專利名稱：基于功能化材料的葡萄糖生物傳感器及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)分析檢測，具體是生物傳感器，更具體是基于功能化材料的葡萄糖生物傳感器及其制備方法。
背景技術(shù)：
生物傳感器(biosensor)對生物物質(zhì)敏感并將其濃度轉(zhuǎn)換為電信號進行檢測的儀器。是由固定化的生物敏感材料作識別元件(包括酶、抗體、抗原、微生物、細(xì)胞、組織、核酸等生物活性物質(zhì))與適當(dāng)?shù)睦砘瘬Q能器(如氧電極、光敏管、場效應(yīng)管、壓電晶體等等)及信號放大裝置構(gòu)成的分析工具或系統(tǒng)。生物傳感器具有接受器與轉(zhuǎn)換器的功能。
自從20世紀(jì)60年代酶電極問世以來，生物傳感器獲得了巨大的發(fā)展，已成為酶分析法的一個日益重要的組成部分。生物傳感器的產(chǎn)生是生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、電化學(xué)、熱學(xué)、光學(xué)及電子技術(shù)等多門學(xué)科相互交叉滲透的產(chǎn)物，具有選擇性高、分析速度快、操作簡單、價格低廉等特點，在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、環(huán)保、食品工業(yè)、醫(yī)療診斷等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。
生物傳感器的優(yōu)點是費用和成本低，采用固定化酶作催化劑，可重復(fù)多次使用； 專一性好，只對特定的底物起反應(yīng)，因此一般不需要進行樣品的預(yù)處理，干擾少；分析速度快，通?？稍?分鐘內(nèi)得到結(jié)果；準(zhǔn)確性高，一般相對誤差小于1% ；操作系統(tǒng)簡單，容易實現(xiàn)自動化分析。
生物傳感器包括如下幾種類型(一)酶傳感器是發(fā)展最早，也是目前最成熟的一類生物傳感器。它是在固定化酶的催化作用下，生物分子發(fā)生化學(xué)變化后，通過換能器記錄變化從而間接測定出待測物濃度。目前國際上已研制成功的酶傳感器有20余種，其中最成熟的是葡萄糖傳感器。使用時將酶電極浸入到樣品溶液中，溶液中的葡萄糖即擴散到酶膜上，在固定于酶膜上的葡萄糖氧化酶作用下生成葡萄糖酸，同時消耗氧氣，通過氧電極測定溶液中氧濃度的變化，推測出樣品中葡萄糖的濃度；(二)組織傳感器利用動植物組織中多酶系統(tǒng)的催化作用來檢測待測物。由于所利用的是組織中的酶，無需人工提純過程，因而較穩(wěn)定，使用時間長；(三)微生物傳感器將微生物固定在生物敏感膜上，利用微生物的呼吸作用或所含有的酶類，來測定待測物質(zhì)尤其是發(fā)酵過程中的物質(zhì)濃度；(四)免疫傳感器利用抗原和抗體之間的高度特異性，將抗原(或抗體)結(jié)合在生物敏感膜上，來測定樣品中相應(yīng)抗體(或抗原)的濃度；(五)場效應(yīng)晶體管生物傳感器結(jié)合了晶體管工藝，所需酶或抗體量很少，被認(rèn)為是第三代生物傳感器。目前實際應(yīng)用不多，但發(fā)展?jié)摿薮蟆?br> 近年來，生物傳感器的研制和開發(fā)已取得了顯著的進展，在許多行業(yè)都具有潛在應(yīng)用價值。未來在與分子電子學(xué)、生物電子學(xué)等前沿學(xué)科的結(jié)合過程中，必將創(chuàng)造出更靈敏更新穎的生物傳感器，并將使生物傳感器向著微型化、便攜化和實用化發(fā)展。
中國專利99M9332. 2提出了一種葡糖糖氧化酶的固定方法，該方法應(yīng)用二氧化鈦膏狀物固定葡糖糖氧化酶，并作為電子中間體。該發(fā)明較為新穎，可使用多次，但二氧化鈦電子傳遞效果不比鐵氰化鉀優(yōu)異，靈敏度和準(zhǔn)確度也有限，且多次使用易遇到酶活性保持、酶體脫落等問題。中國專利CN1219676A采用一次性雙電子雙酶生物傳感器用以檢測血液中的膽固醇及葡萄糖等，但這類傳感器需要氧的參與，且容易受血液中氧含量變化的干擾。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供基于功能化材料的葡萄糖生物傳感器。
