專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)基因點(diǎn)突變的液相芯片和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)基因點(diǎn)突變的液相芯片和方法。
背景技術(shù)：
隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃研究進(jìn)展，越來(lái)越多的證據(jù)表明基因突變?cè)谌祟?lèi)疾病中具有重要作用，通過(guò)對(duì)基因突變的檢測(cè)，可以對(duì)疾病進(jìn)行有效的預(yù)防、診斷和治療?；蛲蛔兪侵赣捎贒NA堿基對(duì)的置換、增添或缺失而引起的基因結(jié)構(gòu)的變化，它包括單個(gè)堿基改變所引起的點(diǎn)突變，或多個(gè)堿基的缺失、重復(fù)和插入，其中以點(diǎn)突變最為常見(jiàn)。點(diǎn)突變所造成的基因理化特性改變甚微，無(wú)疑使點(diǎn)突變的檢測(cè)非常困難。特別是當(dāng)待檢測(cè)的突變基因豐度較低，且存在于大量未發(fā)生突變的野生型基因背景中時(shí)，對(duì)點(diǎn)突變的檢測(cè)變得更加困難。傳統(tǒng)的基因點(diǎn)突變檢測(cè)方法操作復(fù)雜，測(cè)定結(jié)果需經(jīng)電泳、測(cè)序獲得，費(fèi)時(shí)繁瑣，且特異性、敏感性差。液相芯片技術(shù)的出現(xiàn)提高了基因點(diǎn)突變的檢測(cè)靈敏度，其原理是將與待檢測(cè)突變基因互補(bǔ)的一段寡核苷酸序列固定在微球表面，通過(guò)微球表面寡核苷酸與突變基因的反向雜交過(guò)程，檢測(cè)突變基因。相比將寡核苷酸序列固定在玻片表面的傳統(tǒng)生物芯片，液相芯片更有利于提高待檢測(cè)基因與寡核苷酸的雜交效率。但是，如果檢測(cè)樣本中存在大量未發(fā)生突變的野生型基因時(shí)，由于野生型基因與寡核苷酸間的競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)，使得直接通過(guò)液相芯片反向雜交方法檢測(cè)低豐度點(diǎn)突變基因難以實(shí)現(xiàn)。在這種情況下，需要通過(guò)擴(kuò)增反應(yīng)提高突變基因的豐度。然而，由于大量野生型基因背景的存在，普通的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)不僅無(wú)法提高突變基因的相對(duì)豐度，反而可能進(jìn)一步降低檢測(cè)樣本中突變基因的比例。因此，本領(lǐng)域迫切需要一種檢測(cè)低豐度基因點(diǎn)突變的液相芯片和方法
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決目前基因點(diǎn)突變檢測(cè)靈敏度不高、檢測(cè)過(guò)程易受樣本中野生型基因干擾的技術(shù)問(wèn)題，提供一種檢測(cè)基因點(diǎn)突變的液相芯片，該液相芯片適用于大量野生型基因背景下低豐度點(diǎn)突變基因的檢測(cè)。此外，還需要提供一種檢測(cè)基因點(diǎn)突變的方法，該方法顯著提高了突變基因的檢測(cè)靈敏度。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種檢測(cè)基因點(diǎn)突變的液相芯片，包括:針對(duì)基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物對(duì)、微球、以及信號(hào)報(bào)告分子；所述引物對(duì)中的正向引物具有下述式I所示的結(jié)構(gòu):5，-S2-B2-S1-B1-3，(式 I)，式I 中，BI表不正向引物3’端最后一個(gè)喊基，該喊基與待檢測(cè)基因突變位點(diǎn)的喊基互補(bǔ)，與野生型基因不互補(bǔ)；
B2表示人工引入的一個(gè)與突變型和野生型基因均不互補(bǔ)的堿基；SI表示與突變型基因互補(bǔ)的結(jié)合區(qū)3’端序列，長(zhǎng)度為0_4bp ；S2表示與突變型基因互補(bǔ)的結(jié)合區(qū)5’端序列，長(zhǎng)度為10_39bp ；該正向引物5’端設(shè)有連接臂，用于與微球相連接；所述引物對(duì)中的反向引物與突變型基因完全互補(bǔ)，其5’端標(biāo)記有信號(hào)報(bào)告分子。優(yōu)選的，所述SI序列的長(zhǎng)度為l_2bp。 所述連接臂的序列選自下述任意一種:長(zhǎng)度為10_30bp的多聚A、長(zhǎng)度為10_30bp的多聚T、或長(zhǎng)度為6-12個(gè)碳原子的序列。