專利名稱：液相芯片檢測金黃色葡萄球菌的方法
液相芯片檢測金黃色葡萄球菌的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于免疫技術(shù)及食品衛(wèi)生檢測技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景
金黃色葡萄球菌是人類的一種重要病原菌，是人類化膿感染中最常見的病原菌， 可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。金黃色葡萄球菌存在于自然界的空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中。因而，食品受其污染的機會很多。近年來，美國疾病控制中心報告，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌。金黃色葡萄球菌腸毒素是個世界性衛(wèi)生難題，在美國由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒，占整個細(xì)菌性食物中毒的33%，加拿大則更多，占到45%，我國每年發(fā)生的此類中毒事件也非常多。因此建立一種及時，快速，準(zhǔn)確的檢測金黃色葡萄球菌的方法顯得尤為重要。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種運用液相芯片技術(shù)，用于檢測金黃色葡萄球菌的方法， 以便實現(xiàn)對金黃色葡萄球菌的快速檢測。
本發(fā)明由微球、捕獲抗體、檢測抗體、生物素標(biāo)記的抗抗體、鏈霉親和素-藻紅蛋白組成，所述微球為羧基化的31號微球；所述捕獲抗體是金黃色葡萄球菌單克隆抗體，所述檢測抗體是金黃色葡萄球菌的多克隆抗體，生物素標(biāo)記的抗抗體是經(jīng)活化的生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG ；所述捕獲抗體和檢測抗體均能特異與金黃色葡萄球菌結(jié)合，以紅色激光激發(fā)其球型基質(zhì)上的紅色分類熒光，以綠色激光激發(fā)與生物素標(biāo)記的抗抗體相結(jié)合的藻紅蛋白，測定球型基質(zhì)上結(jié)合的報告熒光分子的數(shù)量，用于間接確定球型基質(zhì)上結(jié)合金黃色葡萄球菌的數(shù)量；捕獲抗體與微球偶聯(lián)形成偶聯(lián)體取微球原液室溫恢復(fù)30min，用超聲波清洗機進(jìn)行超聲lOmin，漩渦震蕩30s，使微球均勻分布；用無菌水分別配制50mg/ml的EDC和NHS，然后取200ul的微球原液置于1. 5ml的離心管中，14000 rpm，離心5min，取出后棄上清，加入NHS和EDC各10ul，再加入80ul的活化緩沖液，混勻后，用鋁箔紙包好，置于37°C搖床120 rpm，20min，然后14000 rpm，離心 5min,小心移去上清，加入500ul稀釋至250ug/ml的捕獲抗體，重懸混勻，置于37°C搖床120 rpm,孵育池，取出后離心棄上清，用500ul的PBS進(jìn)行洗滌，洗滌后加入500ul 1 % BSA的 PBS溶液，重懸微球，37°C水浴搖床孵育兩個小時進(jìn)行封閉，封閉后4°C保存； 液相芯片檢測金黃色葡萄球菌將已偶聯(lián)的微球混合液室溫恢復(fù)lOmin，漩渦振蕩器震蕩約3min，取約5000個微球， 加入IO8 CFU/ml的金黃色葡萄球菌10ul，用PBS-TBN補足體積到lOOul，置于37°C搖床 120rpm，lh，取出后離心棄上清，用200ul PBS-TBN洗兩次，加入已稀釋的檢測抗體IOul，用 PBS-TBN補足體積到lOOul，置于37°C搖床120rpm，lh,取出后離心，棄上清，用PBS-TBN洗兩次，然后加入已稀釋的生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG IOul，用PBS-TBN補足體積到IOOul，置于37°C搖床反應(yīng)lh，取出后離心棄上清，用PBS-TBN洗兩次，再加入SA-PE，用PBS-TBN補足體積到IOOul，置于37°C搖床反應(yīng)，取出后離心棄上清，用PBS-TBN洗滌兩次，重懸于IOOul PBS-TBN中，上機進(jìn)行檢測。
本發(fā)明液相芯片是集合流式細(xì)胞技術(shù)、激光技術(shù)、數(shù)字信號處理技術(shù)及傳統(tǒng)化學(xué)技術(shù)為一體的新型生物分子檢測技術(shù)，其最大的特點是高通量，靈活性好，靈敏度高。運用液相芯片技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌(step如A^occm aureus)的方法，以便實現(xiàn)對金黃色葡萄球菌的快速檢測，為食品安全做出貢獻(xiàn)。


