專利名稱：沙丁胺醇半定量檢測試劑卡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種沙丁胺醇半定量檢測試劑卡，屬于免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。 技術(shù)背景
沙丁胺醇，又名舒喘寧，為選擇性β2受體激動劑。對動物具有促進(jìn)骨骼肌(瘦肉) 生長，減少脂肪蓄積等作用。常在豬、牛、雞等畜禽的生產(chǎn)中非法用作促生長劑，可提高飼料轉(zhuǎn)化率、增加瘦肉產(chǎn)量。但是，食品中沙丁胺醇的殘留能引起心悸、頭疼、目眩、呼吸困難，嚴(yán)重影響人們的健康。另外，檢測沙丁胺醇?xì)埩舻募夹g(shù)手段也相對滯后。因此，一些不法分子為謀取經(jīng)濟(jì)利益，在養(yǎng)殖場非法使用沙丁胺醇代替“瘦肉精”克倫特羅作為促生長劑。因此， 在抓緊源頭控制沙丁胺醇非法使用的同時，必須加強(qiáng)其安全檢測。
目前，檢測沙丁胺醇的方法有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、高效液相色譜法 (HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)以及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。GC-MS、HPLC和 LC-MS方法準(zhǔn)確可靠，但樣品前處理繁瑣，對儀器設(shè)備以及操作過程的要求較高，不適于生產(chǎn)、基層單位及現(xiàn)場檢測。ELISA檢測是一種基于抗原抗體反應(yīng)和酶化學(xué)反應(yīng)的檢測方法， 具有快速、靈敏、操作簡單和一次檢測樣品量大的特點(diǎn)，而且不需要復(fù)雜昂貴的的儀器設(shè)備，對操作者的專業(yè)要求也比較低。但該方法仍需酶標(biāo)儀等設(shè)備，分析時間0. 5-3小時，難以在現(xiàn)場采用。
為進(jìn)一步優(yōu)化檢測方法，使對沙丁胺醇的檢測更方便、時間更短、成本更低，相關(guān)單位開展了沙丁胺醇膠體金檢測試紙條研究，并有“沙丁胺醇快速檢測試紙條”、“ β -興奮劑沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺三元檢測試紙條及其制備方法”的報道，報道中所描述的技術(shù)只能定性檢測，且組合線只有2條，不能進(jìn)行定量檢測。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能夠快速、靈敏、簡便地實(shí)現(xiàn)對沙丁胺醇進(jìn)行半定量檢測的沙丁胺醇半定量檢測試劑卡。
本發(fā)明解決上述技術(shù)領(lǐng)域采取的技術(shù)方案一種沙丁胺醇半定量檢測試劑卡，其包括外殼和設(shè)置在外殼內(nèi)的試紙條；所述試紙條包括基層PVC板、粘貼在所述基層PVC板中央部位的檢測反應(yīng)部分、分別粘貼在所述檢測反應(yīng)部分左、右兩端的膠體金墊和吸水墊，以及粘貼在所述膠體金墊左端的樣品墊；所述檢測反應(yīng)部分為硝酸纖維膜，其表面從左到右依次設(shè)置有兩條以上包有濃度依次降低的沙丁胺醇檢測用偶合抗原的檢測線以及一條包被有羊抗鼠IgG的質(zhì)控線，所述膠體金墊為載有膠體金標(biāo)記的沙丁胺醇單克隆抗體的玻璃纖維墊，所述吸水墊為吸水棉漿板，所述樣品墊為引水玻璃纖維墊；所述外殼上設(shè)置有加樣孔和觀測窗，所述加樣孔與試紙條的樣品墊相對應(yīng)，所述觀測窗和試紙條的檢測反應(yīng)部分相對應(yīng)。
所述沙丁胺醇檢測用偶合抗原為沙丁胺醇與蛋白質(zhì)類物質(zhì)采用琥珀酸酐法和碳二亞胺法形成的偶合物。
所述蛋白質(zhì)類物質(zhì)為牛血清白蛋白或卵清白蛋白。
所述檢測線之間的距離為2.5mm。
所述檢測線上包被的沙丁胺醇檢測用偶合抗原的濃度大于0. 3 μ g/mL,質(zhì)控線上包被的羊抗鼠IgG的濃度為0. 1 μ g/mL。
