專利名稱：J亞群禽白血病抗體快速檢測(cè)試紙卡及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種J亞群禽白血病抗體快速檢測(cè)試紙卡，通過(guò)檢測(cè)雞群J亞群禽白血病抗體，從而回顧性地判斷雞群是否感染過(guò)J亞群禽白血病病毒。
背景技術(shù)：
J亞群禽白血病是由J亞群禽白血病病毒(ALV-J)感染引起的一種腫瘤性傳染病。 ALV-J是具有囊膜的反轉(zhuǎn)錄病毒禽臨床感染主要表現(xiàn)為髓細(xì)胞瘤、免疫耐受、高死亡率和生長(zhǎng)遲緩。1997 1998年間，ALV-J呈全球性爆發(fā)，對(duì)世界肉種雞業(yè)造成了毀滅性打擊。ALV-J 感染除引起髓細(xì)胞瘤外，成紅細(xì)胞瘤、血管瘤、腎瘤、和肉瘤常在感染后期伴隨發(fā)生，通常死亡率為 5%，高峰期可達(dá)50%。研究證實(shí)，ALV-J對(duì)免疫應(yīng)答具有持久損害作用，使生產(chǎn)力低下，繼發(fā)感染和混合感染頻發(fā)，J亞群禽白血病給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)極大的風(fēng)險(xiǎn)。1、J亞群禽白血病在我國(guó)頻發(fā)
我國(guó)白羽肉種雞均從國(guó)外引進(jìn)，且未對(duì)新出現(xiàn)的ALV-J采取任何防范措施，加之我國(guó)的養(yǎng)殖條件相對(duì)落后，使ALV-J在我國(guó)造成的損失高于其它任何國(guó)家。2000年，J亞群禽白血病在我國(guó)白羽肉種雞中全面爆發(fā)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失；2002 — 2005年間，ALV-J病毒突破種間屏障，造成廣東、廣西三黃雞、中國(guó)麻雞雞群中爆發(fā)J亞群禽白血病，使許多養(yǎng)殖場(chǎng)倒閉；2007年和J亞群禽白血病密切相關(guān)的血管瘤病在蛋雞群及商品蛋雞群中爆發(fā)，并很快席卷全國(guó)。J亞群禽白血病在我國(guó)雞群中流行發(fā)生具有一下特點(diǎn)
1)感染率及發(fā)病率居高不下。近10年來(lái)，在肉種雞、蛋種雞中感染率均在10%左右； 2)混合感染促使病毒重組率增高。調(diào)查顯示，禽白血病與馬立克氏病、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病的混合感染日趨嚴(yán)重，為臨床診斷帶來(lái)了困難；3)早期感染普遍、發(fā)病日齡明顯提前。目前在青年雞群或開(kāi)產(chǎn)前的雞群中J亞群禽白血病已成為常見(jiàn)??；4)宿主范圍擴(kuò)展。爆發(fā)血管瘤的蛋雞、我國(guó)特有雞種麻雞、柴雞及蘆花雞中也檢出ALV-J，這表明了 J亞群禽白血病正在向蛋雞、地方雞種傳播，其宿主范圍正在明顯擴(kuò)大；5)腫瘤趨于多樣化。目前，我國(guó)感染禽群中出現(xiàn)了諸多以前罕見(jiàn)的腫瘤，如血管瘤、成紅細(xì)胞瘤、肝細(xì)胞癌、腺癌、纖維瘤、皮膚癌和輸卵管癌等；6)致病性增強(qiáng)。許多在蛋雞及地方雞中發(fā)現(xiàn)的腫瘤要比之前肉種雞的病變更加嚴(yán)重，在肉雞體內(nèi)的某些器官內(nèi)從未發(fā)現(xiàn)髓細(xì)胞瘤，而在蛋雞中比較常見(jiàn)，如頸部髓細(xì)胞瘤、腰薦髓細(xì)胞瘤腸髓細(xì)胞瘤等。2、J亞群禽白血病的防控現(xiàn)狀