本發(fā)明的另一目的是提供基于功能化材料的葡萄糖生物傳感器的制備方法。
本發(fā)明基于國家標(biāo)準(zhǔn)GB7665-87對傳感器下的定義是“能感受規(guī)定的被測量并按照一定的規(guī)律轉(zhuǎn)換成可用信號的器件或裝置，通常由敏感元件和轉(zhuǎn)換元件組成”開發(fā)而成，其開發(fā)原理是基于葡萄糖氧化酶(GOD)膜的作用下，葡萄糖發(fā)生氧化反應(yīng)，消耗氧而生成葡萄糖酸內(nèi)脂和過氧化氫。物質(zhì)的量的改變可轉(zhuǎn)換為電信號，其信號變化可用上述的生物傳感器檢測到。
本發(fā)明的基于功能化材料的葡萄糖生物傳感器，其工作電極由石墨烯納米材料制成。
其中，石墨烯納米材料選自鈀納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料、鉬納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料、金納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料、銀納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料、銅納米顆粒/ 石墨烯復(fù)合材料、鍺納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料、三氧化二鐵納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料、 四氧化三鐵納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料、氧化銦錫納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料及氧化銦錫-鉬二元復(fù)合納米顆粒/石墨烯納米復(fù)合材料。
本發(fā)明中，其石墨烯的制備方法選自水合胼還原法外、括膠帶法、SiC基底上外延生長法、硼氫化鈉及水合胼兩步還原法、堿還原法、酸還原法、水熱法、溶劑熱法、化學(xué)氣相沉積法、石墨直接剝離法、微波輔助還原法、碳管剪切法、電化學(xué)還原法、火焰法及自由基還原法。
本發(fā)明的石墨烯納米材料制備方法包括如下步驟a.將石墨烯氧化物分散到二氯亞砜與N，N-二甲基甲酰胺的混合介質(zhì)中，室溫超聲，隨后回流，制備得到棕色酰氯化合物；b.與此同時，將鄰苯二甲酰殼聚糖、LiCl和N，N-二甲基乙酰胺混合，在氮氣保護下 120 150°C反應(yīng)；冷卻該反應(yīng)體系后，c.將a的產(chǎn)物及吡啶加入到反應(yīng)體系中，氮氣保護下回流，過濾，洗滌，真空干燥；d.干燥后的固體在蒸餾水中攪拌，過濾，保留固體重新分散于蒸餾水中，超聲，過濾，洗滌，真空干燥，得中間體PHCS-GO ；e.將d所得中間體分散于水合胼中于60 90°C反應(yīng)，過濾，洗滌，真空干燥，得含活性胺基的中間體CSGR-NH2 ；f.將含活性胺基的中間體CSGR-NH2W入水中，再加入乙二醇，超聲狀態(tài)下逐滴加入金屬納米粒子前體的乙二醇溶液或水溶液，氮氣保護下先在酸性條件下反應(yīng)，后在堿性條件 120 140 °C下反應(yīng)；g.冷卻到室溫后，過濾，洗滌，真空干燥，得石墨烯納米材料納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料。
