專利名稱：一種甘木通黃酮類成分的檢測方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及中藥、飲片、提取物及制劑中黃酮類成分的檢測技術(shù)，特別是涉及一種甘木通藥材提取物中黃酮類成分的檢測方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甘木通(Clematis filamentosa Dunn)俗稱眼蛇藥，為毛茛科絲鐵線蓮屬植物，主要分布在廣東、廣西、海南、云南等地，在粵北乳源山區(qū)有較為豐富的野生資源，對心血管疾病(冠心病、高血壓)有顯著療效。甘木通中黃酮類化合物是其有效成分之一。以甘木通為原料生產(chǎn)的“冠心康片”臨床治療冠心病心絞痛、高血壓等療效突出。 冠心康片用于肝經(jīng)有熱、肝陽上亢、脈絡(luò)瘀阻所致之頭痛眩暈、胸痹心痛、肢體麻木等癥，還適用于防治心血管疾病，特別是冠心病和高血壓的治療，同時具有用量少、藥效長、無副作用等優(yōu)點?，F(xiàn)有的甘木通中黃酮類成分的檢測方法有以蘆丁為對照品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以 75%乙醇為溶劑，在90°C加熱回流提取甘木通莖、葉中總黃酮類成分，用紫外分光光度法在波長510nm處測定總黃酮含量。但是這種應(yīng)用紫外分光光度法檢測甘木通中黃酮類成分的檢測方法專屬性較差，不能反映本藥材黃酮類具體成分的含量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于填補現(xiàn)有甘木通黃酮類成分檢測技術(shù)的不足，提供一種新的甘木通黃酮類成分的檢測方法。是一種利用甘木通藥材、總黃酮提取物或制劑指紋圖譜進行檢測的方法，并通過確定科學(xué)的檢測保證藥材、提取物、制劑的質(zhì)量更加安全、可靠。本發(fā)明的另一個目的是提供所述方法的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)本發(fā)明提供一種甘木通黃酮類成分的檢測方法，以含山柰素的甲醇溶液為對照品溶液，采用高效液相色譜法對供試品溶液中甘木通黃酮類成分進行定性和/或定量分析； 所述對照品溶液中每ImL甲醇含5 110 μ g山柰素。所述檢測條件為采用填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠的色譜柱，流動相為甲醇與水(或緩沖鹽溶液)、甲醇與酸水、或乙腈與水(或緩沖鹽溶液)或乙腈與酸水的混合物；等度或梯度洗脫； 流速0. 1 1. 5mL/min ；檢測波長200 400nm ；進樣量1 20 μ L ；采用黃酮類標(biāo)準(zhǔn)品為內(nèi)標(biāo)或外標(biāo)，進行黃酮類成分含量測定。本發(fā)明進一步提供更為優(yōu)選的檢測條件為。18(Φ4· 6mmX250mm, 5 μ m)色譜柱；流速:0. 1 1. 5mL/min，柱溫20 50°C ；檢測波長200 400nm ；進樣量:1 20 μ L ；流動相乙腈(A)-O. 冰乙酸水溶液(B)，采用梯度洗脫Α 相梯度0 15min，13% ；15 30min，13%— 17% ；30 50min，17%— 22% ； 50 60min，22%— 27% ；60 75min，27%— 37%。
優(yōu)選的檢測波長為3^nm、2Mnm或370nm。具體地，本發(fā)明所述供試品溶液的制備方法包括以下幾種步驟(1)所述供試品溶液通過以下方法制備得到取過三號篩的待測藥材粉末 1 50. Og,精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入體積比濃度為30 80 %乙醇5 500mL， 稱定重量，超聲提取0. 5 3.證，放冷，再稱定重量，用體積比濃度為30 80%乙醇補足減失重量，搖勻，濾過，重復(fù)提取1 5次，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，用水稀釋至5 150mL，每次加入石油醚(60 90°C ) 5 150mL萃取2 5次，石油醚液棄去；水層繼續(xù)用 5 150mL乙酸乙酯萃取2 5次，合并乙酸乙酯液并減壓蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至 10 250mL,過0. 22 0. 45 μ m微孔濾膜即得?；蛘?，步驟(1)所述供試品溶液通過以下方法制備得到取過三號篩的藥材粉末 1 50. 