一直以來(lái)，由于ALV-J病毒自身的特殊性以及引起疾病的復(fù)雜性，對(duì)ALV-J的防治研究未見(jiàn)顯著成就，至今無(wú)法控制ALV-J的有效方法和防治ALV-J感染的藥物和疫苗。對(duì)ALV-J 的防控，發(fā)達(dá)國(guó)家主要采取凈化淘汰，1997 1998年，全球爆發(fā)ALV-J后，世界4大養(yǎng)禽公司先后投入巨額資金研究防制ALV-J策略，最終制定出一套嚴(yán)格的凈化措施，逐步控制了 ALV-J的持續(xù)爆發(fā)；2002年后，ALV-J祖代種雞群中已基本凈化干凈，但在商品肉雞中還有零星的爆發(fā)，其每周發(fā)病率在1.5%左右。控制ALV-J是一個(gè)長(zhǎng)期不懈的工作。在目前狀況下，我國(guó)對(duì)ALV-J基本上沒(méi)有行之有效的防控措施，政府沒(méi)有補(bǔ)貼，也沒(méi)有哪個(gè)公司能承擔(dān)起高昂的凈化費(fèi)用。3、J亞群禽白血病的檢測(cè)技術(shù)
目前，檢測(cè)ALV-J常用方法為PCR和免疫檢測(cè)。PCR方法對(duì)檢測(cè)人員技術(shù)水平、設(shè)備有較高的要求，成本高，操作復(fù)雜，易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性，不適合臨床快速檢測(cè)。ALV-J免疫檢測(cè)以抗原一抗體特異性結(jié)合為基礎(chǔ)，主要以酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)和膠體金兩種檢測(cè)技術(shù)為研究熱點(diǎn)，膠體金試紙卡具有方便、快捷、靈敏、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠等特點(diǎn)。免疫層析膠體金技術(shù)是新型的診斷技術(shù)，已得到較為廣泛的應(yīng)用，基本原理為利用膠體金標(biāo)記一種抗原或抗體，在試紙卡的硝酸纖維素膜上包被相應(yīng)的配對(duì)抗體或抗原， 檢測(cè)時(shí)，當(dāng)樣品中含有相應(yīng)的特異性抗體或抗原時(shí)，膠體金標(biāo)記顆粒和樣品中配體相結(jié)合形成復(fù)合物，然后在硝酸纖維素膜上層析，再被包被的抗體或抗原捕獲，膠體金顆粒富集， 形成肉眼可見(jiàn)的檢測(cè)線(T線)，通過(guò)檢測(cè)線的有無(wú)來(lái)判斷結(jié)果，同時(shí)在離檢測(cè)線不遠(yuǎn)的后方設(shè)立另一可與金標(biāo)物特異性結(jié)合的抗體或抗原作為質(zhì)控線(C線)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)而提供了一種J亞群禽白血病抗體快速檢測(cè)試紙卡，其以雞血清為檢測(cè)樣品，可簡(jiǎn)便、快速地檢測(cè)雞群是否感染過(guò)ALV-J， 為雞群特別是種雞的ALV-J凈化提供快捷工具，降低了凈化成本，節(jié)約人力物力。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是J亞群禽白血病抗體快速檢測(cè)試紙卡，包括有襯板，其上設(shè)置有樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其特征在于金標(biāo)墊上包被有膠體金標(biāo)記的鼠抗雞IgG Fc片段單克隆抗體；硝酸纖維素膜上有包被J亞群禽白血病亞群特異性gp85抗原蛋白構(gòu)成的檢測(cè)線和兔抗鼠IgG構(gòu)成的質(zhì)控線。按上述方案，所述的金標(biāo)墊上附著有20 μ 1濃度為1. 5mg/ml的鼠抗雞IgG Fc片段單克隆抗體，其可與雞血清中特異性抗ALV-J的抗體結(jié)合。可以滿足試紙卡檢測(cè)的靈敏度要求，同時(shí)也可滿足與兔抗鼠多抗結(jié)合的要求。按上述方案，所述的金標(biāo)墊的制備方法如下取膠體直徑為20 士 5nm的膠體金溶液，用碳酸鈉調(diào)整至PH8.0，加入鼠抗雞IgG Fc片段單克隆抗體，室溫?cái)嚢?，BSA封閉，離心，棄沉淀；上清液離心，棄上清，將沉淀以與原體積相同的PBS溶解，如上重復(fù)離心2次， 所得沉淀物用40%原體積的PBS重懸，即得到金標(biāo)抗體，將金標(biāo)抗體均勻分散在玻璃纖維上，使其干燥備用。按上述方案，所述的檢測(cè)線上的J亞群禽白血病亞群特異性gp85抗原蛋白濃度為 0.2、.3 48/!111，體積為1(^1，所述的質(zhì)控線的兔抗鼠IgG濃度為1.2 2. 