圖1是本發(fā)明捕獲抗體最佳工作濃度； 圖2是本發(fā)明靈敏度檢測結(jié)果；圖3是本發(fā)明特異性的檢測結(jié)果； 圖4是本發(fā)明重復(fù)性檢測結(jié)果；圖5是本發(fā)明在進(jìn)行檢測時所顯示微球位置以及數(shù)量的實時圖的點狀圖； 圖6是本發(fā)明在進(jìn)行檢測時所顯示微球位置以及數(shù)量的實時圖的柱狀圖。
具體實施方式
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是通過金黃色葡萄球菌的特異抗體，與微球進(jìn)行偶聯(lián)后，制備出可以對金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測的液相芯片，在應(yīng)用時，加入樣品增菌液，使增菌液中的金黃色葡萄球菌被微球上的捕獲抗體所捕獲，檢測抗體也與金黃色葡萄球菌結(jié)合后，再與生物素標(biāo)記的抗抗體共同孵育，然后通過生物素與鏈霉親和素-藻紅蛋白反應(yīng)，應(yīng)用LuminexlOO檢測系統(tǒng)實現(xiàn)對金黃色葡萄球菌的特異檢測。
本發(fā)明涉及的檢測金黃色葡萄球菌液相芯片主要由微球、捕獲抗體、檢測抗體、生物素標(biāo)記的抗抗體、鏈霉親和素-藻紅蛋白(SA-PE)組成。所述微球為羧基化的31號微球；所述捕獲抗體是金黃色葡萄球菌的單克隆抗體a mAb)，所述檢測抗體是金黃色葡萄球菌的多克隆抗體(份.a pAb)，生物素標(biāo)記的抗抗體是經(jīng)活化的生物素標(biāo)記的羊抗兔 IgG(biotin-羊抗兔IgG)；所述捕獲抗體和檢測抗體均能特異與金黃色葡萄球菌結(jié)合。以紅色激光激發(fā)其球型基質(zhì)上的紅色分類熒光，以綠色激光激發(fā)與生物素標(biāo)記的抗抗體相結(jié)合的藻紅蛋白，測定球型基質(zhì)上結(jié)合的報告熒光分子的數(shù)量，用于間接確定球型基質(zhì)上結(jié)合金黃色葡萄球菌的數(shù)量。
上述的檢測抗體是用于識別金黃色葡萄球菌的另一類抗體，其作用是將與液相芯片上捕獲抗體結(jié)合的金黃色葡萄球菌與抗抗體結(jié)合，而抗抗體能與檢測熒光偶聯(lián)，間接將結(jié)合的金黃色葡萄球菌濃度與檢測熒光的強度結(jié)合起來，從而實現(xiàn)對金黃色葡萄球菌的濃度進(jìn)行定量測定。生物素標(biāo)記的抗抗體通過生物素與鏈霉親和素-藻紅蛋白結(jié)合，最后通過LuminexlOO檢測系統(tǒng)對金黃色葡萄球菌進(jìn)行定性定量檢測。
(1)捕獲抗體與微球偶聯(lián)形成偶聯(lián)體取微球原液室溫恢復(fù)30min，用超聲波清洗機進(jìn)行超聲lOmin，漩渦震蕩30s，使微球均勻分布。用無菌水分別配制50mg/ml的EDC和NHS。然后取200ul的微球原液置于1. 5ml的離心管中，14000 rpm，離心5min。取出后棄上清，加入NHS和EDC各10ul，再加入80ul 的活化緩沖液。混勻后，用鋁箔紙包好，置于37°C搖床120 rpm，20min，然后14000 rpm，離心5min，小心移去上清。加入500ul稀釋至250ug/ml的捕獲抗體，重懸混勻，置于37°C搖床120 rpm,孵育池。取出后離心棄上清，用500ul的PBS進(jìn)行洗滌，洗滌后加入500ul 1 % BSA的PBS溶液，重懸微球，37°C水浴搖床孵育兩個小時進(jìn)行封閉。封閉后4°C保存。
(2)應(yīng)用液相芯片檢測金黃色葡萄球菌的方法將已偶聯(lián)的微球混合液室溫恢復(fù)lOmin，漩渦振蕩器震蕩約;3min。取約5000個微球， 加入IO8 CFU/ml的金黃色葡萄球菌IOul，用PBS-TBN補足體積到IOOul。置于37°C搖床 120rpm, Ih。取出后離心棄上清，用200ul PBS-TBN洗兩次。加入已稀釋的檢測抗體IOul，用 PBS-TBN補足體積到IOOul。置于37°C搖床120rpm，lh。取出后離心，棄上清，用PBS-TBN 洗兩次。然后加入已稀釋的生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG IOul，用PBS-TBN補足體積到IOOul。 置于37°C搖床反應(yīng)lh。取出后離心棄上清，用PBS-TBN洗兩次。再加入SA-PE，用PBS-TBN 補足體積到lOOul，置于37°C搖床反應(yīng)，取出后離心棄上清，用PBS-TBN洗滌兩次。重懸于 IOOul PBS-TBN中，上機進(jìn)行檢測。