0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入體積比濃度為30 80%乙醇5 500mL， 稱定重量，微波提取三次，第一次功率560 500w，提取時間10 20min ；放冷，再稱定重量，用體積比濃度為30 80 %乙醇補足減失重量，搖勻，濾過，重復(fù)提取3次，第二次功率 500 400w，提取時間10 20min ；第三次功率400 350w，提取時間10 20min ；合并提取液，減壓濃縮至無醇味，用水稀釋至5 150mL，每次加入石油醚(60 90°C ) 5 150mL 萃取2 5次，石油醚液棄去；水層繼續(xù)用5 150mL乙酸乙酯萃取2 5次，合并乙酸乙酯液并減壓蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至10 250mL，過0. 22 0. 45 μ m微孔濾膜，即得?；蛘?，步驟(1)所述供試品溶液通過以下方法制備得到取過三號篩的待測藥材粉末1 50. 0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入體積比濃度為30 80%乙醇5 500mL，稱定重量，索氏回流提取0. 5 3.證，放冷，再稱定重量，用體積比濃度為30 80% 乙醇補足減失重量，搖勻，濾過，重復(fù)提取1 5次，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，用水稀釋至5 150mL，每次加入石油醚(60 90°C ) 5 150mL萃取2 5次，石油醚液棄去；水層繼續(xù)用5 150mL乙酸乙酯萃取2 5次，合并乙酸乙酯液并減壓蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至10 250mL,過0. 22 0. 45 μ m微孔濾膜，即得；或者，步驟(1)所述供試品溶液通過以下方法制備得到取過三號篩的藥材粉末 1 50. Og,精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水5 500mL，稱定重量，加水煎煮兩次，第一次2小時，第二次1小時，濾過，合并濾液，濃縮至適量，加入乙醇使含醇量達65 70%， 靜置，濾過，濾液濃縮至無醇味，用水稀釋至5 150mL，每次加入石油醚(60 90°C ) 5 150mL萃取2 5次，石油醚液棄去；水層繼續(xù)用5 150mL乙酸乙酯萃取2 5次，合并乙酸乙酯液并減壓蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至10 250mL，過0. 22 0. 45 μ m微孔濾膜，即得。通過有效性評價，本發(fā)明所述檢測方法的專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、測定范圍以及耐用性較好。本發(fā)明所述的檢測方法，其中優(yōu)選在326nm、2Mnm或370nm波長下山奈素對照的色譜圖的保留時間與峰面積，再使用matlab 7. 1進行編程，將不同波長下的色譜圖中相同組分按最大峰面積覆蓋融合。本發(fā)明所述的檢測方法，可應(yīng)用于檢測提取方法相同或相近的含有甘木通組成的任何一種提取物、制劑、飲片或藥材；所述制劑包括顆粒劑、膠囊、片劑、丸劑、軟膠囊劑、滴丸劑等。與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明具有以下有益效果(1)本發(fā)明建立了高效液相指紋圖譜檢測黃酮類成分含量的方法，與現(xiàn)有檢測方法相比較，專屬性良好，能準(zhǔn)確反映甘木通黃酮類具體某成分的含量。(2)本發(fā)明首次采用高效液相色譜法對甘木通中黃酮類成分中的12個共有峰進行了分離，并以山奈素為內(nèi)標(biāo)，建立了甘木通中黃酮類成分定性以及定量分析的科學(xué)方案， 提高了藥材、制劑、提取物的檢測標(biāo)準(zhǔn)，從而有效確保了含甘木通的品種均一、穩(wěn)定、有效、 可控，保證了工藝的規(guī)范化和質(zhì)量的穩(wěn)定一致。(3)本發(fā)明提供的檢測方法，其優(yōu)點是簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好、易于掌握， 能從色譜的整體特征面貌上把握甘木通藥材、飲片、其提取物和制劑的品種和質(zhì)量情況。


