構(gòu)中的特異性抗體物質(zhì)是亞型H1N2豬流感病毒特異性抗體的串珠狀工作電極， 6是對電極，7是參比電極。
具體實施例方式在圖1所展示的本案實施例中，該器件也即微流控芯片的結(jié)構(gòu)包括貼合裝設(shè)在一起的兩片板狀物，兩片板狀物分別是微流控芯片的蓋片以及微流控芯片的基片，在兩片板狀物之間的相互貼合的位置上裝設(shè)有管道，以及，三個池狀物，該三個池狀物分別是池狀物 1、池狀物2和池狀物8，所述管道的一端經(jīng)由歧管狀流體通道3分別與池狀物1以及池狀物 2聯(lián)通，所述管道的另一端與余下的一個池狀物10聯(lián)通，以及，依序分別裝設(shè)在所述管道內(nèi)不同位置上的串珠狀工作電極以及對電極6以及參比電極7，串珠狀工作電極由導(dǎo)電性電極以及貼附在所述導(dǎo)電性電極上的包埋了豬流感病毒特異性抗體抗體的金膠敏感膜構(gòu)成， 所述管道的構(gòu)造呈并聯(lián)構(gòu)造，該呈并聯(lián)構(gòu)造的管道由三條分支管道并聯(lián)構(gòu)成，該三條分支管道分別是分支管道4以及分支管道9以及分支管道12，且串珠狀工作電極的數(shù)量是三個， 該三個串珠狀工作電極分別是串珠狀工作電極5以及串珠狀工作電極10以及串珠狀工作電極11，其中，串珠狀工作電極5是裝設(shè)在分支管道4內(nèi)的其表層金膠敏感膜結(jié)構(gòu)中的特異性抗體物質(zhì)為豬流感病毒特異性抗體H1N1的串珠狀工作電極，串珠狀工作電極10是裝設(shè)在分支管道9內(nèi)的其表層金膠敏感膜結(jié)構(gòu)中的特異性抗體物質(zhì)為豬流感病毒特異性抗體H3N2 的串珠狀工作電極，串珠狀工作電極11是裝設(shè)在分支管道12內(nèi)的其表層金膠敏感膜結(jié)構(gòu)中的特異性抗體物質(zhì)為豬流感病毒特異性抗體H1N2的串珠狀工作電極。圖1中沒有繪出作為附件的微流動泵及多道電化學(xué)工作站等附屬件。本例結(jié)構(gòu)中的各池狀物可以根據(jù)需要與作為附件的微流動泵按任何方式聯(lián)通。本例結(jié)構(gòu)中的各串珠狀工作電極以及對電極以及參比電極可以分別經(jīng)由各自專用的電纜或串線分別與作為附件的多道電化學(xué)工作站的對應(yīng)電纜接口或串線接口聯(lián)接。似乎有必要在這里作一點額外的補(bǔ)充說明抗體與抗原是彼此相關(guān)的但又不同的物質(zhì)，它們之間的相互關(guān)系，通俗一點地比喻，就好比是一套鎖具中的鎖與鑰的關(guān)系。
權(quán)利要求
1.同時檢測多種亞型豬流感病毒(Swineinfluenzavires, SIV)的多通道微流控芯片，該微流控芯片的結(jié)構(gòu)包括貼合裝設(shè)在一起的兩片板狀物，所述兩片板狀物分別是微流控芯片的蓋片以及微流控芯片的基片，在所述兩片板狀物之間的相互貼合的位置上裝設(shè)有管道，以及，三個池狀物，管道的一端經(jīng)由歧管狀流體通道分別與其中的兩個池狀物聯(lián)通， 管道的另一端與余下的一個池狀物聯(lián)通，以及，依序分別裝設(shè)在所述管道內(nèi)不同位置上的工作電極以及對電極以及參比電極，所述工作電極由導(dǎo)電性電極以及貼附在所述導(dǎo)電性電極上的包埋了不同亞型豬流感病毒抗體的金膠敏感膜構(gòu)成，其特征是，所述管道的構(gòu)造呈并聯(lián)構(gòu)造，所述呈并聯(lián)構(gòu)造的管道由三條分支管道并聯(lián)構(gòu)成，以及，所述工作電極的數(shù)量是三個，該三個工作電極的裝設(shè)位置分別位于所述三條分支管道內(nèi)，以及，該三個工作電極其表層金膠敏感膜結(jié)構(gòu)中的特異性抗體分別是對不同亞型豬流感病毒抗原能特異性結(jié)合的三種相應(yīng)豬流感病毒抗體物質(zhì)，該三種抗體物質(zhì)分別是豬流感病毒特異性抗體H1NpH3N2及 H1N2，以及，每一個工作電極其形貌均呈串珠狀。