最合適的石墨烯納米材料制備方法包括如下步驟a.將石墨烯氧化物分散到二氯亞砜與N，N-二甲基甲酰胺的混合介質(zhì)中，室溫超聲20 40min，隨后回流40 60小時，制備得到棕色酰氯化合物；b.與此同時，將鄰苯二甲酰殼聚糖、LiCl和N，N-二甲基乙酰胺混合，在氮氣保護下下 120 150°C反應(yīng)2 4小時；冷卻該反應(yīng)體系后，c.將a的產(chǎn)物及吡啶加入到反應(yīng)體系中，氮氣保護下回流40 60小時，冷卻后，過濾， 洗滌，真空干燥；d.干燥后固體在蒸餾水中攪拌3 9小時，過濾，保留固體重新分散于蒸餾水中，超聲 0. 5 2小時，過濾，洗滌，所得固體在真空下干燥，得中間體PHCS-GO ；e.將d所得中間體分散于水合胼中，60 90°C下反應(yīng)10 M小時，過濾，洗滌，真空干燥得含活性胺基的中間體CSGR-NH2 ；f.將含活性胺基的中間體CSGR-NH2加入水中。再加入乙二醇，超聲20 30分鐘后， 逐滴加入金屬納米粒子前體的乙二醇溶液或水溶液，氮氣保護下先在PH值5-6酸性條件下反應(yīng)12 M小時，后在pH值12-13堿性條件120 140 0C下反應(yīng)；g.冷卻到室溫后，過濾，水洗滌，乙醇洗滌，真空下干燥，得石墨烯納米材料納米顆粒/ 石墨烯復(fù)合材料。
本發(fā)明的基于功能化材料的葡萄糖生物傳感器，是將石墨烯納米材料制成的工作電極用于葡萄糖生物傳感器的組裝而制成，由石墨烯納米材料制成的工作電極的制備方法包括如下步驟a.將玻碳電極打磨，然后進行拋光處理；b.清洗干凈后，室溫晾干備用；c.石墨烯納米材料超聲分散于3% 10%的醋酸中；d.取上述分散液滴于b之后的玻碳電極，干燥；然后，e.在室溫下將該電極用0.1% 1%戊二醛溶液浸泡，隨后用去離子水洗滌并干燥；f.將葡糖糖氧化酶溶液滴于e之后的電極上，1 4°C干燥；之后，g.浸泡在PH=7.5的磷酸鹽緩沖溶液中，于1 4 °C保存?zhèn)溆谩?br> 最合適的由石墨烯納米材料制成的工作電極的制備方法包括如下步驟將玻碳電極先用1200#金相砂紙上打磨，然后依次用1 μπι，0. 3 μπι,Ο. 05 μ m Al2O3 進行拋光處理；a.用蒸餾水清洗干凈后，依次在1:1的HNO3水溶液、無水乙醇、蒸餾水中各超聲清洗 5 10 min，室溫晾干備用；b.取石墨烯納米材料，將其超聲分散于5%的醋酸中；c.取上述分散液5 1O μ L滴于上述玻碳電極表面，干燥后即得納米粒子功能化石墨烯材料修飾電極；d.在室溫下將該電極用0.5%戊二醛溶液浸泡，隨后用去離子水洗滌并室溫干燥；e.將5 1Q yL 4 mg/ml的葡糖糖氧化酶溶液滴于納米粒子功能化石墨烯材料修飾電極上，1 4 °(干燥，即得納米粒子功能化石墨烯材料葡糖糖氧化酶修飾電極；f.上述納米粒子功能化石墨烯材料葡糖糖氧化酶修飾電極用0.05M pH =7. 5磷酸鹽緩沖溶液浸泡1 O 3 0分鐘，取出后再浸泡在0. 05 M pH =7. 5磷酸鹽緩沖溶液中，于1 4 °C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明在多年的研究的基礎(chǔ)上，將石墨烯納米材料用于葡萄糖生物傳感器的組裝中，形成納米功能膜，與使用傳統(tǒng)的酶電極相比，具有高專一性、短時、低費用分析、操作安全，便于現(xiàn)場測定等顯著優(yōu)勢，是糖尿病人日常血糖測量首選器件，具有重要經(jīng)濟及社會意義。納米功能膜固定化酶可以連續(xù)分析1000次以上，并且可以達到一次性消耗酶相同的電流響應(yīng)高度，測定的成本只有幾分錢，分析精度高于其它方法，相對誤差達到1 %左右。且響應(yīng)時間縮短到20秒，使用壽命也大大延長，這種電流式葡萄糖傳感器可以精確的定時測量葡萄糖濃度，高專一性、短時、低費用分析、對分析物質(zhì)沒有特殊的要求，操作安全、簡便，便于現(xiàn)場測定等，可用于糖尿病人日常血糖測量。也為國標(biāo)的普及提供了有利的條件。
本發(fā)明的基于功能化石墨烯納米材料的葡萄糖生物傳感器，是一種定量的測試技術(shù)，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，誤差小，可以用于高效、簡便、快速的測定病人的血糖濃度，因此具有廣闊臨床應(yīng)用前景，是臨床、家用生物傳感器的發(fā)展趨勢。