圖1波長下對照品山奈素的色圖譜；圖2326nm波長下樣品的色圖譜；圖3326nm波長下樣品中添加內(nèi)標(biāo)山奈素的色圖譜；圖4326nm波長下甘木通總黃酮的色圖譜；圖5指紋圖譜各共有指紋峰；圖6254nm波長下甘木通總黃酮的色圖譜；圖7370nm波長下甘木通總黃酮的色圖譜。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施例詳細說明本發(fā)明。實施例1Waters 600高效液相色譜儀，紫外檢測器、柱溫箱；色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑=XBridge Shield RP18 6_X 250_，5 μ m)。乙腈(色譜純，美國默克公司)，超純水；其它試劑為分析純。1、供試品溶液的制備取甘木通藥材粉末(過三號篩)5. 0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入體積比濃度為80 %的乙醇50mL，稱定重量，加熱回流1. 5h，放冷，再稱定重量，用80%乙醇補足減失重量，搖勻，濾過，濾液減壓濃縮至無醇味，用水稀釋至15mL，每次加入石油醚(60 90°C ) 15mL萃取2次，石油醚液棄去；水層繼續(xù)用15mL乙酸乙酯萃取 2次，合并乙酸乙酯液并減壓蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至IOOmL,過0. 45 μ m微孔濾膜， 即得供試品溶液。2、內(nèi)標(biāo)溶液的制備精密稱取山柰素對照品適量，用甲醇配制成每ImL含11. 2μ g 的內(nèi)標(biāo)溶液。3、進行高效液相色譜測定參照中國藥典2010版一部附錄VI D進行測定。流動相梯度流動相乙腈(A)-O. 冰乙酸水溶液(B)，采用梯度洗脫A相梯度:0 15min， 13% ；15 30min，13%— 17% ；30 50min，17%— 22% ；50 60min，22%— 27% ；60 75min, 27%- 37% ；流速1. OmL/min ；檢測波長326nm ；進樣量20 μ L，理論塔板數(shù)計算，應(yīng)不低于3000 ；
4、方法學(xué)考察，其中包括專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及線形范圍。4. 1內(nèi)標(biāo)物的選擇用內(nèi)標(biāo)溶液、樣品溶液，按照上述色譜條件測試，結(jié)果樣品HPLC圖譜中在與內(nèi)標(biāo)液山奈素HPLC圖譜中相同保留時間處未出現(xiàn)色譜峰，樣品中加入內(nèi)標(biāo)液HPLC圖，樣品中與山奈素相鄰的峰達到很好分離，見附圖1 5所示。如附圖5所示，有13個共有峰，各特征峰以13號峰(RT = 72. 59)為參照峰，相對保留時間分別為0.067,0. 126,0. 135,0. 204， 0. 314,0. 361，0. 420,0. 436,0. 578,0. 589,0. 845，1. 00。在 326nm 波長下測得山奈素的保留時間是72. 59，峰面積分別是524684，樣品中對應(yīng)的峰是13號。采用相同的方法分別在 254nm和370nm波長下檢測甘木通總黃酮，檢測得到的色圖譜見附圖6和附圖7所示。附圖中橫坐標(biāo)代表出峰時間(分鐘)，縱坐標(biāo)代表峰的高度。4. 2內(nèi)標(biāo)溶液線性關(guān)系考察精密稱取山奈素對照品適量，加甲醇制成每Iml含11. 2 μ g的溶液，精密吸取2、4、 8、12、16、20 μ 1，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，以山奈素峰面積值為Y，進樣量為χ( μ g)，進行線性回歸，得線性方程=Y = 2328. 4X-4947. l，r = 0. 9999。結(jié)果表明，山柰素在22. 4 22^g的范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。見表1所示。表1內(nèi)標(biāo)物線性關(guān)系實驗數(shù)據(jù)
