專利名稱：日本血吸蟲SjSap重組抗原蛋白及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子、細胞生物學研究領域，具體涉及日本血吸蟲含鞘脂激活蛋白B結構域蛋白(SjSap)的重組抗原蛋白及其制備方法。此外，本發(fā)明還涉及該日本血吸蟲SjSap重組抗原蛋白在檢測日本血吸蟲病人血清抗體中的應用。
背景技術：
血吸蟲病(Schistosomiasis)是由血吸蟲(Schistosoma)感染所引起的一種寄生蟲病，廣泛分布于非洲、中東、南美和東南亞的76個國家和地區(qū)。全球至少有2.4億人受感染，7億人受威脅，嚴重影響著人類的健康并阻礙流行區(qū)社會經濟的發(fā)展。血吸蟲病至今仍然是世界范圍內的主要公共衛(wèi)生問題之一；疫情嚴重的地區(qū)主要分布在非洲撒哈拉以南的國家,血吸蟲感染的人數占全球總數的85%以上。全球每年死于血吸蟲病的人數達28萬。血吸蟲也稱為裂體吸蟲或住血吸蟲，隸屬于吸蟲綱、復殖目、裂體科、裂體屬。寄生于人體的血吸蟲主要有6種，分別為曼氏血吸蟲(Schistosoma mansoni)、日本血吸蟲(S.japonicum)、埃及血吸蟲(S.haematobium)、馬來血吸蟲(S.malayensis)、間插血吸蟲(S.1ntercalatum)和湄公血吸蟲(S.mekongi)。在世界范圍內流行于感染人群的血吸蟲有3種即曼氏血吸蟲、日本血吸蟲和埃及血吸蟲。在我國僅有日本血吸蟲病的流行,它是我國5種主要的寄生蟲病之一。由于日本血吸蟲感染所導致的病情最為嚴重，也是防治難度最大的。主要原因在于日本血吸蟲動物宿主多；成蟲存活時間長；感染后宿主的伴隨免疫以及治愈后的免疫力差；中間宿主釘螺分布廣泛且難以消滅等等。在血吸蟲感染宿主的過程中，尾蝴、童蟲、成蟲和蟲卵均可對宿主造成損害。其主要原因是血吸蟲不同的發(fā)育時期可以釋放不同的抗原誘導宿主的免疫應答，這些特異性免疫應答的結果是一系列免疫病理變化的出現(xiàn)，日本血吸蟲對終末宿主的主要危害是蟲卵肉芽腫反應和肝纖維化。目前，普遍認為血吸蟲病是一種免疫性的疾??；根據病程和臨床癥狀，血吸蟲病可分為急性、慢性和`晚期三種。診斷是確定血吸蟲感染率以及感染度的有效手段。診斷不僅為流行區(qū)的劃分提供判斷標準，還為血吸蟲病防治活動的各個環(huán)節(jié)提供必不可少的信息和科學依據，在防治工作中處于重要位置。無論從個體水平確定藥物化療的對象、考核化療的效果，還是在群體水平監(jiān)測血吸蟲病疫情的變化、考核血吸蟲病控制效果和評估流行趨勢等等，均需要以診斷結果作為評判依據之一。傳統(tǒng)的病原學方法(糞便檢查)是診斷血吸蟲病最為經典和可靠的途徑，是判斷血吸蟲感染與否的“金標準”。但是病原學方法工作強度大、診斷周期長，而且流行區(qū)人群的依從性逐年下降，收集病人糞便的難度不斷增加。此外隨著血吸蟲病大規(guī)模防治規(guī)劃的實施，流行區(qū)病人的感染度和感染率明顯下降，病原學方法在血吸蟲病低度流行區(qū)的敏感性有限，糞檢查出病原的難度增大。因此，單純依靠病原學的診斷方法已經不能適應大規(guī)模血吸蟲病防治工作的需要。免疫學的診斷方法具有操作簡便、敏感性較高、特異性較好和流行區(qū)群眾的依從性較高等優(yōu)點，已逐漸為廣大血防工作人員以及流行區(qū)群眾所接受，并且在流行區(qū)化療對象的大規(guī)模篩查、血清流行病學調查以及防治效果的評價等方面起到了極為重要的作用。目前，血吸蟲病免疫診斷最常用的抗原是成蟲和蟲卵抗原，但抗原成分復雜，制備步驟繁瑣，來源有限且不易質控，難以適應大規(guī)?，F(xiàn)場疾病普查的需求。依靠基因工程方法生產的重組抗原分子可為現(xiàn)場推廣應用提供大量的抗原材料，且成分明確、特異性好。鞘脂激活蛋白(Saposin)是由其前體蛋白(Prosaposin)產生的熱穩(wěn)定性蛋白家族，包括鞘脂激活蛋白A、B、C、D。其功能是作為鞘脂糖水解途徑中所涉及到的溶酶體酶的激活劑，參與帶有短的寡糖鏈的脂類的代謝。四種鞘脂激活蛋白的結構相似，均有形成二硫鍵以穩(wěn)定結構的6個半胱氨酸、一個糖基化位點以及同一位點的保守脯氨酸殘基。