2 yg/ml，體積為5 μ 1，滿足試紙卡檢測(cè)的靈敏度要求。按上述方案，所述的檢測(cè)線包被方法如下取所述濃度0. 2^0. 3 μ g/ml的J亞群禽白血病亞群特異性gp85抗原蛋白10μ1，在預(yù)定的檢測(cè)線位置劃線，干燥后即為檢測(cè)線。按上述方案，所述的質(zhì)控線包被方法如下取所述濃度為1. 2 2. 2 μ g/ml的兔抗鼠IgG 5μ 1，在預(yù)定的質(zhì)控線位置劃線，干燥后即為質(zhì)控線。本發(fā)明還提供了上述雞J亞群禽白血病抗體快速檢測(cè)試紙卡的檢測(cè)方法，其特征在于包括有以下步驟將試紙卡平放，取雞血清100μ 1滴在樣品墊上，根據(jù)檢測(cè)線和質(zhì)控線的顯色狀態(tài)，判斷檢測(cè)結(jié)果，如果質(zhì)控線、檢測(cè)線均出現(xiàn)，判定為陽(yáng)性；質(zhì)控線出現(xiàn)，檢測(cè)線不出現(xiàn)，判定為陰性；質(zhì)控線、檢測(cè)線均不出現(xiàn)或質(zhì)控線不出現(xiàn)而檢測(cè)線出現(xiàn)，均判定檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。本發(fā)明所述的禽白血病分A、B、C、D、E、F、G、H、I和J等10個(gè)亞群，其中A、B、C、
D、Ε、J亞群均可感染雞，J亞群禽白血病是由J亞群禽白血病病毒(ALV-J)感染引起的一種腫瘤性傳染病，其囊膜蛋白gp85具有亞群特異性，感染過(guò)的雞可產(chǎn)生亞群特異性抗體。 gp85蛋白上有多個(gè)抗原決定簇，可被雞血清中的相應(yīng)抗體IgG的Fab片段捕獲。本發(fā)明設(shè)計(jì)了針對(duì)雞IgG Fc片段的單克隆抗體及兔抗鼠IgG的多克隆抗體，用膠體金標(biāo)記抗雞IgG Fc片段的單克隆抗體，捕獲雞血清中的IgG，若樣品陽(yáng)性，則會(huì)形成肉眼可見(jiàn)的檢測(cè)線(T線)，越過(guò)檢測(cè)線的金標(biāo)鼠抗雞IgG Fc片段的的單克隆抗體與兔抗鼠IgG 的多抗結(jié)合形成肉眼可見(jiàn)的質(zhì)控線(C線)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明中J亞群禽白血病抗體快速檢測(cè)試紙卡檢測(cè)方法，可快速檢測(cè)雞血清中的J亞群禽白血病抗體，從而判斷是否感染過(guò)J亞群禽白血病。具有反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、適合“欄圈邊”檢測(cè)、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠等優(yōu)點(diǎn)。


圖1為本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意其中，1 一吸水墊；2 —襯板；3 —硝酸纖維素膜；4 一金標(biāo)墊；5 —樣品墊；6 —質(zhì)控線； 7一檢測(cè)線；
圖2為檢測(cè)結(jié)果判定，其中，A:C、T均出現(xiàn)紅色線判為陽(yáng)性；B 僅C出現(xiàn)紅色線而T沒(méi)出現(xiàn)紅色線判為陰性；C、D 只要C不出現(xiàn)紅色線結(jié)果均判為無(wú)效檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。實(shí)施例1鼠抗雞IgG Fc片段單克隆抗體的制備
