專利名稱：產(chǎn)酸克雷伯氏菌的時間分辨熒光免疫檢測法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種病原菌的檢測，尤其是涉及一種產(chǎn)酸克雷伯氏菌的時間分辨熒光免疫檢測法。
背景技術(shù)：
產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)是重要的條件致病菌，可導(dǎo)致人畜患病， 引起食物中毒等疾病(董捷，等.產(chǎn)酸克雷伯菌引起的食物中毒臨床分析.中華傳染病雜志.2002,20 =315-316)。建立靈敏、特異、快速的檢測技術(shù)，對產(chǎn)酸克雷伯氏菌進(jìn)行監(jiān)測，對疾病的早期預(yù)防能起到積極的指導(dǎo)作用。由于產(chǎn)酸克雷伯氏菌具有不同的血清型，傳統(tǒng)的細(xì)菌形態(tài)和生理生化特性檢測方法并不能滿足疾病防治的需要。分子生物學(xué)手段如定量PCR檢測已開始在病原菌檢測中得到應(yīng)用，但是檢測之前需要提取病原菌核酸，選取內(nèi)標(biāo)基因，設(shè)計(jì)和合成基因引物，樣品的前處理復(fù)雜，過程控制嚴(yán)格，實(shí)驗(yàn)室依賴程度高，限制了其在實(shí)際中的應(yīng)用。免疫檢測技術(shù)方法簡單、特異性強(qiáng)，在國內(nèi)外病原菌檢測中應(yīng)用更為廣泛，其中又以酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和熒光抗體法最為常用。ELISA是以酶為標(biāo)記物，但酶為生物大分子，容易失活，不易保存，大分子的酶易對免疫反應(yīng)造成空間位阻效應(yīng)，同時該法必須通過顯色進(jìn)行信號測定。熒光抗體法是以熒光物質(zhì)為標(biāo)記物，這種標(biāo)記物分子量小，穩(wěn)定，標(biāo)記到抗原或抗體后對免疫反應(yīng)影響小，可以直接測量熒光信號，不需要顯色，彌補(bǔ)了 ELISA法的不足，但由于測量時的背景熒光波長與標(biāo)記物相近，干擾樣品測定，導(dǎo)致測定靈敏度不高。時間分辨熒光免疫檢測(TRFIA)是用稀土離子螯合物作為標(biāo)記物，該螯合物是一種長壽命的熒光物質(zhì)，通過具有時間分辨功能的熒光儀可與短壽命的背景熒光分開，有效消除背景熒光的干擾，該法已在化學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品和環(huán)境等領(lǐng)域(Wu F B, et al. Synthesis of a highly fluorescent beta-diketone-europium chelate and its utility in time-resolved f luoroimmunoassay of serum total thyroxine. Anal Chem, 2002, 74 :5882-5889)得至Ij廣泛關(guān)注，但對產(chǎn)酸克雷伯氏菌的檢測從未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡便快速的產(chǎn)酸克雷伯氏菌的時間分辨熒光免疫檢測法。所述產(chǎn)酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca已于2011年07月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101，保藏中心登記入冊編號為CGMCC No. 5060。本發(fā)明利用時間分辨熒光免疫檢測(TRFIA)法進(jìn)行產(chǎn)酸克雷伯氏菌的檢測。本發(fā)明包括以下步驟1)產(chǎn)酸克雷伯氏菌菌株的微生物學(xué)鑒定；2)制備免抗產(chǎn)酸克雷伯氏菌抗體(IgG)；