鞘脂激活蛋白B(Saposin B)是最早被發(fā)現(xiàn)和研究的鞘脂激活蛋白，該蛋白可以活化芳香基硫酸酯酶A、α-半乳糖苷酶、酸性β_半乳糖苷酶等多種酶類，參與部分糖脂和甘油脂的代謝等，因此被認為是一種非特異性的激活蛋白。鞘脂激活蛋白樣蛋白(Saposin-like protein, SAPLIP)是一大類具有saposin結構域的蛋白家族，廣泛存在于原生動物到哺乳動物的體內，并發(fā)揮各種生物學作用。Espino等采用肝片吸蟲的重組SAPLIP蛋白(rFhSAP-2)免疫兔子，初次免疫后2周即可產生高水平的rFhSAP-2特異性抗體，兩次免疫后攻擊感染獲得了 81.2%的減蟲率，在糞便和肝臟中分別獲得了 83.8%和73.0%的減卵率，表明該蛋白是一種很好的疫苗候選分子。Lee等使用重組的華支睪吸蟲鞘脂激活蛋白樣蛋白(clonorin)分別對華支睪吸蟲病人(20份)、后睪吸蟲病人(9份)、并殖吸蟲病人(20份)、日本血吸蟲病人(20份)、裂頭蝴病人(20份)、豬囊尾蝴病人(20份)和正常人(40份)進行ELISA試驗，結果顯示該重組蛋白用于免疫診斷具有34%的敏感性和99%的特異性；clonorin特異性的IgG抗體水平在囊蝴感染后8周顯著升高，并維持較長時間。 Don等表達了曼氏血吸蟲的鞘脂激活蛋白樣蛋白Sm-SLP-1 (包含I個SAPLIP結構域)和Sm-SLP-2 (包含2個SAPLIP結構域)，免疫定位試驗顯示該蛋白主要表達于消化道內皮，推測可能與血紅蛋白的消化相關。重組的Sm-SLP-1蛋白不僅可以被感染的小鼠血清識別，還可以被病人血清識別，提示該蛋白可能具有潛在的診斷價值。張純等克隆并表達了日本血吸蟲12kDa的鞘脂激活蛋白樣蛋白(Sj-SLP)，純化的重組蛋白(rSj-SLP)能被感染兔血清識別，而不被正常兔血清識別；rSj-SLP免疫新西蘭大白兔可產生1: 12800的特異性抗體，表明該蛋白具有較強的免疫原性和抗原性。日本血吸蟲含鞘脂激活蛋白B結構域蛋白(SjSap)是一種含有SaposinB的結構域的蛋白，與SAPLIP具有類似的疏水氨基酸的分布、具有形成二硫鍵以穩(wěn)定結構的6個半胱氨酸以及保守的脯氨酸殘基。該蛋白與已報道的SAPLIP家族成員的氨基酸序列同源性低于30%，是血吸蟲新的蛋白序列。本發(fā)明通過PCR擴增出日本血吸蟲SjSap全基因，并在大腸桿菌中重組表達此基因，得到大小約為20kDa的重組蛋白，經ELISA試驗確認所得重組蛋白用于日本血吸蟲病的診斷具有較高的敏感性和特異性，是潛在的診斷抗原候選靶標，從而完成了本發(fā)明。在本發(fā)明之前，還沒有出現(xiàn)涉及本發(fā)明日本血吸蟲SjSap重組抗原蛋白及其用于日本血吸蟲病診斷的公開報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題之一是提供一種日本血吸蟲SjSap重組抗原蛋白。本發(fā)明要解決的技術問題之二是提供一對用于日本血吸蟲SjSap基因PCR擴增的特異性引物。本發(fā)明要解決的技術問題之三是提供該日本血吸蟲SjSap重組抗原蛋白的制備方法。本發(fā)明要解決的技術問題之四是提供該日本血吸蟲SjSap重組抗原蛋白在檢測日本血吸蟲病人血清抗體中的應用。本發(fā)明通過生物信息學技術分析獲得了日本血吸蟲SjSap的編碼基因序列(如SEQ ID N0.1所示序列(Genbank FN315902.1))。利用分子生物學技術對日本血吸蟲SjSap基因進行PCR擴增，純化擴增產物，將所得產物、質粒載體pET-28a(+)分別進行酶切、回收，連接構建成SjSap基因原核表達的重組質粒pET-28a(+)_SjSap，通過轉化篩選，抽提重組質粒，經PCR、測序及酶切鑒定確認后，轉化至宿主細胞大腸肝菌中表達；取表達量較高的克隆，發(fā)酵制備菌體，鑒定重組蛋白的溶解性；由于表達的重組蛋白為包涵且難溶于變性劑中，因此直接將全菌體進行SDS-PAGE，經卡馬斯亮藍染色后切下目的條帶，用PAGE膠蛋白微量回收試劑盒回收純化目的蛋白，最終得到純化的重組蛋白SjSap，完成了 SjSap基因的體外克隆表達及純化。