專利名稱：一種MWNTs-IL/Cyt c/GCE的H₂O₂生物傳感器的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種MWNTs-IL/Cyt c/GCE的H2A生物傳感器的制備方法。
背景技術(shù)：
近年來，將生物分子(如蛋白質(zhì)和酶)吸附和固定在無機材料上研究和應(yīng)用引人注意。特別是與工業(yè)無機催化劑相比，酶的專一性和反應(yīng)的有效性使得酶成為較好的生物催化劑。自從碳納米管被發(fā)現(xiàn)后，由于其具有較好的生物相容性，使得它和生物體系相結(jié)合形成功能化的氫鍵，在生物納米電化學(xué)中得到很好的應(yīng)用。另外，功能化的碳納米管修飾電極對許多重要涉及人類健康的生物分子有穩(wěn)定的電催化響應(yīng)。更有趣的是，越來越多的人將注意力集中在聚合物-酶的傳感器中，其對酶的固定比較差，生物分子的檢測線相對較高。因此，研制具有制備簡單、響應(yīng)快、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性好的檢測H2O2傳感器的方法非常重要。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述，本發(fā)明的目的在于提供一種MWNTs-IL/Cyt c/GCE來檢測H2A的氧化。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種MWNTs-IL/Cyt c/GCE的H2A生物傳感器的制備方法，其步驟是a.稱取5mg羧基化的多壁碳納米管和IOmg氨基化的離子液體，IOmg 二環(huán)己基碳二亞胺，IOmL 二甲基甲酸胺加入到圓底燒瓶中超聲15分鐘，然后在50°C下真空干燥M小時。將得到的產(chǎn)物用砂芯漏斗進行抽濾，再分別用二甲基甲酸胺，乙醇和蒸餾水沖洗，洗掉多余的離子液體和溶劑，得到的酰胺化的多壁碳納米管(MWNT-IL)在80攝氏度下真空干燥 12小時，然后把酰胺化的多壁碳納米管分散在0. 05mg/mL 二次蒸無水乙醇中備用。b.將玻碳電極依次用0. 3 μ m、0. 05 μ m的三氧化二鋁懸濁液拋光成鏡面，再依次經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇、二次蒸餾水超聲清洗后，得到處理后的玻碳電極；插入盛有5mL 含有5mM鐵氰化鉀探針分子的摩爾濃度為0. IM氯化鉀電解質(zhì)溶液中，并采用以玻碳電極為工作電極、以鉬為對電極、以飽和的甘汞電極為參比電極的三電極體系進行循環(huán)伏安掃描， 對裸玻碳電極(GCE)進行表征。c.將所述玻碳電極取出用二次蒸餾水沖洗、用洗耳球吹干后滴上5 μ L的MWNT-IL 置于紅外燈下烤干，制得MWNT-IL修飾的玻碳電極(MWNT-IL/GCE)。另外，在4°C條件下將此電極侵入到lmg/ml，pH6. 98PBS細(xì)胞色素C溶液中2小時，這樣細(xì)胞色素c就會固定到 MWNT-IL/GCE 表面，得到 MWNTs-IL/Cyt c/GCE。d.采用所述的MWNTs-IL/Cyt c/GCE為工作電極、以鉬為對電極、以飽和的甘汞電極為參比電極的三電極共同插入盛有5mL含有不同濃度H2A的0. IM磷酸鹽緩沖溶液中 (PBS，pH = 6. 98)進行安培i-t掃描，得到不同濃度H2A的安培i_t圖；然后將MWNTs-IL/ Cyt c/GCE工作電極分別換做GCE和MWNT-IL/GCE重復(fù)上述操作，得到不同的安培i_t圖。
e.采用origin軟件作圖，分別繪制GCE和MWNT-IL/GCE在不同濃度H2A中電流跟濃度的線性關(guān)系，MWNTs-IL/Cyt c/GCE在不同濃度H2A中的安培i_t曲線和電流跟濃度的線性關(guān)系。本發(fā)明優(yōu)點和產(chǎn)生的有益效果是1.與傳統(tǒng)的固定在聚合物修飾電極上相比，本發(fā)明研制的細(xì)胞色素c功能化的多壁碳納米管修飾玻碳電極檢測H2A的生物傳感器。因為細(xì)胞色素C固定在酰胺化的碳納米管修飾電極上，既增加了它的吸附和催化活性，也不會破壞細(xì)胞色素c本身的結(jié)構(gòu)與活性， 并且對H2A氧化的檢測比較靈敏。2.此生物傳感器應(yīng)用于對過氧化氫的氧化。用安培響應(yīng)得到H2A的檢測線，其檢測線比較低，檢測過程簡單，靈敏度高、快速簡便。