圖Ia是鈀納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料掃描電鏡圖； 圖Ib是鈀納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料高分辨透射電鏡圖； 圖Ic是鈀納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料電子衍射圖；圖Id是鈀納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料X射線能譜(EDS)； 圖2是石墨烯納米復(fù)合材料典型拉曼光譜； 圖3是鈀納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料及相關(guān)材料的紅外光譜圖； 圖4是鈀納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料及相關(guān)材料的X-射線衍射。
具體實施方式
制備實施例1石墨烯制備改進Hummers法結(jié)合水合胼還原法首先，將石墨(1.5 g, 325目)加入到12 ml濃 H2SO4, 2.5 g K2S2O8和2. 5 g P2O5的混合物中，加熱上述混合體系至80 °C，保持該溫度， 磁力攪拌5小時。隨后冷卻反應(yīng)體系至室溫，將混合物傾入500ml去離子水中，靜置過夜。 將上述靜置物經(jīng)0. 2微米濾膜過濾，洗滌并自然晾干，得預(yù)氧化石墨。將該預(yù)氧化的石墨加入到0 0C的濃H2SO4 120 ml中，隨后緩慢加入15 g KMnO4，并控制反應(yīng)溫度在20 °C攪拌。 高錳酸鉀加畢，控制反應(yīng)體系在35 °C攪拌4小時，隨后，加入250 ml去離子水，并通過外圍冰浴控制溫度在50 °C以下。攪拌1.5小時后，再加入700 ml去離子水，半小時后，逐滴滴入20 ml 30% H2O2，反應(yīng)體系迅速由棕色轉(zhuǎn)變?yōu)樽攸S色。撤去攪拌裝置，過濾該棕黃混合物， 用1 10 HCl 1 L洗滌以除去金屬離子，隨后再用1 L去離子水反復(fù)洗滌，得棕色固體，室溫干燥后，將上述棕色固體制成重量比為0. 5% w/w水分散液，連續(xù)透析一周，最后過濾，洗滌，重新分散超聲1小時，過濾，60 °C真空干燥M小時，即可制備得到石墨烯氧化物。將上述石墨烯氧化物制成100 ml濃度為1 mg/ml分散液，加入水合胼1 ml，超聲30分鐘后再 100 0C回流M小時，過濾，洗滌，60 °C真空干燥M小時，即可制備得到石墨烯；制備實施例2石墨烯納米材料制備(鈀納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料Pd NPs/CSGR) 首先，將石墨烯氧化物200 mg分散到40ml 二氯亞砜與1 ml N，N-二甲基甲酰胺的混合介質(zhì)中，室溫超聲0.5小時，隨后回流52小時，制備得到棕色酰氯化合物219.2 mg。與此同時，將鄰苯二甲酰殼聚糖1.753 g)LiCl 1.201 g和N，N-二甲基乙酰胺120 ml混合，在氮氣保護下140 °C反應(yīng)2小時。冷卻該反應(yīng)體系后，將前一步制得的棕色酰氯化合物219. 2mg及14 ml吡啶加入到反應(yīng)體系中，氮氣保護下回流48小時，冷卻后，過濾，洗滌，真空干燥。干燥后固體在120 ml蒸餾水中攪拌6小時，過濾，保留固體重新分散于200 ml水中，超聲1小時，過濾，洗滌。所得固體在真空65 °C下干燥M小時，得中間體PHCS-GO(205 g)。 將該中間體分散于15 ml水合胼中，80 °C下反應(yīng)16小時去除鄰苯二甲酰保護。過濾，洗滌，真空干燥得含活性胺基的中間體CSGR-NH2 (175 mg)。將含活性胺基的中間體CSGR-NH2 (100 mg)加入1. 5 ml水。隨后，加入10 ml乙二醇，超聲20分鐘，逐滴加入濃度2. 03 mg Pd/ml的氯化鈀乙二醇溶液10 ml，調(diào)節(jié)pH值到5-6，反應(yīng)體系劇烈超聲5分鐘，隨后攪拌 20小時。隨后，用2.5 M的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值到13，140 °C時反應(yīng)3小時，整個反應(yīng)過程均采取氮氣保護。