為了解決上述技術問題，本發(fā)明通過如下技術方案實現(xiàn):本發(fā)明第一個方面是提供一種日本血吸蟲SjSap重組抗原蛋白，其具有SEQ IDN0.2所示氨基酸序列的蛋白、或由該蛋白發(fā)生一個或多個氨基酸的置換、缺失或插入而形成的具有相同功 能的蛋白。本發(fā)明第二個方面是提供了一對用于日本血吸蟲SjSap基因PCR擴增的特異性引物，其序列為:上游:5'-CCGGAATTC ATGTTGAAACGATTGTTTATATTGATTG-3'(如 SEQ IDNO:3所示)或其互補鏈；下游:5'-CCG CTCGAG TTAAGTGGTGAATTGAACTAGAAACTTC-3'(如 SEQ ID NO:4所示)或其互補鏈。本發(fā)明第三個方面提供了一種日本血吸蟲SjSap重組抗原蛋白的制備方法，包括如下步驟:I)日本血吸蟲SjSap基因序列的擴增(用PCR技術從日本血吸蟲成蟲cDNA中獲得SjSap的DNA片段);2)日本血吸蟲SjSap重組質粒的構建和鑒定:用pET_28a(+)載體構建日本血吸蟲 SjSap 重組表達質粒 pET-28a(+)-SjSap ；3)將pET_28a (+) -SjSap重組質粒轉化于宿主細胞中，并在宿主細胞中表達，得到表達的重組蛋白SjSap ；4)PAGE膠蛋白微量回收試劑盒回收純化表達的重組蛋白SjSap。步驟I)日本血吸蟲SjSap基因序列的擴增，具體為:以含有日本血吸蟲SjSap基因序列的cDNA克隆為模板，SEQ IDN0.3 (CCG GAATTC ATGTTGAAACGATTGTTTATATTGATTG)或其互補鏈為 5’ 引物，SEQ IDN0.4 (CCG CTCGAG TTAAGTGGTGAATTGAACTAGAAACTTC)或其互補鏈為 3’ 引物，進行 PCR 擴增，所得PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，用QIAquick 膠回收試劑盒(QIAquick Gel ExtractionKit)回收純化。所述PCR擴增的反應條件為95°C預變性5min ;94°C變性lmin，59°C退火lmin，72°C延伸lmin，72°C延伸10min，30個循環(huán)；最后保存于4°C。步驟2)構建可在宿主細胞中表達SjSap編碼基因的重組質粒pET-28a(+)_SjSap，具體為:將純化的SjSap基因PCR產物片段和質粒載體pET_28a(+)分別用限制性內切酶EcoR I 和Xho I 進行酶切，用QIAquic 膠回收試劑盒(QIAquick Gel Extraction Kit)回收純化。純化后的目的基因片段和載體酶切片段按照3: 1(摩爾比)的比例進行連接，構建成SjSap編碼基因原核表達的重組質粒pET-28a(+)-SjSap。將此質粒通過CaCl2法轉化入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，培養(yǎng)后涂布于含卡那霉素的LB瓊脂平板上，隨機挑取上述平板上的菌落，培養(yǎng)后收集菌體，用AxyPrep質粒小量制備試劑盒抽提菌體中所含重組質粒，進行PCR鑒定、測序鑒定及酶切鑒定。步驟3)重組質粒pET_28a (+) -SjSap在大腸肝菌(宿主細胞)中的表達，具體為:通過鈣轉化將上述抽提所得pET-28a(+)_SjSap重組質粒轉化入大腸桿菌BL2KDE3)中，培養(yǎng)后涂布于含卡那霉素的LB瓊脂平板上。隨機挑取上述平板上的菌落，培養(yǎng)菌液至對數生長期，加入誘導劑(IPTG)繼續(xù)培養(yǎng)。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定誘導表達結果，直接以全菌體電泳顯示。步驟4)純化SjSap重組蛋白:取表達重組蛋白SjSap量較高的凍存菌種劃線于含卡那霉素的LB瓊脂平板上，培養(yǎng)過夜之后，隨機挑取上述平板上的菌落接種至同樣含卡那霉素的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)菌液至對數生長期，加入誘導劑繼續(xù)`培養(yǎng)，最后收取菌體；在上述菌體中加入BugBuster蛋白抽提劑裂解細菌，離心后保留上清液與沉淀，由SDS-PAGE電泳鑒定結果。