3) IgG的Eu3+標(biāo)記及純化； 4)建立產(chǎn)酸克雷伯氏菌TRFIA檢測方法將產(chǎn)酸克雷伯氏菌菌株首先用無菌生理鹽水洗滌，4500r/min，離心5min，棄上清； Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液稀釋，取100 μ L加入到96孔微孔板中包被，用洗滌液沖洗，每孔加入 200 μ L 的 BSA，37°C封閉 2h，洗滌，加入 1 320 稀釋的 Eu3+-IgG 溶液 100 μ L，37°C 振動孵育lh，用洗滌液沖洗，每孔加入200 μ L增強(qiáng)液，振蕩，多標(biāo)記分析儀上測量熒光讀數(shù) CPS ；設(shè)碳酸鹽包被液作陰性對照，以樣品孔的CPS值(P)與對照孔的CPS值(N)之比大于 2(即P/N> 2)時判斷為陽性。在步驟1)中，所述產(chǎn)酸克雷伯氏菌菌株的微生物學(xué)鑒定的具體方法是可采用 Biolog自動生化鑒定系統(tǒng)(GeneIII)進(jìn)行鑒定。在步驟幻中，所述制備免抗產(chǎn)酸克雷伯氏菌抗體(IgG)的具體方法可包括以下步驟(1)將產(chǎn)酸克雷伯氏菌菌株接種于0.5% NaCl的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，27 °C 培養(yǎng)Mh，用甲醛及加熱兩種方法滅活，離心，再加入無菌生理鹽水洗滌，調(diào)整細(xì)菌濃度至 6 X108cfu/mL 備用；(2)選擇2只健康的2 3kg的新西蘭大白兔，背部兩側(cè)皮下多點(diǎn)注射免疫，分4 次免疫，免疫間隔期為2周，第1次免疫時與弗氏完全佐劑1 1混合、乳化，第2次免疫時與弗氏不完全佐劑1 1混合乳化，第3、4次免疫采用菌液注射，每次每只注射劑量為ImL;(3)最后一次免疫10天后，耳靜脈采血，分離血清，用試管凝集法測定抗血清效價，效價達(dá)到1 1280以上方可使用；(4)采用SPA親和層析法從從血清中純化抗體(IgG)，然后脫鹽和冷凍干燥。在步驟(1)中，所述離心的條件可采用4500r/min，5min。在步驟3)中，所述IgG的Eu3+標(biāo)記及純化的具體方法可包括以下步驟Img 的 IgG 抗體溶于 250 μ L Na2CO3-NaHCO3 (0. lmol/L, pH 9. 1)緩沖溶液中，與 0. 2mg的Eu3+標(biāo)記試劑充分混勻，4°C磁力攪拌12h，在pH 7.8的Tris-HCl (0. 05mol/L, 0.9% NaCl)緩沖液4°C透析Mh，其間換透析液兩次。通過蛋白純化系統(tǒng)用kphadex G-50 柱層析(IX 20cm)，洗脫液仍為Tris-HCl緩沖液，監(jiān)測^Onm處吸光度(A28tl)并合并收集蛋白峰，計(jì)算合并液中Eu3+和IgG的濃度，得到純化的IgG標(biāo)記復(fù)合物Eu3+-IgG,復(fù)合物溶液中Eu3+和IgG濃度分別為4. 5X l(T6mol/L和1. 5X l(T6mol/L，標(biāo)記比為3。在步驟4)中，所述Eu3+-IgG溶液的工作濃度可分別采用1 80、1 320、 1 1280、1 5120、1 20480和1 81920稀釋，選擇熒光讀數(shù)CPS接近IO6且P/N值最大的稀釋度為最佳稀釋度；所述包被的條件可分別采用4°C、37°C和60°C的包被溫度，12h、18h和24h的包被時間，固定Eu3+-IgG及菌株濃度，觀察P/N值，選擇最高P/N所對應(yīng)的包被溫度和包被時間。以下給出敏感性試驗(yàn)的方法將產(chǎn)酸克雷伯氏菌(1. OX 108CfU/mL)用包被液作10倍倍比連續(xù)稀釋，觀察P/N > 2所對應(yīng)的最高稀釋倍數(shù)，其對應(yīng)濃度為檢測靈敏度。以下給出重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的方法重復(fù)性通過板內(nèi)變異系數(shù)和板間變異系數(shù)反映。固定細(xì)菌濃度和Eu3+-IgG濃度，在同一塊微孔板上進(jìn)行TRFIA測定，由每個微孔中的CPS值計(jì)算出平均值與標(biāo)準(zhǔn)差，進(jìn)而計(jì)算出板內(nèi)變異系數(shù)=板內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差/平均值X 100% ；用同樣濃度的細(xì)菌和Eu3+-IgG,在5塊板上進(jìn)行TRFIA測定，根據(jù)CPS值計(jì)算板間變異系數(shù)。