圖1為本發(fā)明酰胺化的碳納米管a，氨基化的離子液體b，多壁碳納米管的紫外。圖2為本發(fā)明酰胺化的碳納米管的紅外吸收光譜。圖3為本發(fā)明GCE、MWNT_IL/GCE檢測不同濃度的過氧化氫的濃度和電流的線性關(guān)系，其中電位為0. 8V。圖4為MWNTs-IL/Cyt c/GCE檢測不同濃度的過氧化氫的電流時間曲線圖，及過氧化氫濃度和電流的線性關(guān)系圖，其中電位為0.8V。
具體實施例方式實驗過程中使用的水均為二次蒸餾水，實驗所用的試劑均為分析純，多壁碳納米管的羧基化使用體積比為3 1的濃鹽酸和雙氧水超聲8個小時，然后洗至中性，70°C下烘
干再使用。本實施例所使用的儀器與試劑CHI 660c電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)用于交循環(huán)伏安的實驗，石英管加熱式自動雙重純水蒸餾器(1810B，上海亞太技術(shù)玻璃公司)用于蒸二次蒸餾水。電子天平 (北京賽多利斯儀器有限公司)，用于稱量藥品。超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。三氧化二鋁打磨粉(0. 30μπι，0.05μπι，上海辰華儀器試劑公司)用于處理玻碳電極。 飽和甘汞參比電極，鉬對電極，磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鉀(西安化學(xué)試劑廠)；多壁碳納米管(深圳納米港有限公司)，細(xì)胞色素C(上海源葉生物科技有限公司)；高純氮氣 (純度為 99. 999% (O2 ^ 0. 001% )) 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細(xì)的說明。一種MWNTs-IL/Cyt c/GCE的H2A的H2A生物傳感器的制備方法，包括以下步驟a.稱取5mg羧基化的多壁碳納米管和IOmg氨基化的離子液體，IOmg 二環(huán)己基碳二亞胺，IOmL 二甲基甲酸胺加入到圓底燒瓶中超聲15分鐘，然后在50°C下真空干燥M小時。將得到的產(chǎn)物用砂芯漏斗進行抽濾，再分別用二甲基甲酸胺，乙醇和蒸餾水沖洗，洗掉多余的離子液體和溶劑，得到的酰胺化的多壁碳納米管(MWNT-IL)在80攝氏度下真空干燥12小時。將酰胺化的碳納米管、氨基化的離子液體、多壁碳納米管進行紫外表征，從圖 1中可以看出，在濃度為0.01M、pH為6. 98緩沖溶液(PBS)中，氨基化的離子液體(IL)在230nm(曲線b)有一個最大吸收峰，而酰胺化的碳納米管(MWNTs-IL)在206nm(曲線a)有明顯的藍(lán)移，MWNTs (曲線c)在201處出現(xiàn)最大吸收峰，就表明形成了酰胺化的碳納米管。再將酰胺化的碳納米管進一步用紅外吸收光譜進行測定，一般而言羰基在1709和1561cm-l 處有吸收峰。如圖2，羰基在1709cm-l處的吸收峰移到1646cm-l，表明有氨基的形成，另夕卜，在1456cm-l處有較強的吸收峰，進一步說明羧基化的碳納米管與氨基化的離子液體之間形成了酰胺鍵。最后把酰胺化的多壁碳納米管分散在二次蒸無水乙醇中備用(0.05mg/ mL) οb.將玻碳電極依次用0. 3 μ m、0. 05 μ m的三氧化二鋁懸濁液拋光成鏡面，再依次經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇、二次蒸餾水超聲清洗后，得到處理后的玻碳電極；插入盛有5mL 含有5mM鐵氰化鉀探針分子的摩爾濃度為0. IM氯化鉀電解質(zhì)溶液中，并采用以玻碳電極為工作電極、以鉬為對電極、以飽和的甘汞電極為參比電極的三電極體系進行循環(huán)伏安掃描， 對裸玻碳電極(GCE)進行表征。c.將所述玻碳電極取出用二次蒸餾水沖洗、用洗耳球吹干后滴上5 μ L的MWNT-IL 置于紅外燈下烤干，制得MWNT-IL修飾的玻碳電極(MWNT-IL/GCE)。另外，在4°C條件下將此電極侵入到lmg/ml，pH6. 98PBS細(xì)胞色素C溶液中2小時，這樣細(xì)胞色素c就會固定到 MWNT-IL/GCE 表面，得到 MWNTs-IL/Cyt c/GCE。d.采用所述的MWNTs-IL/Cyt c/GCE為工作電極、以鉬為對電極、以飽和的甘汞電極為參比電極的三電極共同插入盛有5mL含有不同濃度H2A的0. IM磷酸鹽緩沖溶液中 (PBS，pH = 6. 