專利名稱：一種基于脫氧核酶水凝膠的銅離子檢測(cè)傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及銅離子檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及脫氧核酶水凝膠在銅離子檢測(cè)傳感器中的用途。
背景技術(shù)：
銅是人類最早使用的金屬，銅離子廣泛存在于自然界，銅離子也是人類必需的微量元素，但是銅超標(biāo)對(duì)人體的危害也很大，主要是由重金屬離子銅帶來的危害。當(dāng)人體內(nèi)殘存了大量的重金屬之后，急易對(duì)身體內(nèi)的臟器造成負(fù)擔(dān)，特別是肝和膽，當(dāng)這兩種器官出現(xiàn)問題后，維持人體內(nèi)的新陳代謝就會(huì)出現(xiàn)紊亂，肝硬化，肝腹水甚至更為嚴(yán)重。美國環(huán)境保護(hù)局對(duì)飲用水中銅離子的檢測(cè)濃度要求是不高于20 μ Mo傳統(tǒng)對(duì)于銅離子的檢測(cè)采用的是原子吸收或ICP-MS等復(fù)雜、昂貴的儀器。采用脫氧核酶(DNAzyme)水凝膠體系對(duì)高靈敏檢測(cè)水中銅離子的含量的應(yīng)用存在巨大的潛力。本發(fā)明提供脫氧核酶水凝膠在銅離子檢測(cè)中的用途。本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)銅離子的快速檢測(cè)，在不需要昂貴復(fù)雜儀器設(shè)備的同時(shí)還具有很高的選擇性、測(cè)定速度快等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種基于脫氧核酶水凝膠的銅離子檢測(cè)傳感器，脫氧核酶(DNAzyme) 水凝膠使得銅離子檢測(cè)傳感器具有很高的選擇性和測(cè)定速度快等優(yōu)點(diǎn)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的解決方案如下
一種基于脫氧核酶水凝膠的銅離子檢測(cè)傳感器，包括脫氧核酶水凝膠，脫氧核酶水凝膠是由甲基丙烯基團(tuán)修飾的底物鏈和甲基丙烯基團(tuán)修飾的脫氧核酶通過堿基互補(bǔ)配對(duì)交聯(lián)形成的三維網(wǎng)狀的水凝膠，并且在水凝膠上包裹有金納米顆粒。為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面結(jié)合具體實(shí)例描述脫氧核酶水凝膠在銅離子檢測(cè)中的應(yīng)用。脫氧核酶水凝膠的制備過程如下
1)合成丙烯酸亞磷酰胺單體
丙烯酸亞磷酰胺單體的合成分為三個(gè)步驟a)將Ig 6-氨基-1-己醇，2. 36mL三乙胺加入IOOmL 二氯甲烷中冰浴，在無水無氧條件下逐滴加入2. 67g甲基丙烯酰氯，在室溫條件下攪拌反應(yīng)2小時(shí)；b)將溶劑旋干，向產(chǎn)物中加入IOmL乙醇和15%Na0H，將產(chǎn)物選擇性水解成6-異氰酸根合己基-甲基丙烯酰氯，再用硅膠柱分離純化；c)將0. 50g純化后的6-異氰酸根合己基-甲基丙烯酰氯溶于IOmL無水二氯甲烷中，在0° C條件下逐滴加入0. 98g N, N- 二異丙基乙胺，再逐滴加入0. 87ml 2-氰乙基N，N- 二異丙基氯代亞磷酰胺，在冰浴上反應(yīng)2小時(shí)；將溶劑旋干后，將產(chǎn)物用乙酸乙酯環(huán)己烷三乙胺40:60:3的洗脫液在硅膠柱上洗脫，得到的終產(chǎn)物為無色油狀液體；