本發(fā)明沙丁胺醇半定量檢測試劑卡的有益效果1、特異性強(qiáng)本發(fā)明試劑卡采用了高質(zhì)量的抗沙丁胺醇單克隆抗體，與萊克多巴胺、 異丙腎上腺素、去甲腎上腺素、土霉素、金霉素、氯霉素、磺胺二甲嘧啶等常用獸藥無交叉反應(yīng)。
2、準(zhǔn)確性好本發(fā)明試劑卡能夠半定量檢測。可根據(jù)實(shí)際檢測需要，檢測試劑卡可半定量檢測試劑卡檢測限以上的任何濃度范圍。用本試劑卡檢測結(jié)果與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)等儀器方法檢測結(jié)果相關(guān)性完全符合要求。
3、可操作性強(qiáng)本發(fā)明試劑卡根據(jù)顏色變化判斷結(jié)果，無需任何儀器設(shè)備，不需專業(yè)操作人員，適合現(xiàn)場檢測。
4、檢測速度快本發(fā)明試劑卡滴入檢測樣品后，3-5分鐘即可觀察結(jié)果。


圖1為本發(fā)明試劑卡的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明試劑卡中試劑條的結(jié)構(gòu)示意圖。
在附圖中1觀測窗、2加樣孔、3質(zhì)控線、4檢測線、5樣品墊、6膠體金墊、7檢測反應(yīng)部分、8吸水墊、9基層PVC板。
具體實(shí)施方式
如圖1和圖2所示，本發(fā)明包括外殼和設(shè)置在外殼內(nèi)的試紙條；所述試紙條包括基層PVC板、粘貼在所述基層PVC板中央部位的檢測反應(yīng)部分、分別粘貼在所述檢測反應(yīng)部分左、右兩端的膠體金墊和吸水墊，以及粘貼在所述膠體金墊左端的樣品墊；所述檢測反應(yīng)部分為硝酸纖維膜，其表面從左到右依次設(shè)置有兩條以上包有濃度依次降低的沙丁胺醇檢測用偶合抗原的檢測線以及一條包被有羊抗鼠IgG的質(zhì)控線，所述膠體金墊為載有膠體金標(biāo)記的沙丁胺醇單克隆抗體的玻璃纖維墊，所述吸水墊為吸水棉漿板，所述樣品墊為引水玻璃纖維墊；所述外殼上設(shè)置有加樣孔和觀測窗，所述加樣孔與試紙條的樣品墊相對應(yīng)，所述觀測窗和試紙條的檢測反應(yīng)部分相對應(yīng)。
本發(fā)明試劑卡的制備方法為1、沙丁胺醇偶合抗原合成采用琥珀酸酐法，將160 mg沙丁胺醇加入20 mL甲醇中，使之溶解，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后加入30ml無水乙醇，室溫攪拌4h，充分溶解后加入90 mg琥珀酸酐，磁力攪拌使之反應(yīng)72 h得沙丁胺醇琥珀酸衍生物(Sal-HS)。稱取(SAL_HS)40 mg溶于4 mL Tris-Hcl緩沖液中，充分溶解后緩緩加入碳二亞胺80mg，室溫攪拌過夜。取BSA 20 mg溶于Tris-Hcl緩沖液中，充分溶解后，將BSA溶液逐滴加入上述反應(yīng)液中，攪拌反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后，裝入透析袋透析48h，期間換液(PBS) 6 9次，即成免疫抗原(Sal- BSA )。 檢測抗原(Sal -OVA)的制備同免疫抗原。3/4頁
2、沙丁胺醇單克隆抗體制備選擇8周齡Balb/c小鼠，初次基礎(chǔ)免疫采用頸背部皮下多點(diǎn)注射福氏完全佐劑與等體積免疫原SAL-BSA ；二次基礎(chǔ)免疫采用頸背部皮下多點(diǎn)注射福氏不完全佐劑與等體積免疫原SAL-BSA。免疫間隔為2周。斷尾取血分離血清，間接 ELISA檢測小鼠血清抗體效價。選取最佳免疫小鼠，于融合前3d腹腔注射免疫原50 yg加強(qiáng)免疫。取對數(shù)生長期的小鼠SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞，按常規(guī)方法進(jìn)行融合。檢測培養(yǎng)上清抗體效價，選擇強(qiáng)陽性細(xì)胞進(jìn)行克隆，采用有限稀釋法連續(xù)亞克隆，直至100 % 陽性。得到穩(wěn)定分泌高特異性、高效價、高親和力抗體的雜交瘤細(xì)胞株，保存于液氮中。將克隆及擴(kuò)大培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞注入提前致敏的Balb/c小鼠腹腔，誘生腹水產(chǎn)生抗SAL單克隆抗體。腹水采用辛酸硫酸銨方法進(jìn)行純化，即得沙丁胺醇單克隆抗體。