冷卻到室溫后，過濾，水及乙醇洗滌各三次，真空65 °C下干燥對小時，得鈀納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料(Pd NPs/CSGR)；材料表征產(chǎn)物尺寸和形貌的表征是在JEM-2010F透射電鏡(TEM)，JE0L-2010F高分辨透射電鏡 (HRTEM)以及JSM-7401F場發(fā)射掃描電鏡(FESEM)上進行的，電鏡的工作電壓為200 kV。X 射線能譜(EDS)及選區(qū)衍射(SAED)實驗是在JE0L-2010F高分辨透射電鏡下完成的。產(chǎn)物的粉末X射線衍射(XRD)表征是在德國Bruker D8-advance X射線衍射儀上進行的，X射線是單色的CuK α輻射線(λ =1.5418 A)，2 θ掃描角度從10到70°，步長0.02°。傅里葉紅外光譜(FTIR)實驗FTIR-8201 (PerkinElmer公司)紅外光譜儀上進行。紅外光譜分析通過樣品與KBr壓片后進行測試。拉曼光譜選用英國雷紹尼公司Renishaw microprobe RM1000型拉曼光譜儀，激發(fā)波長633 nm(He/Ne激光器)。原子力測試(Atomic force microscopic, AFM)采用美國維易科精密儀器有限公司的Nanoscope III MultiMode SPM (數(shù)顯)型掃描探針原子力顯微鏡。元素分析采用美國EAI公司的CE-440元素分析儀。
鈀納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料表征結(jié)果如下鈀納米粒子的直徑范圍在2-8 nm之間，具有較小的粒徑及較窄帶粒徑分布(依據(jù)掃描電鏡圖Ia及透射電鏡圖Ib表征結(jié)果)； 電子衍射圖(見圖Ic)可觀察到從內(nèi)環(huán)到外環(huán)由強至弱四個衍射環(huán)，分別對應(yīng)于晶態(tài)鈀的 (111)、(200)、(220)、(311)及(400)等晶面。拉曼光譜(見圖2)顯示其在1331 cm—1及1590 cm-1具有特征拉曼峰，分別歸屬為石墨烯的D帶和G帶；紅外光譜(見圖3，其中a.殼聚糖， b.石墨烯，c.殼聚糖修飾的石墨烯，d.鈀納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料)顯示該電極材料(圖 3，d.)具有890 ,1150 cm—1及1545 cm—1特征峰，前兩個峰為殼聚糖的特征峰，第三個峰歸屬為石墨烯的骨架震動。X射線衍射圖(XRD圖，見圖4，其中a.石墨烯，b.鈀納米顆粒/ 石墨烯復(fù)合材料)觀察到鈀納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料對.7。、39.6°、45.5°和67.3° 等四個布拉格反射峰，第一個對應(yīng)于石墨烯的(002)晶面，后三個峰依次對應(yīng)鈀的(111)， (200), (220)晶面；制備實施例3傳感器工作電極制備將玻碳電極先用1200#金相砂紙上打磨，然后依次用1 μπι，0. 3 μπι,Ο. 05 μ m Al2O3 進行拋光處理，用蒸餾水清洗干凈后，在1:1 HNO3水溶液、無水乙醇、蒸餾水中各超聲清洗 5 min，室溫晾干備用。取上述制備的納米粒子功能化石墨烯材料2 mg，將其分散于1 ml 5%的醋酸中，超聲后，取上述分散液8μ L滴于上述玻碳電極表面，干燥后即得納米粒子功能化石墨烯材料修飾電極。在室溫下將該電極用0. 5%戊二醛溶液浸泡，隨后用去離子水洗滌并室溫干燥。將8yL 4 mg/ml的葡糖糖氧化酶(GOD)溶液滴于納米粒子功能化石墨烯材料修飾電極上，4 °(時干燥。上述葡糖糖氧化酶修飾電極用pH= 7. 5的0.05 M磷酸鹽緩沖溶液，浸泡20分鐘以除去未結(jié)合的GOD。將上述制備好的葡糖糖生物傳感器工作電極浸泡在pH= 7. 5的0. 05 M磷酸鹽緩沖溶液于4 0C冰箱中保存?zhèn)溆谩?