2)甲基丙烯基團(tuán)修飾的底物鏈和脫氧核酶的合成與純化
5 ‘端標(biāo)記的底物鏈和脫氧核酶用CPG作為固相載體，使用DNA單體在DNA合成儀上從3'端開始合成，最后在5'端修飾步驟1)中合成的丙烯酸亞磷酰胺單體；合成結(jié)束后，將上述CPG轉(zhuǎn)移至anl Eppendorf管中，加入0. 5 mL 25 %的氨水在65°C下氨解8 hr，使DNA 從CPG上切割下來；氨解完畢取上清液進(jìn)行酒精沉淀，加入0. 1倍體積的3M NaCl和3倍體積的乙醇在-20° C冰箱中靜置20min，將得到的沉淀去除上層清液，再將沉淀溶于0. IM的醋酸三乙胺溶液中，用0. 22 μ m的濾膜過濾，再用高效液相色譜儀進(jìn)行純化；
3)底物鏈和脫氧核酶分別與丙烯酰胺單體聚合形成線性高分子鏈
將經(jīng)過步驟2)經(jīng)甲基丙烯基團(tuán)修飾的底物鏈和經(jīng)甲基丙烯基團(tuán)修飾的脫氧核酶分別溶解到含4%丙烯酰胺單體的50mM HEPES緩沖溶液中，抽真空lOmin，再向體系中加入終體積1. 4%的10%過硫酸銨和終體積1. 4%的5%四甲基乙二胺中，再次抽真空IOmin ；底物鏈和脫氧核酶分別與丙烯酰胺單體聚合形成線性高分子鏈；
4)金納米的修飾
取1. 5mL合成好的金納米顆粒于1. 5mL離心管中，再向管中加入質(zhì)量體積比為1. 5%的牛血清蛋白；金納米和牛血清蛋白孵育2-3小時(shí)之后，離心并去除上清液，將下層重新溶于水中就得到保護(hù)的金納米粒子；
5)脫氧核酶水凝膠的制備
將10 μ L兩條聚合好的DNA聚丙烯酰胺加入1/10體積的牛血清蛋白封閉的金納米顆粒，振蕩混勻后，再將兩條聚合鏈混合，將混合后的溶液置于60° C干浴器中IOmin后自然冷卻至室溫，得到包裹金納米顆粒的脫氧核酶水凝膠。脫氧核酶/底物鏈序列選擇性的驗(yàn)證為了驗(yàn)證該體系中銅離子對(duì)脫氧核酶/底物鏈的切割是由于脫氧核酶/底物鏈序列特異性識(shí)別所導(dǎo)致，而不是銅離子對(duì)序列的隨機(jī)切割形成的，合成一條于底物鏈完全互補(bǔ)的甲基丙烯基團(tuán)修飾的cDNA作為參照。由于DNA 雙鏈之間的堿基互補(bǔ)配對(duì)，底物鏈和底物鏈的cDNA也可以形成穩(wěn)定的DNA水凝膠。通過實(shí)驗(yàn)得出，底物鏈和底物鏈cDNA形成的水凝膠和脫氧核酶水凝膠在加入銅離子之前與上層的反應(yīng)溶液都能形成明顯的膠-溶液界面，但是在兩個(gè)體系中都加入銅離子之后，底物鏈/ cDNA水凝膠的體系對(duì)目標(biāo)物沒有響應(yīng)，仍然保持著膠的狀態(tài)，可是對(duì)于脫氧核酶水凝膠，在銅離子加入之后，整個(gè)膠就瓦解，整個(gè)體系變成溶液狀態(tài)，并且隨著金納米的擴(kuò)散，原來體系中下層是酒紅色的水凝膠逐漸擴(kuò)散開來，酒紅色的溶液擴(kuò)散到這個(gè)體系中來。這種明顯的變化用肉眼就可以清楚地分辨出來，不需要任何復(fù)雜，昂貴的儀器。脫氧核酶水凝膠的動(dòng)力學(xué)研究金納米顆粒在波長520nm處有較強(qiáng)的吸收，用紫外/可見分光光度計(jì)在不同時(shí)段檢測(cè)波長520nm處的吸收可以對(duì)整個(gè)體系的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)中可以得到，當(dāng)銅離子在100 μ M水平時(shí)，整個(gè)膠在大約1.5小時(shí)就完全瓦解， 說明該系體系不僅方便可視化檢測(cè)，并且對(duì)目標(biāo)物具有較快的響應(yīng)。