收集規(guī)模化蛋雞場(chǎng)開(kāi)產(chǎn)前蛋雞的高免血清采用辛酸一硫酸銨法進(jìn)行純化，按每1份血清加4份乙酸鈉緩沖液濃度0. 06mol/L, pH值4. 0)；用濃度lmol/L NaOH調(diào)pH值到4. 5， 加入辛酸33μ1/πι1。邊加邊攪拌30min。再2 8°C，12000轉(zhuǎn)/min離心lOmin，棄沉淀。 上清濾紙過(guò)濾后用NaOH調(diào)pH值至7. 4，然后緩慢加入飽和硫酸銨至終濃度45%，繼續(xù)攪拌 30min，2 8°C靜置 2h。再 2 8°C，12000 轉(zhuǎn)/min 離心 30min，棄上清。用 0. OlM tTris (pH9. 0)透析除鹽，直至用BaCl2檢測(cè)無(wú)白色沉淀為止，用PEG8000進(jìn)行濃縮。利用GE公司AKAT purifier蛋白純化系統(tǒng)以Hiload 16/60 Superdex 200prep pg凝膠過(guò)濾預(yù)裝柱， 純化粗提的雞血清IgG。用0. 22um濾器過(guò)濾粗提的雞血清IgG，并經(jīng)過(guò)超聲除氣；Hiload 16/60 Superdex 200prep pg凝膠過(guò)濾預(yù)裝柱與AKAT purifier蛋白純化系統(tǒng)相連接，先用 ddH20清洗柱子，接著用含0. 15M NaCl的0. 05M磷酸鹽緩沖液(PBS，pH8. 0)平衡柱子，流速為2ml/min，直至UM80的吸光值和電導(dǎo)值基線穩(wěn)定，平衡柱子時(shí)要清洗各閥位。將過(guò)濾的雞血清IgG樣品用注射器(上樣前注意排空注射器里的氣泡，以免損害柱子)注入樣品環(huán)中， 設(shè)置洗脫速度和報(bào)警壓，進(jìn)行上樣和洗脫，流速為lmL/min。觀察UV280值基線的變化，收集紫外吸收峰的洗脫峰，每管收集anl，SAS-PAGE電泳檢測(cè)脫蛋白，合并收集液，裝入透析袋，放入PEG8000中濃縮，用NanodroplOOO分光光度儀0D280和0D260吸光值，并根據(jù)公式計(jì)算IgG含量蛋白含量(mg/mL) =(1. 45X0D280 0. 74X0D260) X稀釋倍數(shù)，測(cè)得雞IgG 的蛋白含量為18. 6mg/mL，用于鼠抗雞IgG單克隆抗體的制備。收集純化后的抗體，純化的雞IgG與弗氏佐劑等量混合，充分乳化，以50g IOOg/ 只免疫BALB/c系小鼠3次，每次間隔15 30天，第3次加強(qiáng)免疫后3 4天，將免疫小鼠眼球放血，拉頸致死，于75%酒精浸泡5 lOmin，無(wú)菌取其脾細(xì)胞；剪碎并經(jīng)100目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，1000r/min離心lOmin，收集脾細(xì)胞；將1 X IO8的脾細(xì)胞與2 5 X IO7的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞混合，1000r/min離心lOmin，棄上清，在37°C的水浴中將0. 7 Iml的40% 50%PEG4000 (pH8. 5 9. 0)緩緩加入細(xì)胞，溫育Imin后，緩慢加入無(wú)血清1640培養(yǎng)基15ml，以終止PEG 的作用，37°C水浴5 lOmin，1000r/min離心lOmin，棄上清，將細(xì)胞重懸于HAT選擇培養(yǎng)基中，并加入96孔培養(yǎng)板(IOOuL/孔)，置37°C 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)7 10天后，用 5g 10g/ml的雞IgG包被96孔酶標(biāo)板，以ELISA檢測(cè)雜交瘤的培養(yǎng)上清，挑取強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞克隆(0D492=0. 8以上)，經(jīng)連續(xù)3次的有限稀釋法克隆化，建立雜交瘤細(xì)胞株，將雜交瘤細(xì)胞腹腔注射經(jīng)降植烷致敏一周的Balb/c系小鼠，每只小鼠注射5 X IO5個(gè)細(xì)胞，誘生小鼠腹水，制備抗IgG Fc片段單克隆抗體。獲得的5株雜交瘤細(xì)胞株染色體為92 98，其分泌的單克隆抗體特異識(shí)別雞IgG Fc片段，與鴨、鵝、鴿、豬、牛等的IgG不反應(yīng)，親和力常數(shù)達(dá) 10_8，輕鏈亞型為κ或λ，重鏈亞型為IgGl，IgG^i。實(shí)施例2 J亞群禽白血病亞群特異性gp85抗原蛋白的制備