應(yīng)用實施例1循環(huán)伏安與交流阻抗測試采用CHI830B電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)，三電極系統(tǒng)為飽和甘汞電極作為殘壁電極，鉬電極為輔助電極，酶電極為工作電極。將制備好的葡糖糖生物傳感器工作電極浸入5 mL pH= 7. 5的0.05 M磷酸鹽緩沖溶液中，均勻攪拌下加入不同體積的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液或者待測溶液，溶解氧信號被氧電極捕捉后，電極電位的變化被輸入計算機數(shù)據(jù)處理器中，并以溶解氧濃度變化的形式輸出，記錄溶解氧濃度下降曲線， 用校正曲線法檢測樣品中葡萄糖含量。結(jié)果顯示，本發(fā)明的基于功能化材料的葡萄糖生物傳感器，具有線性范圍寬、檢出限低、重現(xiàn)性好、壽命長等特點在葡萄糖濃度0.010 1. 10 mmol/L間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系， 線性回歸方程為y(mg/L)=6. 7471x(mmol/L) — 0. 00501 (r=0. 9989)；以3倍空白的標(biāo)準(zhǔn)偏差除以標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率計算傳感器的檢出限為0.2 ymol/L (S/N=3)。由同一張酶膜制成的傳感器對0. 25 m mol/L葡萄糖溶液重復(fù)測定10次，響應(yīng)平均值RSD=2. 5%。將不同的固定化酶膜分別置于氧電極表面制得4個葡萄糖生物傳感器，對0. 25 mmol/L葡萄糖溶液進行測定，RSD=4. 7% ；對該濃度葡萄糖連續(xù)測試200次(約M h)，響應(yīng)信號仍能達到初始值的98%以上；將本葡萄糖生物傳感器存放于4 °C冰箱中，每隔3 4天重復(fù)檢測。0.25 mmol/L葡萄糖溶液的響應(yīng)值。3個月后響應(yīng)信號為初始值的86. 5%。
權(quán)利要求
1.基于功能化材料的葡萄糖生物傳感器，包括工作電極，其特征是工作電極由石墨烯納米材料制成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述生物傳感器，其特征在于石墨烯納米材料選自鈀納米顆粒/ 石墨烯復(fù)合材料、鉬納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料、金納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料、銀納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料、銅納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料、鍺納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料、三氧化二鐵納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料、四氧化三鐵納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料、氧化銦錫納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料及氧化銦錫-鉬二元復(fù)合納米顆粒/石墨烯納米復(fù)合材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物傳感器，其特征在于石墨烯納米材料制備方法包括如下步驟a.將石墨烯氧化物分散到二氯亞砜與N，N-二甲基甲酰胺的混合介質(zhì)中，室溫超聲，隨后回流，制備得到棕色酰氯化合物；b.與此同時，將鄰苯二甲酰殼聚糖、LiCl和N，N-二甲基乙酰胺混合，在氮氣保護下 120 150°C反應(yīng)；冷卻該反應(yīng)體系后，c.將a的產(chǎn)物及吡啶加入到反應(yīng)體系中，氮氣保護下回流，過濾，洗滌，真空干燥；d.干燥后的固體在蒸餾水中攪拌，過濾，保留固體重新分散于蒸餾水中，超聲，過濾，洗滌，真空干燥，得中間體PHCS-GO ；e.將d所得中間體分散于水合胼中于60 90°C反應(yīng)，過濾，洗滌，真空干燥，得含活性胺基的中間體CSGR-NH2 ；f.將含活性胺基的中間體CSGR-NH2W入水中，再加入乙二醇，超聲狀態(tài)下逐滴加入金屬納米粒子前體的乙二醇溶液或水溶液，氮氣保護下先在酸性條件下反應(yīng)，后在堿性條件 120 140 °C下反應(yīng)；g.