需要指出，銅離子濃度對(duì)整個(gè)體系的反應(yīng)速度也有影響。當(dāng)銅離子濃度提高至10mM，整個(gè)反應(yīng)在15min就可完全反應(yīng)。如果反應(yīng)過夜，即使在5 μ M的水平，水凝膠也能有所響應(yīng)。脫氧核酶水凝膠的可視化檢測(cè)限雖然不同濃度的銅離子對(duì)這個(gè)體系瓦解的響應(yīng)時(shí)間不同，但是在某一相同的時(shí)間，不同濃度的銅離子對(duì)膠的瓦解程度是不同的。通過實(shí)驗(yàn)可以得到，在1. 5小時(shí)內(nèi)，100 μ M的銅離子可以將10 μ L的脫氧核酶完全瓦解，而隨著對(duì)銅離子濃度的降低，水凝膠瓦解的比例呈梯度逐漸減少，當(dāng)檢測(cè)濃度處于10 μ M時(shí)，大約只有 10%水凝膠瓦解。這使得水凝膠體系可以定量或者半定量的檢測(cè)溶液中銅離子的濃度。美國環(huán)境保護(hù)局對(duì)飲用水中銅離子的檢測(cè)濃度要求是不高于20 μ Μ,因此該水凝膠體系對(duì)高靈敏檢測(cè)水中銅離子的含量的應(yīng)用存在巨大的潛力。 本發(fā)明脫氧核酶水凝膠在銅離子檢測(cè)中的應(yīng)用，可作為可視化銅離子檢測(cè)傳感器中的應(yīng)用，具體為
一種可用于檢測(cè)銅離子的脫氧核酶水凝膠檢測(cè)傳感器，該傳感器由1.5mL離心管裝載制備好的脫氧核酶水凝膠緩沖體系(表示為Al，下同)組成。它用于測(cè)定水樣中銅離子殘留的測(cè)定方法為
1)將 οομL待測(cè)水樣用移液器加入脫氧核酶水凝膠緩沖體系上部的緩沖液層，置于 37°C干浴器中，用吸管輕輕吸打緩沖液層，使緩沖液與加入的待測(cè)水樣均勻混合；
2)將加入了待測(cè)水樣的脫氧核酶水凝膠緩沖體系于37°C干浴器中放置1.5小時(shí)，并用肉眼觀察體系中下層酒紅色的水凝膠是否逐漸擴(kuò)散開來；
3)目測(cè)結(jié)果，陰性樣品在脫氧核酶水凝膠可視化檢測(cè)傳感器中，上下次酒紅色水凝膠不擴(kuò)散，陽性樣品下層酒紅色水凝膠均勻擴(kuò)散至上層緩沖液體系；
4)銅離子檢測(cè)傳感器中加入IOOyL已知道濃度的銅離子水溶液，銅離子濃度小于 1000 μ M，重復(fù)步驟1)和步驟2)；
5)步驟2)和步驟4)中的脫氧核酶水凝膠檢測(cè)傳感器下層酒紅色水凝膠的擴(kuò)散瓦解程度，擴(kuò)散瓦解程度大的樣品銅離子的含量高。本發(fā)明中的銅離子檢測(cè)方法可通過目測(cè)結(jié)果，簡(jiǎn)單直觀，因此可用于研制銅離子可視化檢測(cè)傳感器。脫氧核酶-水凝膠應(yīng)用于銅離子檢測(cè)的工作原理為首先將銅離子的脫氧核酶裁剪成兩段，一條底物鏈，另一條是酶鏈，將裁剪的兩段單鏈DNA修飾上丙烯酰胺單體。再將修飾好的底物鏈和脫氧核酶分別和丙烯酰胺單體聚合，使這兩段DNA嵌入到丙酰胺聚合鏈中。接下來把這兩段高聚物混合，在堿基互補(bǔ)配對(duì)的作用下，兩段DNA雜交，將兩段高聚物交聯(lián)在一起，使整個(gè)體系形成具有三維網(wǎng)狀的水凝膠結(jié)構(gòu)，這個(gè)體系也由溶液態(tài)變?yōu)槟z狀。