用基因工程技術(shù)高效表達(dá)J亞群禽白血病亞群特異性gp85抗原蛋白。參考GENBANK 上已經(jīng)發(fā)表的J亞群原型毒株HPRS-103的gp85基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增gp85基因的引物，上游引物 Pl :5，-TCCGAATTCGGAGTTCATCTATTGCAACAA-3 ‘，下游引物 P2 :5 ‘-GTACTCGAGTTAGCGCCTGCTACGGTGG TG-3'。P1 和 P2 的 5'端分別引入EcoR I 和 Xho I 酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增長(zhǎng)度為921bP，反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min后，按94°C 30s, 57°C 45s, 72°C Imin進(jìn)行33個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin，PCR產(chǎn)物連接到pMD_18T載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)中，涂布于含IOOg / mL氨卞青霉素(Amp)的LB平板，37°C培養(yǎng)16小時(shí)， 挑單菌落，堿裂解法抽提重組質(zhì)粒，以PCR和雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆，并序列測(cè)定驗(yàn)證。陽(yáng)性克隆的酶切產(chǎn)物與pET-28a表達(dá)質(zhì)粒鏈接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pETj8a-gp85，并轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21，挑單菌落接入5mL含100g/mL卡那霉素(Kan)的LB培養(yǎng)基中，37°C、250r/min震蕩培養(yǎng)10h，然后按1 100轉(zhuǎn)接500mL LB (100g/mL Kan)的培養(yǎng)基，37°C、250r/min震蕩培養(yǎng)汕，加入終止?jié)舛葹閘mmol/ L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h。4°C、4000r / min離心lOmin,收集誘導(dǎo)表達(dá)菌體。利用QIAGEN公司的his-鎳親和層析柱，在變性條件下采用PH梯度洗脫純化J亞群禽白血病重組His-gp85蛋白，主要步驟如下將收集的菌體沉淀按8mL / g的比重重懸于緩沖液 B (IOOmM NaH2PO4, IOmM Tris. Cl, 8M urea, PH8. 0)中，在室溫下輕微振蕩 45 60min (避免產(chǎn)生氣泡)，400w超聲波擊打30次，1200rpm，4°C離心30min，取上清加入到含 2mLNi-NTA填料的經(jīng)緩沖液B平衡的純化柱中，封閉純化柱，200r/min, 37°C振蕩30min，使重組蛋白和Ni2 + -NTA固相充分結(jié)合后，讓純化柱垂直放置，待Ni-NTA填料沉積后，將純化柱用 IOmL 緩沖液 C (IOOmM NaH2PO4, IOmM Tris. Cl, 8M urea, 20mM imidazol PH6.3)洗脫 2 次后，再用 IOmL bufferD (IOOmM NaH2PO4, IOmM Tris. Cl, 8M urea, PH5. 9)洗脫 2 次，最后用 IOmL bufferE (IOOmM NaH2PO4, IOmM Tris. Cl, 8M uregi, PH4. 5)洗脫目的蛋白，收集洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，采用BCA法測(cè)定純化His-gp85蛋白含量，計(jì)算表達(dá)量。結(jié)果顯示， 含pETj8a-gp85重組質(zhì)粒的表達(dá)菌成功表達(dá)分子量為38KD的J亞群禽白血病亞群特異性 gp85抗原蛋白，其表達(dá)量為4aiig/L，可用于檢測(cè)線的制備。實(shí)施例3兔抗鼠IgG多克隆抗體的制備