結(jié)果建立了產(chǎn)酸克雷伯氏菌的時間分辨熒光免疫檢測法，Eu3+-IgG的最佳工作濃度為1 320，最佳包被溫度60°C，最佳包被時間Mh。而對于包被液是否烘干影響不大， 檢測靈敏度為1.0X105cfu/孔，板內(nèi)變異系數(shù)為5. 60%，板間變異系數(shù)為10. 08%。本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點(diǎn)DTRFIA用于產(chǎn)酸克雷伯氏菌的檢測在國內(nèi)外未見報道。2)靈敏度為1. OX IO5Cfu/孔，高于熒光抗體法。應(yīng)用熒光抗體法進(jìn)行病原菌全菌體檢測，需要顯微鏡目測觀察熒光強(qiáng)度大小，主觀性大，由于背景熒光的干擾，檢測靈敏度低，且無法給出具體的靈敏度數(shù)值(參見文獻(xiàn)夏春.間接熒光抗體法快速檢測中國淡水魚主要病原菌·中國獸醫(yī)學(xué)報· 1998，18 =466-468)。3)通過TRFIA測定不同濃度的產(chǎn)酸克雷伯氏菌CPS值表明，該法的范圍寬，能定量檢測。


圖1為TRFIA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在圖1中，橫坐標(biāo)為產(chǎn)酸克雷伯氏菌濃度/(cfu/mL)， 縱坐標(biāo)為熒光讀數(shù)/CPS。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。本發(fā)明的具體步驟是1、產(chǎn)酸克雷伯氏菌菌株的微生物學(xué)鑒定材料及器具=Biolog自動生化鑒定系統(tǒng)(GeneIII)，菌株(由本實(shí)驗(yàn)室分離于日本鰻鱺)。方法采用自動生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。結(jié)果表1為全自動細(xì)菌生化鑒定特性表，其中+為陽性，-為陰性，鑒定結(jié)果為產(chǎn)酸克雷伯氏菌，為92. 1%。表 權(quán)利要求
1.產(chǎn)酸克雷伯氏菌的時間分辨熒光免疫檢測法，其特征在于所述產(chǎn)酸克雷伯氏菌 Klebsiella oxytoca已于2011年07月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCC No. 5060 ；所述檢測法包括以下步驟1)產(chǎn)酸克雷伯氏菌菌株的微生物學(xué)鑒定；2)制備免抗產(chǎn)酸克雷伯氏菌抗體；3)IgG的Eu3+標(biāo)記及純化；4)建立產(chǎn)酸克雷伯氏菌TRFIA檢測方法將產(chǎn)酸克雷伯氏菌菌株首先用無菌生理鹽水洗滌，4500r/min，離心5min，棄上清； Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液稀釋，取100 μ L加入到96孔微孔板中包被，用洗滌液沖洗，每孔加入 200 μ L 的 BSA，37°C封閉 2h，洗滌，加入 1 320 稀釋的 Eu3+-IgG 溶液 100 μ L，37°C 振動孵育lh，用洗滌液沖洗，每孔加入200 μ L增強(qiáng)液，振蕩，多標(biāo)記分析儀上測量熒光讀數(shù) CPS ；設(shè)碳酸鹽包被液作陰性對照，以樣品孔的CPS值與對照孔的CPS值之比大于2時判斷為陽性。
2.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)酸克雷伯氏菌的時間分辨熒光免疫檢測法，其特征在于在步驟1)中，所述產(chǎn)酸克雷伯氏菌菌株的微生物學(xué)鑒定的具體方法是采用Biolog自動生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。