根據上述結果，用變性劑裂解所得沉淀，沉淀難溶于變性劑。將表達重組蛋白的全菌體進行SDS-PAGE，凝膠經考馬斯亮藍染色后，切下目的條帶，用PAGE膠蛋白微量回收試劑盒進行回收純化，SDS-PAGE檢驗純化結果。本發(fā)明第四個方面提供了一種日本血吸蟲SjSap重組抗原蛋白在檢測日本血吸蟲病人血清抗體中的應用。本發(fā)明以純化的日本血吸蟲SjSap重組抗原蛋白包被酶標板，4°C過夜。加入封閉液，ΙΟΟμ I/孔，封閉酶標板上的非特異性結合位點。分別加入I: 100稀釋的血吸蟲病人血清、其他常見人體寄生蟲病人血清和正常人血清，100 μ I/孔，每份樣品均做復孔，于37°C反應2小時。每孔加入100 μ I的HRP標記羊抗人IgG全分子(Sigma-Aldrich，適當的稀釋度)，37°C反應I小時。加入100 μ I/孔的TMB底物溶液，室溫顯色后加入100 μ I/孔的2Μ H2SO4終止反應。用酶標儀讀取0D450 的數值。以上各步驟之間分別用PBST (磷酸鹽吐溫緩沖液)進行洗滌。經上述日本血吸蟲SjSap重組蛋白的間接ELISA試驗的驗證，本發(fā)明的日本血吸蟲SjSap重組抗原蛋白用于日本血吸蟲病的診斷具有較高的敏感性和特異性，是潛在的診斷抗原候選靶標，可以作為日本血吸蟲病免疫診斷的目的抗原。


圖1是實施例1中日本血吸蟲SjSap基因序列的擴增結果示意圖。圖1中，M:DNA分子量標準;1 =SjSap ；2:空白對照。圖2是實施例3中日本血吸蟲SjSap基因重組質粒菌落PCR鑒定結果示意圖。圖2中，M =DNA分子量標準；1_4 =SjSap ；5:空白對照。圖3是實施例4中日本血吸蟲重組蛋白(SjSap)的SDS-PAGE分析結果示意圖。圖3中，M:蛋白分子量標準；1:未誘導對照；2:誘導后4h(lmM/L IPTG) ；3:菌體裂解后上清；
4:菌體裂解后沉淀。圖4是實施例5中SjSap重組蛋白純化效果的SDS-PAGE分析結果示意圖。圖4中，M:蛋白分子量標準；1:未誘導對照；2:誘導后4h(lmM/L IPTG) ；3:菌體裂解后上清；4:菌體裂解后沉淀；5純化后SjSap重組蛋白。圖5是實施例6中SjSap重組蛋白用于血清抗體檢測的敏感性和特異性試驗結果示意圖。
具體實施例方式以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。主要試劑如表1所示:表權利要求
1.一種日本血吸蟲SjSap重組抗原蛋白，其特征在于，具有SEQ ID N0.2所示氨基酸序列的蛋白、或由該蛋白發(fā)生一個或多個氨基酸的置換、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白。
2.一對用于日本血吸蟲SjSap基因PCR擴增的特異性引物，其特征在于，其序列為: 上游:5' -CCGGAATTCATGTTGAAACGATTGTTTATATTGATTG-3/ (如 SEQ ID NO:3 所示)或其互補鏈； 下游:5' -CCGCTCGAGTTAAGTGGTGAATTGAACTAGAAACTTC-3'(如 SEQ IDNO:4 所示)或其互補鏈。
3.—種如權利要求1所述的日本血吸蟲SjSap重組抗原蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)日本血吸蟲SjSap基因序列的擴增； 2)日本血吸蟲SjSap重組質粒的構建和鑒定； 3)將該重組質粒轉化于宿主細胞中，并在宿主細胞中表達，得到表達的重組蛋白； 4)PAGE膠蛋白微量回收試劑盒回收純化表達的重組蛋白。
4.如權利要求3所述的日本血吸蟲SjSap重組抗原蛋白的制備方法，其特征在于，步驟I)具體為:設計SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或其互補鏈和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列或其互補鏈為引物，以含日本血吸蟲成蟲cDNA為模板進行PCR擴增；所得PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，并回收純化。