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時檢測多種亞型豬流感病毒的多通道微流控芯片，其特征在于，所述管道以及所述分支管道以及所述歧管狀流體通道均為毛細(xì)管通道。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時檢測多種亞型豬流感病毒的多通道微流控芯片，其特征在于，所述形貌呈串珠狀的工作電極其材質(zhì)是具有導(dǎo)電能力的四氧化三鐵材質(zhì)，以及，所述形貌呈串珠狀的工作電極是由許多的四氧化三鐵材質(zhì)的磁珠在外加磁場條件引導(dǎo)下相互拼接而成的準(zhǔn)一維導(dǎo)電性電極。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的同時檢測多種亞型豬流感病毒的多通道微流控芯片，其特征在于，所述磁珠的直徑介于20納米至2000納米之間，以及，每一個所述工作電極的結(jié)構(gòu)中所含有的相互拼接在一起的磁珠的個數(shù)在100個至100000個之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時檢測多種亞型豬流感病毒的多通道微流控芯片，其特征在于，所述金膠敏感膜的厚度介于10納米與200納米之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時檢測多種亞型豬流感病毒的多通道微流控芯片，其特征在于，結(jié)構(gòu)中的所述蓋片及基片其材質(zhì)均為聚甲基丙烯酸甲酯。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時檢測多種亞型豬流感病毒的多通道微流控芯片，其特征在于，結(jié)構(gòu)中的所述蓋片及基片其寬度均介于2厘米與4厘米之間，其長度均介于3厘米與 6厘米之間。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時檢測多種亞型豬流感病毒的多通道微流控芯片，其特征在于，結(jié)構(gòu)中的所述蓋片及基片其厚度均介于0. 5毫米與5毫米之間。
全文摘要
本發(fā)明是涉及分析測試領(lǐng)域，特別是涉及同時檢測多種亞型豬流感病毒(Swineinfluenza vires，SIV)的多通道微流控芯片?？焖偾伊畠r地診斷SIV是相關(guān)診療技術(shù)進(jìn)步的目標(biāo)之一，本發(fā)明提供一種指向上述目標(biāo)的診斷器件。本案要點是，該器件也即微流控芯片內(nèi)含有呈并聯(lián)構(gòu)造的管道，該并聯(lián)構(gòu)造含有三條相互并聯(lián)的分支管道，共有三個串珠狀工作電極分別裝設(shè)在所述三條分支管道內(nèi)，所述串珠狀工作電極由導(dǎo)電性電極以及貼附在所述導(dǎo)電性電極上的包埋了不同亞型SIV特異性抗體的金膠敏感膜構(gòu)成，該三個串珠狀工作電極表層的各自的金膠敏感膜，分別包埋了三種不同亞型SIV特異性抗體物質(zhì)，該三種不同亞型SIV特異性抗體物質(zhì)分別是亞型H1N1、H3N2及H1N2。
文檔編號G01N27/30GK102478582SQ20111031112
公開日2012年5月30日 申請日期2011年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月8日
發(fā)明者侯建國, 周漢坤, 干寧, 曾少林, 李天華, 李榕生, 楊欣, 金海娟 申請人:寧波大學(xué)