采取高免小鼠血液，分離血清，以辛酸-硫酸銨法粗提小鼠血清IgG，并用Superdex200 凝膠層析進(jìn)行純化(同實(shí)施例1)，測(cè)得小鼠IgG的蛋白含量為13. lmg/mL，可用于兔抗小鼠 IgG多克隆抗體的制備。以50 100ug/kg體重的小鼠IgG蛋白加弗氏佐劑充分乳化，經(jīng)皮下和肌肉注射免疫健康新西蘭大白兔3 4次，末次免疫10天后，靜脈采血，以ELISA測(cè)定其血清抗體效價(jià)在1 2000以上時(shí)，心臟采血或頸動(dòng)脈放血，收集高免血清；以辛酸-硫酸銨法粗提免疫兔血清IgG，并用Superdex 200凝膠層析進(jìn)行純化，不重述。所制備的抗小鼠IgG多克隆抗體用于檢測(cè)試紙卡的研制。實(shí)施例4金標(biāo)墊的制備
取膠體直徑為18nm的膠體金溶液100ml，用碳酸鈉調(diào)整至pH8. 0，加入1. 8mg實(shí)施例1 中鼠抗雞IgG Fc片段單克隆抗體，室溫?cái)嚢?0min，10%BSA封閉。將上述標(biāo)記物3000r/min 離心20 min，棄沉淀，上清液12000 r/min離心30 min，棄上清，將沉淀以與原體積相同的 PBS(0. 01mol/L pH8. 2，含0. 1% BSA、0. 05%疊氮鈉)溶解，如上重復(fù)離心2次。最后沉淀物用40%原體積的PBS重懸，以Iml溶液鋪35cm2的比例，均勻鋪在玻璃纖維上，使其干燥備用。實(shí)施例5硝酸纖維素膜的包被
將實(shí)施例2中的J亞群禽白血病亞群特異性gp85抗原蛋白用PBS(0. 01M，pH7. 4)配制成0. 2^0. 3 μ g/m的濃度，取10 μ 1用噴膜機(jī)在預(yù)定的檢測(cè)線位置劃線；
取所述實(shí)施例3的兔抗鼠多克隆抗體，用PBS (0. 01Μ, ρΗ7. 4)配制成濃度為1. 2 2. 2 μ g/ml的溶液，取5μ 1溶液，用噴膜機(jī)在預(yù)定的質(zhì)控線位置劃線。實(shí)施例6檢測(cè)試紙卡的組裝
在干燥室內(nèi)，室溫20 - 25°C，濕度小于30%，將樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸水墊等按圖1所示固定到襯板上。其中硝酸纖維素膜位于襯板中部，其包被有T線的一端與金標(biāo)墊的1/5搭接，包被有C線的一端與吸水墊的1/5搭接，樣品墊與金標(biāo)墊的1/2搭接。最后切成寬度為3. 5cm的小條，然后裝入測(cè)試卡。每10個(gè)一包，加入小袋干燥劑，抽真空封裝。 4 8°C保存，有效期一年。實(shí)施例7快速檢測(cè)試紙卡的穩(wěn)定性檢測(cè)設(shè)計(jì)溫度37°C、4°C
設(shè)計(jì)時(shí)間:0天、7天、21天、28天、2月、4月、6月、8月、12月、18月
保存方法拭紙卡真空封裝(在37°C、4°C同時(shí)各保存一盒) 檢測(cè)指標(biāo)敏感性
表1本發(fā)明試劑盒試紙卡穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.J亞群禽白血病抗體快速檢測(cè)試紙卡，包括有襯板(2)，其上設(shè)置有樣品墊(5)、金標(biāo)墊(4)、硝酸纖維素膜(3)和吸水墊(1)，其特征在于金標(biāo)墊上包被有膠體金標(biāo)記的鼠抗雞 IgG Fc片段單克隆抗體；硝酸纖維素膜上有包被J亞群禽白血病亞群特異性gp85抗原蛋白構(gòu)成的檢測(cè)線(7)和兔抗鼠IgG構(gòu)成的質(zhì)控線(6)。