5.如權利要求4所 述的日本血吸蟲SjSap重組抗原蛋白的制備方法，其特征在于，所述PCR擴增的反應條件為95°C預變性5min ;94°C變性lmin，59°C退火lmin，72°C延伸Imin，72°C延伸10min，30個循環(huán)；最后保存于4°C。
6.如權利要求3所述的日本血吸蟲SjSap重組抗原蛋白的制備方法，其特征在于，步驟2)具體為:將步驟I)所得的PCR產物片段與質粒載體pET-28a(+)分別用限制性內切酶EcoR I和Xho I進行雙酶切，并回收純化；根據純化后的目的基因片段和載體酶切片段的濃度進行連接，構建成SjSap編碼基因原核表達的重組質粒pET-28a(+)-SjSap ;將此重組質粒通過CaCl2法轉化入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，培養(yǎng)后涂布于含卡那霉素LB瓊脂平板上，隨機挑取上述平板上的菌落，培養(yǎng)后收集菌體，抽提菌體中所含重組質粒，進行PCR鑒定、測序鑒定。
7.如權利要求3所述的日本血吸蟲SjSap重組抗原蛋白的制備方法，其特征在于，步驟3)具體為:通過鈣轉化將步驟2)測序鑒定無誤的pET-28a(+)-SjSap重組質粒轉化入大腸桿菌BL21(DE3)中，培養(yǎng)后涂布于含卡那霉素的LB瓊脂平板上；隨機挑取上述平板上的菌落，培養(yǎng)大腸桿菌至對數生長期，加入誘導劑繼續(xù)培養(yǎng)；SDS-PAGE電泳鑒定誘導表達結果，直接以全菌體電泳顯示。
8.如權利要求3所述的日本血吸蟲SjSap重組抗原蛋白的制備方法，其特征在于，步驟4)具體為:取表達重組蛋白SjSap量較高的凍存菌種劃線于含卡那霉素的LB瓊脂平板上，培養(yǎng)過夜之后，隨機挑取上述平板上的菌落接種至同樣含卡那霉素的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)菌液至對數生長期，加入誘導劑繼續(xù)培養(yǎng)，最后收取菌體；在上述菌體中加入BugBuster蛋白抽提劑裂解細菌，離心后保留上清液與沉淀，由SDS-PAGE電泳鑒定結果；根據上述結果，用變性劑裂解所得沉淀，沉淀難溶于變性劑；將表達重組蛋白的全菌體進行SDS-PAGE，凝膠經考馬斯亮藍染色后，切下目的條帶，用PAGE膠蛋白微量回收試劑盒進行回收純化，SDS-PAGE檢驗純化結果。
9.一種如權 利要求1所述的重組抗原蛋白在檢測日本血吸蟲病人血清抗體中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種日本血吸蟲含鞘脂激活蛋白B結構域蛋白(SjSap)重組抗原蛋白，具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白、或由該蛋白發(fā)生一個或多個氨基酸的置換、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白。此外，本發(fā)明還公開了該日本血吸蟲SjSap重組抗原蛋白的制備方法，包括日本血吸蟲SjSap基因序列的擴增、日本血吸蟲SjSap重組質粒的構建和鑒定、重組蛋白的誘導表達和純化等步驟。此外，本發(fā)明還公開了該日本血吸蟲SjSap重組抗原蛋白在檢測日本血吸蟲病人血清抗體中的應用。經過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)的驗證，本發(fā)明的日本血吸蟲SjSap重組抗原蛋白用于日本血吸蟲病的診斷具有較高的敏感性和特異性，是潛在的診斷候選靶標，可以作為日本血吸蟲病診斷的目的抗原。
文檔編號G01N33/68GK103102404SQ201110359988
公開日2013年5月15日 申請日期2011年11月14日 優(yōu)先權日2011年11月14日
發(fā)明者盧艷, 胡薇, 徐斌, 鞠川, 莫筱瑾, 陳紳波, 馮正 申請人:中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所