進樣體積(μ 1)248121620進樣量(μ g)22. 444. 889. 6134. 4179. 2224峰面積49556991062001453092694108275182564. 3樣品與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值與樣品含量線性關(guān)系考察取甘木通藥材粉末(過三號篩)5. Og,精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入體積比濃度為80%的乙醇50mL，稱定重量，加熱回流1. 5h，放冷，再稱定重量，用80 %乙醇補足減失重量，搖勻，濾過，濾液減壓濃縮至無醇味，用水稀釋至15mL，每次加入石油醚(60 900C ) 15mL萃取2次，石油醚液棄去；水層繼續(xù)用15mL乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯液并減壓蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至25mL，分別精密量取5、4、3、2、ImL置IOmL量瓶中，加甲醇至刻度，過0. 45 μ m微孔濾膜，得各供試樣品溶液。各供試樣品分別與濃度為11. 2 μ g/mL的內(nèi)標(biāo)溶液按1:1(體積比)均勻混合， 按照測定方法進樣，計算樣品中12號峰與13號峰(山奈素)的面積比值，以及供試樣品取樣量(mL)/10的比值，對兩個比值進行線性回歸，得回歸方程為Y = 1. 9056Χ+0. 0066 (r = 0. 9999)；實驗表明樣品中黃酮類成分以12號峰計，與內(nèi)標(biāo)物山奈素的峰面積比與樣品中 12號峰含量呈良好的線性關(guān)系。4. 4精密度試驗取內(nèi)標(biāo)溶液連續(xù)測定六次，結(jié)果6次測定圖譜中對照品的峰保留時間和峰面積的 RSD均小于2%，證明儀器精密度良好。表2對照品HPLC精密度數(shù)據(jù)表
權(quán)利要求
1.一種甘木通黃酮類成分的檢測方法，其特征在于是以含山柰素的甲醇溶液為對照品溶液，采用高效液相色譜法對供試品溶液中甘木通黃酮類成分進行定性和/或定量分析； 所述檢測條件為C18 (φ 4. 6 讓 X25(toim，5ym)色譜柱；流速0. 1 1. 5mL/min，柱溫20 50 °C ；檢測波長200 400nm;進樣量1 20yL;流動相乙腈(A)-O. 冰乙酸水溶液(B)，采用梯度洗脫A 相梯度0 15min，13% ；15 30min，13%— 17% ；30 50min，17%— 22% ； 50 60min，22%— 27% ；60 75min，27%— 37% ；所述對照品溶液是每ImL甲醇含5 110 μ g山柰素的溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘木通黃酮類成分的檢測方法，其特征在于步驟(1)所述供試品溶液通過以下方法制備得到取待測藥材粉末，經(jīng)加水煎煮或乙醇提取得到提取液，再經(jīng)石油醚萃取后取水層，水層用乙酸乙酯萃取得到的萃取液蒸干而得殘渣，殘渣加甲醇溶解并定容后過微孔濾膜，制得供試品溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的甘木通黃酮類成分的檢測方法，其特征在于所述乙醇提取是索氏回流提取、超聲提取或微波提取。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘木通黃酮類成分的檢測方法，其特征在于所述檢測波長為 326nm>254nm^ 370nmo
5.一種權(quán)利要求1、2、3或4所述檢測方法的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于檢測提取方法相同或相近的含有甘木通組成的提取物、制劑、飲片或藥材中黃酮類成分。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述檢測方法的應(yīng)用，其特征在于所述制劑為顆粒劑、膠囊、片劑、 丸劑、軟膠囊劑或滴丸劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甘木通黃酮類成分的檢測方法及應(yīng)用。本發(fā)明以含山柰素的甲醇溶液為對照品溶液，采用高效液相色譜法對配制好供試品溶液中甘木通黃酮類成分進行定性和/或定量分析。本發(fā)明可應(yīng)用于檢測提取方法相同或相近的含有甘木通組成的提取物、制劑、飲片或藥材中黃酮類成分的檢測，陰性無干擾，具有較強的專屬性和良好的重現(xiàn)性，可有效確保含甘木通的制劑品種均一、穩(wěn)定、有效、可控，保證了工藝的規(guī)范化和質(zhì)量的穩(wěn)定一致。
文檔編號G01N30/88GK102426207SQ201110350669
公開日2012年4月25日 申請日期2011年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月8日
發(fā)明者鄧亞利 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)