底物鏈和脫氧核酶形成的雜交結(jié)構(gòu)同時(shí)具有剛性結(jié)構(gòu)，這種剛性結(jié)構(gòu)也為包埋物質(zhì)提供了空間。當(dāng)向凝膠體系中加入銅離子，銅離子便會(huì)識(shí)別由底物鏈和脫氧核酶形成的雜交結(jié)構(gòu)；底物鏈在銅離子作用下被切割，脫氧核酶/底物鏈之間的雜交也被破壞，水凝膠的三維結(jié)構(gòu)也隨之消失，整個(gè)體系又從凝膠狀變?yōu)槿芤簯B(tài)。這種狀態(tài)的改變是可以通過指示劑的加入直接通過肉眼就可以觀察。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明可對(duì)水樣中銅離子含量留進(jìn)行定性及半定量檢測(cè)，本發(fā)明應(yīng)用于銅離子檢測(cè)的傳感器具有操作簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，非常適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和試驗(yàn)室對(duì)批量樣品粗篩。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 基于脫氧核酶-水凝膠的銅離子傳感器的制備方法 1、丙烯酸亞磷酰胺單體的合成
丙烯酸亞磷酰胺單體的合成分為三個(gè)步驟1)將6-氨基-1-己醇(lg，8，53mmol)，三乙胺(2. 36mL, 17mmol)加入IOOmL 二氯甲烷中冰浴，在無水無氧條件下逐滴加入甲基丙烯酰氯(2. 67g，2. 55mmol)，之后整個(gè)體系在室溫條件下攪拌反應(yīng)2小時(shí)。2)之后將溶劑旋干，向產(chǎn)物中加入IOmL乙醇和15%Na0H (4mL)將產(chǎn)物選擇性水解成6-異氰酸根合己基-甲基丙烯酰氯。將6-異氰酸根合己基-甲基丙烯酰氯用乙酸乙酯在硅膠柱分離之后進(jìn)行下一步反應(yīng)。3)將純化后的6-異氰酸根合己基-甲基丙烯酰氯(0. 50g，2. 70mmol)溶于IOmL 無水二氯甲烷中，在0° C條件下逐滴加入N，N-二異丙基乙胺(DIPEA，0.98g，7. 5mmol)，再逐滴加入2-氰乙基N，N- 二異丙基氯代亞磷酰胺(0. 87ml, 3. 25mmol),在冰浴上反應(yīng)2小時(shí)。將溶劑旋干后，將產(chǎn)物用乙酸乙酯環(huán)己烷三乙胺40:60:3的洗脫液在硅膠柱上洗脫。得到的終產(chǎn)物為無色油狀液體。終產(chǎn)物的核磁表征數(shù)據(jù)如下1H NMR (CDC13) 5 5. 92 (br, 1H)，5.63 (m, 1H)，5. 27 (m. 1H)，3.86-3. 72 (m, 2H)，3.66-3.49 (m, 4H)， 3. 30-3. 23 (m, 2H)，2. 61 (t, 2H)，1. 92 (m, 3H)，1. 58-1. 50 (m, 4H) 1.37—1.32 (m, 4H) 1. 17-1. 13 (m, 12H). 13C NMR (CDC13) δ 168.6, 140.4，119.3，118.0，63.8, 63. 6，58. 6，58. 3，43. 2，43. 1，39. 8，31. 3，29. 7，26. 8，25. 8，24. 9，24. 8，24. 7， 19. 0. 31Ρ (CDC13) δ 148.