3、膠體金溶液制備取IOOmL蒸餾水，煮沸5分鐘，再加入已配好的質(zhì)量濃度為的氯金酸(HA μ CL4) ImL和質(zhì)量濃度為的檸檬酸三鈉溶液1. 5mL，繼續(xù)攪拌加熱，直至出現(xiàn)透明的橙紅色為止，冷卻到室溫，碳酸鉀調(diào)節(jié)PH至8. 4，既為待標(biāo)記的膠體金溶液。
4、膠體金標(biāo)記沙丁胺醇單克隆抗體制備將沙丁胺醇單克隆抗體加入到步驟3中配置好的膠體金溶液中，抗體最終濃度為1-10μ g/mL，攪拌10分鐘，加入質(zhì)量濃度為10% 的牛血清白蛋白封閉，10000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取沉淀物用金標(biāo)稀釋液稀釋至原膠體金溶液體積的10%，制備沙丁胺醇單克隆抗體膠體金標(biāo)記物。
5、樣品墊處理將引水玻璃纖維浸入0. 01mol/L PH7. 4的PBS溶液2_3分鐘，取出，60°C烘干，即為樣品墊。
6、膠體金墊的制備和處理用載體玻璃纖維吸取步驟4制備好的膠體金標(biāo)記沙丁胺醇單克隆抗體溶液，干燥，即為膠體金墊。
7、檢測反應(yīng)部分的制備和處理沙丁胺醇包被偶合抗原用點(diǎn)樣儀噴涂包被在檢測線上，本實(shí)施例設(shè)有A、B兩條檢測線，檢測線寬1mm，A檢測線距硝酸纖維膜的左邊緣6mm， A、B兩條檢測線之間的間距2. 5mm，A檢測線包被有濃度為0. 6 μ g/mL的沙丁胺醇偶聯(lián)檢測抗原，B檢測線包被有濃度為0.4 μ g/mL的沙丁胺醇偶聯(lián)檢測抗原；質(zhì)控線包被有濃度為 0. 1 μ g的羊抗鼠IgG抗體1條，寬1mm。
8、吸水墊處理吸水墊室溫干燥。
9、試劑卡組裝取基材PVC板，依次粘樣品墊、膠體金墊、檢測反應(yīng)部分及吸水墊， 即成沙丁胺醇半定量檢測試紙條，試紙條安放在外殼內(nèi)即為試劑卡。
10、檢測將尿樣滴入檢測孔中，3-5分鐘觀察顏色變化。當(dāng)A、B兩條檢測線均呈顏色時，樣品為陰性；當(dāng)A檢測線呈色，B線不呈色時，則樣品中沙丁胺醇濃度大于0. 4μ g/ mL小于0. 6 μ g/mL ；當(dāng)A、B均不呈色時，則樣品中沙丁胺醇濃度小于0. 4 μ g/mL。A、B檢測線設(shè)定的檢測限可以是大于或等于5ng/mL的某一濃度。質(zhì)控線始終顯色，若不顯色，則表明檢測試劑卡失效。
本發(fā)明試劑卡檢測原理為1、膠體金試紙條檢測原理樣品溶液通過試紙的樣品墊吸收樣品至膠體金墊，膠體金墊上有膠體金標(biāo)記的抗沙丁胺醇單克隆抗體，如果檢測樣品中含有沙丁胺醇，并且濃度超過試紙條檢測限，樣品中的沙丁胺醇與膠體金標(biāo)記的沙丁胺醇抗體反應(yīng)形成結(jié)合物，結(jié)合物繼續(xù)上移到檢測線，因沙丁胺醇單克隆抗體只有一個結(jié)合位點(diǎn)，標(biāo)金抗體與樣品溶液中的沙丁胺醇結(jié)合后就不能與檢測線上的抗原結(jié)合，檢測線不呈色，檢測結(jié)果為陽性；如果檢5測樣品中不含沙丁胺醇，或者濃度小于試紙條檢測限，膠體金標(biāo)記的沙丁胺醇抗體到達(dá)檢測線時就會與檢測部分包被抗原結(jié)合，檢測線呈色，檢測結(jié)果為陰性。無論樣液中沙丁胺醇抗體是否與沙丁胺醇結(jié)合，樣液上移到質(zhì)控線時都會被包被在此處的羊抗鼠IgG抗體捕獲，呈色，為試劑卡質(zhì)控線。