冷卻到室溫后，過濾，洗滌，真空干燥，得石墨烯納米材料納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物傳感器，其特征在于石墨烯納米材料制備方法包括如下步驟a.將石墨烯氧化物分散到二氯亞砜與N，N-二甲基甲酰胺的混合介質(zhì)中，室溫超聲 20 40min，隨后回流40 60小時，制備得到棕色酰氯化合物；b.與此同時，將鄰苯二甲酰殼聚糖、LiCl和N，N-二甲基乙酰胺混合，在氮氣保護下下 120 150°C反應(yīng)2 4小時；冷卻該反應(yīng)體系后，c.將a的產(chǎn)物及吡啶加入到反應(yīng)體系中，氮氣保護下回流40 60小時，冷卻后，過濾， 洗滌，真空干燥；d.干燥后固體在蒸餾水中攪拌3 9小時，過濾，保留固體重新分散于蒸餾水中，超聲 0. 5 2小時，過濾，洗滌，所得固體在真空下干燥，得中間體PHCS-GO ；e.將d所得中間體分散于水合胼中，60 90°C下反應(yīng)10 M小時，過濾，洗滌，真空干燥得含活性胺基的中間體CSGR-NH2 ；f.將含活性胺基的中間體CSGR-NH2加入水中；再加入乙二醇，超聲20 30分鐘后， 逐滴加入金屬納米粒子前體的乙二醇溶液或水溶液，氮氣保護下先在PH值5-6酸性條件下反應(yīng)12 M小時，后在pH值12-13堿性條件120 140 0C下反應(yīng)；g.冷卻到室溫后，過濾，水洗滌，乙醇洗滌，真空下干燥，得石墨烯納米材料納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述生物傳感器的制備方法，其特征在于將石墨烯納米材料制成的工作電極用于葡萄糖生物傳感器的組裝而制成，由石墨烯納米材料制成的工作電極的制備方法包括如下步驟a.將玻碳電極打磨，然后進行拋光處理；b.清洗干凈后，室溫晾干備用；c.石墨烯納米材料超聲分散于3% 10%的醋酸中；d.取上述分散液滴于b之后的玻碳電極，干燥；然后，e.在室溫下將該電極用0.1% 1%戊二醛溶液浸泡，隨后用去離子水洗滌并干燥；f.將葡糖糖氧化酶溶液滴于e之后的電極上，1 4°C干燥；之后，g.浸泡在PH=7.5的磷酸鹽緩沖溶液中，于1 4 °C保存?zhèn)溆谩?br> 6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述生物傳感器的制備方法，其特征在于將石墨烯納米材料制成的工作電極用于葡萄糖生物傳感器的組裝而制成，由石墨烯納米材料制成的工作電極的制備方法包括如下步驟a.將玻碳電極先用1200#金相砂紙上打磨，然后依次用1μπι，0.3 μπι,Ο. 05 μπι Al2O3進行拋光處理；b.用蒸餾水清洗干凈后，依次在1:1的HNO3水溶液、無水乙醇、蒸餾水中各超聲清洗 5 10 min，室溫晾干備用；c.取石墨烯納米材料，將其超聲分散于5%的醋酸中；d.取上述分散液5 IOyL滴于上述玻碳電極表面，干燥后即得納米粒子功能化石墨烯材料修飾電極；e.在室溫下將該電極用0.5%戊二醛溶液浸泡，隨后用去離子水洗滌并室溫干燥；f.將5 IOyL4 mg/ml的葡糖糖氧化酶溶液滴于納米粒子功能化石墨烯材料修飾電極上，1 4 °(干燥，即得納米粒子功能化石墨烯材料葡糖糖氧化酶修飾電極；g.上述納米粒子功能化石墨烯材料葡糖糖氧化酶修飾電極用0.05M pH =7. 5磷酸鹽緩沖溶液浸泡10 30分鐘，取出后再浸泡在0. 05 M pH =7. 5磷酸鹽緩沖溶液中，于1 4 °C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
基于功能化材料的葡萄糖生物傳感器，其工作電極由石墨烯納米材料制成，是將石墨烯納米材料制成的工作電極用于葡萄糖生物傳感器的組裝而制成，是一種定量的測試技術(shù)，表現(xiàn)出良好的線性和分辨率，檢測靈敏度、檢測范圍、檢測速度有所提高；尤其在人體血糖濃度范圍內(nèi)，響應(yīng)電流幅度可提高50％，分辨率提高了兩倍以上。石墨烯納米材料形成納米功能膜，其固定化酶可以連續(xù)分析1000次以上，測定的成本低，分析精度高于其它方法，相對誤差達到1％左右，且響應(yīng)時間縮短到20秒，使用壽命也大大延長，可以精確的定時測量葡萄糖濃度，高專一性、短時、低費用分析、對分析物質(zhì)沒有特殊的要求，操作安全、簡便，便于現(xiàn)場測定等，可用于糖尿病人日常血糖測量。
文檔編號G01N27/327GK102507693SQ20111034324
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月3日
發(fā)明者程金生 申請人:桂林醫(yī)學(xué)院