98)進行安培i-t掃描，得到不同濃度H2A的安培i_t圖；然后將MWNTs-IL/ Cyt c/GCE工作電極分別換做GCE和MWNT-IL/GCE重復(fù)以上操作，得到不同的安培i_t。e.采用origin軟件作圖，分別繪制GCE和MWNT-IL/GCE在不同濃度H2A中電流跟濃度的線性關(guān)系，MWNTs-IL/Cyt c/GCE在不同濃度H2A中的安培i_t曲線和電流跟濃度的線性關(guān)系。圖3A為GCE在不同濃度H2A中，H2A濃度與電流的線性關(guān)系，其檢測線范圍為 4-100 μ M ；圖;3B為MWNT-IL/GCE在不同濃度H2A中，H2A濃度與電流的線性關(guān)系，其檢測線范圍為4-700μΜ。MWNTs-IL/Cyt c/GCE在不同濃度H2O2中的安培i_t曲線在圖4中表示， 其中插圖為H2A濃度與電流的線性關(guān)系，H2A的檢測線范圍為0. 04-100 μ Μ。MWNTs-IL/Cyt c/GCE與GCE和MWNT-IL/GCE相比，檢測范圍擴大，檢測線低，檢測過程簡單，靈敏度高、快速簡便。(3)、修飾電極的處理檢測完畢后，將碳納米管修飾電極、酰胺化碳納米管修飾電極電化學(xué)檢測池中取出，在二次蒸餾水中超聲1分鐘，電極表面碳納米管和酰胺化的碳納米管可以完全脫落。
權(quán)利要求
1. 一種MWNTs-IL/Cyt c/GCE的H2A生物傳感器的制備方法，其步驟是a.稱取5mg羧基化的多壁碳納米管和IOmg氨基化的離子液體、IOmg二環(huán)己基碳二亞胺和IOmL 二甲基甲酸胺加入到圓底燒瓶中超聲15分鐘，然后在50°C下真空干燥M小時； 將得到的產(chǎn)物用砂芯漏斗進行抽濾，再分別用二甲基甲酸胺，乙醇和蒸餾水沖洗，洗掉多余的離子液體和溶劑，得到的酰胺化的多壁碳納米管，在80攝氏度下真空干燥12小時，然后把酰胺化的多壁碳納米管分散在0. 05mg/mL的二次蒸無水乙醇中備用；b.將玻碳電極依次用0.3 μ m、0. 05 μ m的三氧化二鋁懸濁液拋光成鏡面，再依次經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇、二次蒸餾水超聲清洗后，得到處理后的玻碳電極；插入盛有5mL含有 5mM鐵氰化鉀探針分子的摩爾濃度為0. IM氯化鉀電解質(zhì)溶液中，并采用以玻碳電極為工作電極、以鉬為對電極、以飽和的甘汞電極為參比電極的三電極體系進行循環(huán)伏安掃描，對裸玻碳電極進行表征；c.將所述玻碳電極取出用二次蒸餾水沖洗、用洗耳球吹干后滴上5μ L的MWNT-IL置于紅外燈下烤干，制得MWNT-IL修飾的玻碳電極；另外，在4°C條件下將MWNT-IL修飾的玻碳電極侵入到lmg/ml，pH6. 98PBS的細(xì)胞色素C溶液中2小時，這樣細(xì)胞色素c就會固定到 MWNT-IL/GCE 表面，得到 MWNTs-IL/Cyt c/GCE ；d.采用所述的MWNTs-IL/Cytc/GCE為工作電極、以鉬為對電極、以飽和的甘汞電極為參比電極的三電極共同插入盛有5mL含有不同濃度H2A的0. IM磷酸鹽緩沖溶液中(PBS， PH = 6. 98)進行安培i-t掃描，得到不同濃度H2A的安培i-t圖；然后將MWNTs-IL/Cyt c/ GCE工作電極分別換做GCE和MWNT-IL/GCE重復(fù)上述操作，得到不同的安培i_t圖；e.采用origin軟件作圖，分別繪制GCE和MWNT-IL/GCE在不同濃度H2A中電流跟濃度的線性關(guān)系，MWNTs-IL/Cyt c/GCE在不同濃度H2A中的安培i_t曲線和電流跟濃度的線性關(guān)系。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種MWNTs-IL/Cyt c/GCE的H2O2生物傳感器的制備方法。將羧基化的多壁碳納米管和氨基化的離子液體進行化學(xué)反應(yīng)形成酰胺化的碳納米管，然后將細(xì)胞色素c固定在酰胺化的碳納米管修飾的玻碳電極上增加了它的吸附和催化活性。本發(fā)明從安培響應(yīng)中可以得到過氧化氫的檢測線達1.3×10-8M，MWNTs-IL/Cyt c/GCE對過氧化氫的氧化具有靈敏的響應(yīng)。
文檔編號G01N27/327GK102507694SQ20111035895
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月14日
發(fā)明者劉秀輝, 南志漢, 卜彩紅, 盧小泉, 張義軍, 裘宇 申請人:西北師范大學(xué)