1.捕獲抗體最佳工作濃度的確定見圖1，當(dāng)單抗?jié)舛葹?50ug/ml時，其MFI值達(dá)到最大，故單抗最佳的工作濃度為 250ug/mlo
2.偶聯(lián)是否成功的檢測
權(quán)利要求
1. 一種液相芯片檢測金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于由微球、捕獲抗體、檢測抗體、生物素標(biāo)記的抗抗體、鏈霉親和素-藻紅蛋白組成，所述微球為羧基化的31號微球；所述捕獲抗體是金黃色葡萄球菌單克隆抗體，所述檢測抗體是金黃色葡萄球菌的多克隆抗體，生物素標(biāo)記的抗抗體是經(jīng)活化的生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG ；所述捕獲抗體和檢測抗體均能特異與金黃色葡萄球菌結(jié)合，以紅色激光激發(fā)其球型基質(zhì)上的紅色分類熒光，以綠色激光激發(fā)與生物素標(biāo)記的抗抗體相結(jié)合的藻紅蛋白，測定球型基質(zhì)上結(jié)合的報告熒光分子的數(shù)量，用于間接確定球型基質(zhì)上結(jié)合金黃色葡萄球菌的數(shù)量； 捕獲抗體與微球偶聯(lián)形成偶聯(lián)體取微球原液室溫恢復(fù)30min，用超聲波清洗機進(jìn)行超聲lOmin，漩渦震蕩30s，使微球均勻分布；用無菌水分別配制50mg/ml的EDC和NHS，然后取200ul的微球原液置于1. 5ml的離心管中，14000 rpm，離心5min，取出后棄上清，加入NHS和EDC各IOul，再加入80ul的活化緩沖液，混勻后，用鋁箔紙包好，置于37°C搖床120 rpm，20min，然后14000 rpm，離心 5min,小心移去上清，加入500ul稀釋至250ug/ml的捕獲抗體，重懸混勻，置于37°C搖床120 rpm,孵育池，取出后離心棄上清，用500ul的PBS進(jìn)行洗滌，洗滌后加入500ul 1 % BSA的 PBS溶液，重懸微球，37°C水浴搖床孵育兩個小時進(jìn)行封閉，封閉后4°C保存； 液相芯片檢測金黃色葡萄球菌將已偶聯(lián)的微球混合液室溫恢復(fù)lOmin，漩渦振蕩器震蕩約3min，取約5000個微球， 加入IO8 CFU/ml的金黃色葡萄球菌10ul，用PBS-TBN補足體積到lOOul，置于37°C搖床 120rpm，lh，取出后離心棄上清，用200ul PBS-TBN洗兩次，加入已稀釋的檢測抗體IOul，用 PBS-TBN補足體積到lOOul，置于37°C搖床120rpm，lh，取出后離心，棄上清，用PBS-TBN洗兩次，然后加入已稀釋的生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG IOul，用PBS-TBN補足體積到lOOul，置于37°C搖床反應(yīng)lh，取出后離心棄上清，用PBS-TBN洗兩次，再加入SA-PE，用PBS-TBN補足體積到lOOul，置于37°C搖床反應(yīng)，取出后離心棄上清，用PBS-TBN洗滌兩次，重懸于IOOul PBS-TBN中，上機進(jìn)行檢測。
全文摘要
一種液相芯片檢測金黃色葡萄球菌的方法，屬于免疫技術(shù)及食品衛(wèi)生檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的目的是提供一種運用液相芯片技術(shù)，提供一種用于檢測金黃色葡萄球菌的方法，以便實現(xiàn)對金黃色葡萄球菌的快速檢測。本發(fā)明制備了液相芯片，然后應(yīng)用液相芯片檢測金黃色葡萄球菌。本發(fā)明液相芯片是集合流式細(xì)胞技術(shù)、激光技術(shù)、數(shù)字信號處理技術(shù)及傳統(tǒng)化學(xué)技術(shù)為一體的新型生物分子檢測技術(shù)，其最大的特點是高通量，靈活性好，靈敏度高。運用液相芯片技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)的方法，以便實現(xiàn)對金黃色葡萄球菌的快速檢測，為食品安全做出貢獻(xiàn)。
文檔編號G01N33/577GK102507949SQ20111036055
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月15日
發(fā)明者劉金華, 宋戰(zhàn)昀, 王亞麗, 王振國, 羅雁非, 蔡陽 申請人:吉林出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心