所述反向引物的長(zhǎng)度為15_40bp ;該反向引物5’端標(biāo)記的信號(hào)報(bào)告分子包括:生物素、地高辛、核酸適配體、或熒光染料分子。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種檢測(cè)基因點(diǎn)突變的方法，包括以下步驟:針對(duì)基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)權(quán)利要求1所述的引物對(duì)，該引物對(duì)中的正向引物與微球通過(guò)連接臂相連接，反向引物的5’端標(biāo)記信號(hào)報(bào)告分子；用所述引物對(duì)在油包水乳液中對(duì)待檢測(cè)突變基因進(jìn)行擴(kuò)增；檢測(cè)微球表面的熒光信號(hào)，得檢測(cè)結(jié)果。在本發(fā)明中，突變基因的擴(kuò)增在油包水乳液中進(jìn)行。油包水乳液由水相和油相組成，水相的體積比為10-35% (v/v)，其中包括待檢測(cè)的突變基因、特異性引物，以及其它基因擴(kuò)增所需的反應(yīng)物。油相由一種或多種有機(jī)烴類(lèi)組成，體積比為65-90%。將水相滴加入油相中，并通過(guò)外力使之混合均勻，形成平均粒徑為5-10 μ m的油包水乳液滴。在形成的油包水液滴中，至少有一部分液滴內(nèi)同時(shí)包含待檢測(cè)的一條突變基因、一個(gè)微球，液滴內(nèi)還包括若干特異性引物，以及其它基因擴(kuò)增所需的反應(yīng)物。液滴內(nèi)的突變基因經(jīng)過(guò)擴(kuò)增后，在微球表面形成的突變基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為80-120bp，且?guī)в行盘?hào)報(bào)告分子。通過(guò)上述擴(kuò)增過(guò)程，檢測(cè)樣本中起始的突變分子數(shù)量被轉(zhuǎn)化成了發(fā)生擴(kuò)增的微球數(shù)量。再通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)微球表面的信號(hào)報(bào)告分子即可檢測(cè)出樣本中是否包含突變基因，以及表面發(fā)生擴(kuò)增的微球數(shù)量，從而獲得樣本中突變基因的相對(duì)含量。本發(fā)明檢測(cè)基因點(diǎn)突變的液相芯片，對(duì)現(xiàn)有的液相芯片技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，在油包水乳液中，通過(guò)設(shè)計(jì)的特異性引物有效地?cái)U(kuò)增了樣本中的低豐度突變基因，排除了野生型基因背景的影響，將突變的數(shù)量轉(zhuǎn)化為發(fā)生擴(kuò)增的微球數(shù)量，實(shí)現(xiàn)了微量突變的定量檢測(cè)，同時(shí)顯著提高了突變基因檢測(cè)靈敏度，增強(qiáng)了檢測(cè)信號(hào)的信噪比，使得檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。圖1是本發(fā)明基于液相芯片的檢測(cè)基因點(diǎn)突變的方法示意圖；圖2是本發(fā)明針對(duì)基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物對(duì)與突變基因模板結(jié)合示意圖；圖3是本發(fā)明實(shí)施例1流式細(xì)胞儀得到的突變比例(MT% )與PE熒光陽(yáng)性區(qū)磁珠比例(M2% Gated)間的線(xiàn)性相關(guān)圖；圖4是本發(fā)明實(shí)施例2流式細(xì)胞儀得到的突變比例(MT% )與CY5熒光陽(yáng)性區(qū)磁珠比例(M2% Gated)間的線(xiàn)性相關(guān)圖5是本發(fā)明實(shí)施例3中采用等位基因特異性延伸反應(yīng)(ASPE)與采用本發(fā)明方法時(shí)對(duì)樣本中低豐度突變基因的檢測(cè)結(jié)果比較圖。
具體實(shí)施例方式為了提高大量野生型基因背景下低豐度基因點(diǎn)突變的檢測(cè)靈敏度，本發(fā)明研制出了檢測(cè)基因點(diǎn)突變的液相芯片，包括:針對(duì)基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物對(duì)、微球、以及信號(hào)報(bào)告分子；引物對(duì)中的正向引物具有下述式I所示的結(jié)構(gòu):