2、甲基丙烯基團(tuán)修飾的底物鏈和脫氧核酶的合成與純化
5'端標(biāo)記的底物鏈和脫氧核酶用普通CPG作為固相載體，使用DNA單體在DNA合成儀上從3'端開始合成，最后在5'端修飾上前節(jié)中合成的丙烯酸亞磷酰胺單體。具體合成的序列見表3. 3。合成結(jié)束后，將上述CPG轉(zhuǎn)移至2ml潔凈滅菌的Eppendorf管中，加入0. 5 mL 25 %的氨水在65°C下氨解8 hr，使DNA從CPG上切割下來。氨解完畢取上清液進(jìn)行酒精沉淀，加入0. 1倍體積的3M NaCl和3倍體積的乙醇在-20° C冰箱中靜置20min，將得到的沉淀產(chǎn)物在HOOOrpm條件下去除上清，再將沉淀溶于0. IM的醋酸三乙胺溶液中，用 0. 22 μ m濾膜過濾。用高效液相色譜儀進(jìn)行純化；
3、底物鏈和脫氧核酶與丙烯酰胺的聚合
將修飾好的底物鏈和脫氧核酶(DNAzyme )分別溶解到含4%丙烯酰胺單體的50mM HEPES (3M NaCl，pH7.0)緩沖溶液中，DNA的終濃度為ImM。抽真空lOmin，再向體系中加入終體積1. 4%的10%過硫酸銨(0. 05g溶于0. 5mL)和終體積1. 4%的5%四甲基乙二胺(25 μ L 溶于0. 5mL)中，再次抽真空lOmin。此時(shí)底物鏈和脫氧核酶分別與丙烯酰胺單體聚合形成線性高分子鏈；
4、金納米的修飾
金納米的修飾高鹽體系和丙烯酰胺單體中的自由基能讓金納米團(tuán)聚，因此需要對(duì)金納米進(jìn)行封閉保護(hù)。保護(hù)方法如下取1.5mL合成好的金納米顆粒于1.5mL離心管中，再向管中加如質(zhì)量體積比為1.5%的牛血清蛋白(BSA)。金納米和BSA孵育2-3小時(shí)之后， HOOOrpm離心，去除上清液，將下層物質(zhì)重新溶于水中就得到保護(hù)的金納米粒子；
5、脫氧核酶水凝膠的制備
將兩條聚合好的DNA聚丙烯酰胺(10 μ L)分別加入1/10體積的BSA封閉的金納米顆粒(1 μ L)，振蕩混勻后，再將兩條聚合鏈混合，將混合后的溶液置于60° C干浴器中IOmin 后自然冷卻至室溫，就得到包裹金納米顆粒的脫氧核酶水凝膠。
實(shí)施例2 應(yīng)用脫氧核酶水凝膠生物傳感器檢測(cè)水樣中含有銅離子
IOOyL待測(cè)水樣用移液器加入脫氧核酶水凝膠生物傳感器上部的緩沖液層，置于 37°C干浴器中，用吸管輕輕吸打緩沖液層，使緩沖液與加入的待測(cè)水樣均勻混合。于37°C干浴器中放置1. 5小時(shí)，并用肉眼觀察體系中下層酒紅色的水凝膠是否逐漸擴(kuò)散開來。若下層酒紅色水凝膠均勻擴(kuò)散至上層緩沖液體系，則該水樣中含有銅離子。若脫氧核酶水凝膠可視化檢測(cè)傳感器中上下次酒紅色水凝膠不擴(kuò)散，則該水樣中沒含有銅離子。實(shí)施例3 應(yīng)用脫氧核酶水凝膠生物傳感器半定量檢測(cè)水樣中含有銅離子的濃度
同時(shí)將100 μ L待測(cè)水樣和100 μ L標(biāo)準(zhǔn)銅離子水溶液(濃度要求小于1000 μ Μ)于分別用移液器加入兩個(gè)脫氧核酶水凝膠生物傳感器上部的緩沖液層，置于37°c干浴器中，用吸管輕輕吸打緩沖液層，使緩沖液與加入的待測(cè)水樣均勻混合。于37°C干浴器中放置1. 5小時(shí)，并用肉眼觀察體系中下層酒紅色的水凝膠擴(kuò)散程度，若加入待測(cè)水樣的傳感器中的水凝膠擴(kuò)散瓦解程度大，則該水樣中的銅離子的含量高于標(biāo)準(zhǔn)銅離子水溶液的含量，否則其銅離子含量則低于標(biāo)準(zhǔn)銅離子水溶液的含量。實(shí)施例4 應(yīng)用脫氧核酶水凝膠生物傳感器檢測(cè)其他金屬離子的響應(yīng)