2.按權(quán)利要求1所述的亞群禽白血病抗體快速檢測(cè)試紙卡，其特征在于所述的金標(biāo)墊上附著有20 μ 1濃度為1. 5mg/ml的鼠抗雞IgG Fc片段單克隆抗體，其可與雞血清中特異性抗ALV-J的抗體結(jié)合。
3.按權(quán)利要求2所述的亞群禽白血病抗體快速檢測(cè)試紙卡，其特征在于所述的金標(biāo)墊的制備方法如下取膠體直徑為20 士 5nm的膠體金溶液，用碳酸鈉調(diào)整至pH8.0，加入鼠抗雞IgG Fc片段單克隆抗體，室溫?cái)嚢?，BSA封閉，離心，棄沉淀；上清液離心，棄上清，將沉淀以與原體積相同的PBS溶解，如上重復(fù)離心2次，所得沉淀物用40%原體積的PBS重懸， 即得到金標(biāo)抗體，將金標(biāo)抗體均勻分散在玻璃纖維上，使其干燥備用。
4.按權(quán)利要求1或2或3所述的亞群禽白血病抗體快速檢測(cè)試紙卡，其特征在于所述的檢測(cè)線上的J亞群禽白血病亞群特異性gp85抗原蛋白濃度為0. 2、. 3μ g/ml，體積為 10μ 1,所述的質(zhì)控線的兔抗鼠IgG濃度為1.2 2. 2 yg/ml，體積為5μ 1，滿足試紙卡檢測(cè)的靈敏度要求。
5.按權(quán)利要求4所述的亞群禽白血病抗體快速檢測(cè)試紙卡，其特征在于所述的檢測(cè)線包被方法如下取所述濃度0. 2^0. 3 μ g/ml的J亞群禽白血病亞群特異性gp85抗原蛋白 10μ 1，在預(yù)定的檢測(cè)線位置劃線，干燥后即為檢測(cè)線。
6.按權(quán)利要求4所述的亞群禽白血病抗體快速檢測(cè)試紙卡，其特征在于所述的質(zhì)控線包被方法如下取所述濃度為1. 2^2. 2 μ g/ml的兔抗鼠IgG 5 μ 1，在預(yù)定的質(zhì)控線位置劃線，干燥后即為質(zhì)控線。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的雞J亞群禽白血病抗體快速檢測(cè)試紙卡的檢測(cè)方法，其特征在于包括有以下步驟將試紙卡平放，取雞血清100μ 1滴在樣品墊上，根據(jù)檢測(cè)線和質(zhì)控線的顯色狀態(tài)，判斷檢測(cè)結(jié)果，如果質(zhì)控線、檢測(cè)線均出現(xiàn)，判定為陽(yáng)性；質(zhì)控線出現(xiàn)， 檢測(cè)線不出現(xiàn)，判定為陰性；質(zhì)控線、檢測(cè)線均不出現(xiàn)或質(zhì)控線不出現(xiàn)而檢測(cè)線出現(xiàn)，均判定檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種J亞群禽白血病抗體快速檢測(cè)試紙卡，包括有襯板，其上設(shè)置有樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，金標(biāo)墊上包被有膠體金標(biāo)記的鼠抗雞IgGFc片段單克隆抗體；硝酸纖維素膜上有包被J亞群禽白血病亞群特異性gp85抗原蛋白構(gòu)成的檢測(cè)線和兔抗鼠IgG構(gòu)成的質(zhì)控線。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明中J亞群禽白血病抗體快速檢測(cè)試紙卡檢測(cè)方法，可快速檢測(cè)雞血清中的J亞群禽白血病抗體，從而判斷是否感染過(guò)J亞群禽白血病。具有反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、適合“欄圈邊”檢測(cè)、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102507946SQ20111035307
公開(kāi)日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月9日
發(fā)明者劉麗娜, 張蓉蓉, 楊峻, 溫國(guó)元, 王紅琳, 羅玲, 羅青平, 艾地云, 邵華斌 申請(qǐng)人:湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所