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)基因點(diǎn)突變的液相芯片，其特征在于，包括:針對(duì)基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物對(duì)、微球、以及信號(hào)報(bào)告分子； 所述引物對(duì)中的正向引物具有下述式I所示的結(jié)構(gòu): 5，-S2-B2-S1-B1-3，(式 I)， 式I中， BI表示正向引物3’端最后一個(gè)堿基，該堿基與待檢測(cè)基因突變位點(diǎn)的堿基互補(bǔ)，與野生型基因不互補(bǔ)； B2表示人工引入的一個(gè)與突變型和野生型基因均不互補(bǔ)的堿基； SI表示與突變型基因互補(bǔ)的結(jié)合區(qū)3’端序列，長(zhǎng)度為0-4bp ； S2表示與突變型基因互補(bǔ)的結(jié)合區(qū)5’端序列，長(zhǎng)度為10-39bp ； 該正向引物5’端設(shè)有連接臂，用于與微球相連接； 所述引物對(duì)中的反向引物與突變型基因完全互補(bǔ)，其5’端標(biāo)記有信號(hào)報(bào)告分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液相芯片，其特征在于，所述SI序列的長(zhǎng)度為l_2bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液相芯片，其特征在于，所述連接臂的序列選自下述任意一種:長(zhǎng)度為10-30bp的多聚A、長(zhǎng)度為10-30bp的多聚T、或長(zhǎng)度為6_12個(gè)碳原子的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液相芯片，其特征在于，所述反向引物的長(zhǎng)度為15-40bp。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 所述的液相芯片，其特征在于，所述信號(hào)報(bào)告分子包括:生物素、地高辛、核酸適配體、或熒光染料分子。
6.一種檢測(cè)基因點(diǎn)突變的方法，其特征在于，包括以下步驟: 針對(duì)基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)權(quán)利要求1所述的引物對(duì)，該引物對(duì)中的正向引物與微球通過(guò)連接臂相連接，反向引物的5’端標(biāo)記信號(hào)報(bào)告分子； 用所述引物對(duì)在油包水乳液中對(duì)待檢測(cè)突變基因進(jìn)行擴(kuò)增； 檢測(cè)微球表面的熒光信號(hào)，得檢測(cè)結(jié)果。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述油包水乳液由水相和油相組成，水相的體積比為10-35%，油相的體積比為65-90%。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述油包水乳液的液滴平均粒徑為5-10 μ m0
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為80-120bp。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)基因點(diǎn)突變的液相芯片，包括針對(duì)基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物對(duì)、微球、以及信號(hào)報(bào)告分子，該引物對(duì)中，正向引物3’端最后一個(gè)堿基與待檢測(cè)基因突變位點(diǎn)的堿基互補(bǔ)，與野生型基因不互補(bǔ)，該正向引物序列中還人工引入的一個(gè)與突變型和野生型基因均不互補(bǔ)的堿基，該正向引物與微球通過(guò)連接臂相連接；反向引物與突變型基因完全互補(bǔ)，其5’端標(biāo)記有信號(hào)報(bào)告分子。本發(fā)明還公開(kāi)了檢測(cè)基因點(diǎn)突變的方法，包括步驟針對(duì)基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)上述引物對(duì)；用該引物對(duì)在油包水乳液中對(duì)待檢測(cè)突變基因進(jìn)行擴(kuò)增；檢測(cè)微球表面的熒光信號(hào)。本發(fā)明檢測(cè)基因點(diǎn)突變的液相芯片和方法，顯著提高了大量野生型基因背景下低豐度基因點(diǎn)突變的檢測(cè)靈敏度。
文檔編號(hào)G01N21/64GK103103248SQ20111033484
公開(kāi)日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2011年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月28日
發(fā)明者程昌明 申請(qǐng)人:上海生物芯片有限公司