為了考察其他金屬離子對(duì)脫氧核酶水凝膠是否有響應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)選擇Cu2+，Na+, K+, Mg2+，Ca2+，F(xiàn)e3+, Hg2+，Pb2+, Cd2+作為考察對(duì)象，并且這些離子濃度10倍于銅離子。實(shí)驗(yàn)中可得出，在所有考察的金屬中，只有銅離子能將脫氧核酶水凝膠瓦解，而其他的金屬離子對(duì)銅離子的脫氧核酶體系沒有響應(yīng)。這充分證明該體系能夠不受其他體系的干擾，顯示了其能在復(fù)雜體系中應(yīng)用的潛力?？梢岳斫猓芏嗉?xì)節(jié)的變化是可能的，但這并不因此違背本發(fā)明的范圍和精神，任何所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員對(duì)其所做的適當(dāng)變化，皆應(yīng)視為不脫離本發(fā)明專利的范
權(quán)利要求
1.一種基于脫氧核酶水凝膠的銅離子檢測(cè)傳感器，其特征在于包括脫氧核酶水凝膠， 所述脫氧核酶水凝膠是由甲基丙烯基團(tuán)修飾的底物鏈和甲基丙烯基團(tuán)修飾的脫氧核酶通過堿基互補(bǔ)配對(duì)交聯(lián)形成的三維網(wǎng)狀的水凝膠，且在水凝膠上包裹有金納米顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于脫氧核酶水凝膠的銅離子檢測(cè)傳感器，其特征在于所述脫氧核酶水凝膠的制備方法包括如下步驟1)合成丙烯酸亞磷酰胺單體丙烯酸亞磷酰胺單體的合成分為三個(gè)步驟a)將Ig 6-氨基-1-己醇，2. 36mL三乙胺加入IOOmL 二氯甲烷中冰浴，在無水無氧條件下逐滴加入2. 67g甲基丙烯酰氯，在室溫條件下攪拌反應(yīng)2小時(shí)；b)將溶劑旋干，向產(chǎn)物中加入IOmL乙醇和15%Na0H，將產(chǎn)物選擇性水解成6-異氰酸根合己基-甲基丙烯酰氯，再用硅膠柱分離純化；c)將0. 50g純化后的6-異氰酸根合己基-甲基丙烯酰氯溶于IOmL無水二氯甲烷中，在0° C條件下逐滴加入0. 98g N, N- 二異丙基乙胺，再逐滴加入0. 87ml 2-氰乙基N，N- 二異丙基氯代亞磷酰胺，在冰浴上反應(yīng)2小時(shí)；將溶劑旋干后，將產(chǎn)物用乙酸乙酯環(huán)己烷三乙胺40:60:3的洗脫液在硅膠柱上洗脫，得到的終產(chǎn)物為無色油狀液體；2)甲基丙烯基團(tuán)修飾的底物鏈和脫氧核酶的合成與純化5'端標(biāo)記的底物鏈和脫氧核酶用CPG作為固相載體，使用DNA單體在DNA合成儀上從 3'端開始合成，最后在5'端修飾步驟1)中合成的丙烯酸亞磷酰胺單體；合成結(jié)束后，將上述CPG轉(zhuǎn)移至anl Eppendorf管中，加入0. 5 mL 25 %的氨水在65°C下氨解8 hr，使DNA 從CPG上切割下來；氨解完畢取上清液進(jìn)行酒精沉淀，加入0. 1倍體積的3M NaCl和3倍體積的乙醇在-20° C冰箱中靜置20min，將得到的沉淀去除上層清液，再將沉淀溶于0. IM的醋酸三乙胺溶液中，用0. 