3.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)酸克雷伯氏菌的時間分辨熒光免疫檢測法，其特征在于在步驟2)中，所述制備免抗產(chǎn)酸克雷伯氏菌抗體的具體方法包括以下步驟(1)將產(chǎn)酸克雷伯氏菌菌株接種于0.5%NaCl的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，27°C培養(yǎng)Mh，用甲醛及加熱兩種方法滅活，離心，再加入無菌生理鹽水洗滌，調(diào)整細(xì)菌濃度至 6X108cfu/mL 備用；(2)選擇2只健康的2 3kg的新西蘭大白兔，背部兩側(cè)皮下多點(diǎn)注射免疫，分4次免疫，免疫間隔期為2周，第1次免疫時與弗氏完全佐劑1 1混合、乳化，第2次免疫時與弗氏不完全佐劑1 1混合乳化，第3、4次免疫采用菌液注射，每次每只注射劑量為ImL ；(3)最后一次免疫10天后，耳靜脈采血，分離血清，用試管凝集法測定抗血清效價，效價達(dá)到1 1280以上方可使用；(4)采用SPA親和層析法從從血清中純化抗體，然后脫鹽和冷凍干燥。
4.如權(quán)利要求3所述的產(chǎn)酸克雷伯氏菌的時間分辨熒光免疫檢測法，其特征在于在步驟(1)中，所述離心的條件采用4500r/min，5min。
5.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)酸克雷伯氏菌的時間分辨熒光免疫檢測法，其特征在于在步驟3)中，所述IgG的Eu3+標(biāo)記及純化的具體方法包括以下步驟Img的IgG抗體溶于250 μ L Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液中，與0. 2mg的Eu3+標(biāo)記試劑充分混勻，4°C磁力攪拌12h，在pH 7. 8的Tris-HCl緩沖液4°C透析Mh，其間換透析液兩次。 通過蛋白純化系統(tǒng)用kphadex G-50柱層析，洗脫液仍為Tris-HCl緩沖液，監(jiān)測^Onm處吸光度并合并收集蛋白峰，計(jì)算合并液中Eu3+和IgG的濃度，得到純化的IgG標(biāo)記復(fù)合物 Eu3+-IgG,復(fù)合物溶液中Eu3+和IgG濃度分別為4. 5X 10_6mol/L和1. 5X 10_6mol/L，標(biāo)記比為3。
6.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)酸克雷伯氏菌的時間分辨熒光免疫檢測法，其特征在于在步驟4)中，所述Eu3+-IgG溶液的工作濃度分別采用1 80、1 320,1 1280,1 5120、 1 20480和1 81920稀釋，選擇熒光讀數(shù)CPS接近IO6且P/N值最大的稀釋度為最佳稀釋度。
7.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)酸克雷伯氏菌的時間分辨熒光免疫檢測法，其特征在于所述包被的條件分別采用4°C、37 V和60 V的包被溫度，12h、18h和24h的包被時間，固定 Eu3+-IgG及菌株濃度，觀察P/N值，選擇最高P/N所對應(yīng)的包被溫度和包被時間。
全文摘要
產(chǎn)酸克雷伯氏菌的時間分辨熒光免疫檢測法，涉及一種病原菌的檢測。提供一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡便快速的產(chǎn)酸克雷伯氏菌的時間分辨熒光免疫檢測法。產(chǎn)酸克雷伯氏菌菌株的微生物學(xué)鑒定；制備免抗產(chǎn)酸克雷伯氏菌抗體；IgG的Eu3+標(biāo)記及純化；建立產(chǎn)酸克雷伯氏菌TRFIA檢測方法。靈敏度為1.0×105cfu/孔，高于熒光抗體法。應(yīng)用熒光抗體法進(jìn)行病原菌全菌體檢測，需要顯微鏡目測觀察熒光強(qiáng)度大小，主觀性大，由于背景熒光的干擾，檢測靈敏度低，且無法給出具體的靈敏度數(shù)值。通過TRFIA測定不同濃度的產(chǎn)酸克雷伯氏菌CPS值表明，該法的范圍寬，能定量檢測。
文檔編號G01N21/64GK102507934SQ20111034309
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月2日
發(fā)明者馮建軍, 林鵬, 王藝?yán)? 郭松林 申請人:集美大學(xué)