2、試劑卡半定量檢測原理檢測線包被有濃度為大于0. 3 μ g/mL的沙丁胺醇偶聯(lián)檢測抗原2條線A、B，寬1mm，包被濃度依次降低；質(zhì)控線包被有濃度為0. 1 μ g的羊抗鼠IgG 抗體1條，寬Imm ；當(dāng)A、B兩條檢測線均呈顏色時，樣品為陰性；當(dāng)A檢測線呈色，B線不呈色時，則樣品中沙丁胺醇濃度大于B小于A ；當(dāng)A、B均不呈色時，則樣品中沙丁胺醇濃度小于B。A、B設(shè)定的檢測限可以是大于或等于5ng/mL的某一濃度。質(zhì)控線始終顯色，若不顯色，則表明檢測試劑卡失效。
權(quán)利要求
1.一種沙丁胺醇半定量檢測試劑卡，其特征在于其包括外殼和設(shè)置在外殼內(nèi)的試紙條；所述試紙條包括基層PVC板(9)、粘貼在所述基層PVC板(9)中央部位的檢測反應(yīng)部分 (7)、分別粘貼在所述檢測反應(yīng)部分(7)左、右兩端的膠體金墊(6)和吸水墊(8)，以及粘貼在所述膠體金墊(6)左端的樣品墊(5)；所述檢測反應(yīng)部分(7)為硝酸纖維膜，其表面從左到右依次設(shè)置有兩條以上包有濃度依次降低的沙丁胺醇檢測用偶合抗原的檢測線(4)以及一條包被有羊抗鼠IgG的質(zhì)控線(3)，所述膠體金墊(6)為載有膠體金標(biāo)記的沙丁胺醇單克隆抗體的玻璃纖維墊，所述吸水墊(8)為吸水棉漿板，所述樣品墊(5)為引水玻璃纖維墊； 所述外殼上設(shè)置有加樣孔(2)和觀測窗(1)，所述加樣孔(2)與試紙條的樣品墊(5)相對應(yīng)， 所述觀測窗(1)和試紙條的檢測反應(yīng)部分(7)相對應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的沙丁胺醇半定量檢測試劑卡，其特征在于所述沙丁胺醇檢測用偶合抗原為沙丁胺醇與蛋白質(zhì)類物質(zhì)采用琥珀酸酐法和碳二亞胺法形成的偶合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的沙丁胺醇半定量檢測試劑卡，其特征在于蛋白質(zhì)類物質(zhì)為牛血清白蛋白或卵清白蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的沙丁胺醇半定量檢測試劑卡，其特征在于所述檢測線(4)之間的距離為2. 5mm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的沙丁胺醇半定量檢測試劑卡，其特征在于所述檢測線(4)上包被的沙丁胺醇檢測用偶合抗原的濃度大于0. 3 μ g/mL，質(zhì)控線上包被的羊抗鼠IgG的濃度為 ο. ι μ g/mL。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種沙丁胺醇半定量檢測試劑卡，其包括外殼和設(shè)置在外殼內(nèi)的試紙條；所述試紙條包括基層PVC板、粘貼在所述基層PVC板中央部位的檢測反應(yīng)部分、分別粘貼在所述檢測反應(yīng)部分左、右兩端的膠體金墊和吸水墊，以及粘貼在所述膠體金墊左端的樣品墊；所述檢測反應(yīng)部分為硝酸纖維膜，其表面從左到右依次設(shè)置有兩條以上包有濃度依次降低的沙丁胺醇檢測用偶合抗原的檢測線以及一條包被有羊抗鼠IgG的質(zhì)控線。本發(fā)明特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確性好，可根據(jù)實(shí)際檢測需要，半定量檢測試劑卡檢測限以上的任何濃度范圍。用本試劑卡檢測結(jié)果與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)等儀器方法檢測結(jié)果相關(guān)性完全符合要求，不需專業(yè)操作人員，適合現(xiàn)場檢測，檢測速度快。
文檔編號G01N33/577GK102507944SQ20111035225
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月9日
發(fā)明者吳萌, 張小兵, 李亞璞, 李君華, 李春生, 程華, 董超, 閆靜輝, 陳英珠, 齊穎穎 申請人:河北省科學(xué)院生物研究所