22 μ m的濾膜過濾，再用高效液相色譜儀進(jìn)行純化；3)底物鏈和脫氧核酶分別與丙烯酰胺單體聚合形成線性高分子鏈將經(jīng)過步驟2)經(jīng)甲基丙烯基團(tuán)修飾的底物鏈和經(jīng)甲基丙烯基團(tuán)修飾的脫氧核酶分別溶解到含4%丙烯酰胺單體的50mM HEPES緩沖溶液中，抽真空lOmin，再向體系中加入終體積1. 4%的10%過硫酸銨和終體積為1. 4%的5%四甲基乙二胺中，再次抽真空IOmin ；底物鏈和脫氧核酶分別與丙烯酰胺單體聚合形成線性高分子鏈；4)金納米的修飾取1. 5mL合成好的金納米顆粒于1. 5mL離心管中，再向管中加入質(zhì)量體積比為1. 5%的牛血清蛋白；金納米和牛血清蛋白孵育2-3小時(shí)之后，離心并去除上清液，將下層重新溶于水中就得到保護(hù)的金納米粒子；5)脫氧核酶水凝膠的制備將10 μ L兩條聚合好的DNA聚丙烯酰胺加入1/10體積的牛血清蛋白封閉的金納米顆粒，振蕩混勻后，再將兩條聚合鏈混合，將混合后的溶液置于60° C干浴器中IOmin后自然冷卻至室溫，得到包裹金納米顆粒的脫氧核酶水凝膠。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于脫氧核酶水凝膠的銅離子檢測(cè)傳感器，其特征在于它用于測(cè)定水樣中銅離子殘留的測(cè)定方法為1)將 οομL待測(cè)水樣用移液器加入脫氧核酶水凝膠緩沖體系上部的緩沖液層，置于 37°C干浴器中，用吸管輕輕吸打緩沖液層，使緩沖液與加入的待測(cè)水樣均勻混合；2)將加入了待測(cè)水樣的脫氧核酶水凝膠緩沖體系于37°C干浴器中放置1.5小時(shí)，并用肉眼觀察體系中下層酒紅色的水凝膠是否逐漸擴(kuò)散開來；3)目測(cè)結(jié)果，陰性樣品在脫氧核酶水凝膠檢測(cè)傳感器中，上下次酒紅色水凝膠不擴(kuò)散， 陽性樣品下層酒紅色水凝膠均勻擴(kuò)散至上層緩沖液體系；4)銅離子檢測(cè)傳感器中加入IOOyL已知道濃度的銅離子水溶液，銅離子濃度小于 1000 μ M，重復(fù)步驟1)和步驟2)；5)步驟2)和步驟4)中的脫氧核酶水凝膠檢測(cè)傳感器下層酒紅色水凝膠的擴(kuò)散瓦解程度，擴(kuò)散瓦解程度大的樣品銅離子的含量高。
全文摘要
本發(fā)明公開一種基于脫氧核酶水凝膠的銅離子檢測(cè)傳感器，其特征在于包括脫氧核酶水凝膠，所述脫氧核酶水凝膠是由甲基丙烯基團(tuán)修飾的底物鏈和甲基丙烯基團(tuán)修飾的脫氧核酶通過堿基互補(bǔ)配對(duì)交聯(lián)形成的三維網(wǎng)狀的水凝膠，并且在水凝膠上包裹有金納米顆粒。本發(fā)明同時(shí)公開基于脫氧核酶水凝膠的銅離子檢測(cè)傳感器中脫氧核酶水凝膠的制備方法，以及傳感器定性及半定量檢測(cè)水樣中銅離子含量的方法。本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)銅離子的快速檢測(cè)，在不需要昂貴復(fù)雜儀器設(shè)備的同時(shí)還具有很高的選擇性、測(cè)定速度快等優(yōu)點(diǎn)，非常適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和試驗(yàn)室對(duì)批量樣品粗篩。
文檔編號(hào)G01N33/00GK102507877SQ201110362558
公開日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月16日
發(fā)明者吳敏, 周昱, 張志剛, 徐敦明, 方恩華, 楊朝勇 申請(qǐng)人:廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心