專利名稱：一種加壓毛細(xì)管電色譜檢測水產(chǎn)品中三聚氰胺的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明食品安全-獸藥殘留領(lǐng)域，具體是ー種采用毛細(xì)管電色譜儀檢測水產(chǎn)品中三聚氰胺的分析方法。
背景技術(shù)：
三聚氰胺(Melamine)簡稱三胺，是ー種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，主要用途是作為生產(chǎn)三聚氰胺甲醛樹脂。由于其氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)66%左右，ー些不法廠商在飼料中大量添加，以提高產(chǎn)品中粗蛋白含量，水生生物食用含三聚氰胺的飼料后可能會在體內(nèi)富集，嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的健康和利益。2008年9月“三鹿奶粉事件”引起了人們對三聚氰胺的高 度關(guān)注。但目前發(fā)布的方法只有原料乳和乳制品中三聚氰胺檢測方法和飼料中三聚氰胺的檢測方法，關(guān)于水產(chǎn)品中三聚氰胺檢測的方法還未見報(bào)道。因此，建立ー種快速、準(zhǔn)確檢測水產(chǎn)品組織中三聚氰胺殘留的方法非常必要。目前用于三聚氰胺的檢測方法有高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法等。液相色譜法的靈敏度較低，且分析時間較長，氣質(zhì)、液質(zhì)聯(lián)用儀雖然檢測靈敏度和分辨率很高，但一般實(shí)驗(yàn)室很難配置這樣的儀器。加壓毛細(xì)管電色譜(pCEC)是近幾年來興起的ー種微分離技術(shù)，它結(jié)合了電泳的高效性和高效液相色譜的保留機(jī)制，通過在填有HPLC填料的毛細(xì)管色譜柱的兩端施加高壓，提高了樣品的分離能力和效率，使以前需很長時間才能出現(xiàn)的峰現(xiàn)在只需很短時間就可出現(xiàn)，并且試劑和樣品的消耗量減少，近幾年開始也用于獸藥殘留的分離。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決技術(shù)問題是提供一種加壓毛細(xì)管電色譜儀檢測水產(chǎn)品中三聚氰胺的方法，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的特點(diǎn)。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種加壓毛細(xì)管電色譜儀檢測水產(chǎn)品中三聚氰胺的方法，其特征在于包括以下步驟I)樣品制備將水廣品肌肉組織樣品到碎后均質(zhì)，冷凍保存；2)樣品預(yù)處理將樣品經(jīng)體積比為I. 5 2. 5 I的質(zhì)量濃度為0. 8 I. 2%三氯こ酸和こ腈混合液離心提取，MCX固相萃取柱凈化，再經(jīng)0. 20 0. 24 m濾膜過濾后供毛細(xì)管電色譜測定用；3)配制三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液；4)采用加壓毛細(xì)管電色譜進(jìn)行分析以反相鍵和C18為填料的毛細(xì)管電色譜柱作為檢測柱；流動相采用9 llmmol/L，pH = 2. 5 3. 5的庚烷磺酸鈉-檸檬酸溶液與こ腈的混合液，其體積比為80 70 20 30 ;所加電壓為-9 -Ilkv，柱壓為9.0 9. 2MP，柱溫為常溫，流動相的流速40 60 ii L/min ;進(jìn)樣量0. 9 I. I y L的エ藝條件下，用紫外檢測器在波長240nm處進(jìn)行檢測，同時繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；5)將樣品經(jīng)檢測分析后根據(jù)其保留時間進(jìn)行定量分析，利用外標(biāo)法根據(jù)其峰面積進(jìn)行定量分析。作為優(yōu)選，所述步驟2)中的三氯こ酸的質(zhì)量濃度為1%，混合液中三氯こ酸與こ腈的體積比為2 I。作為改進(jìn)，所述步驟2)中的離心提取的具體過程為準(zhǔn)確稱取2±0. Olg均質(zhì)樣品置于50mL離心管中，加入I %的三氯こ酸10mL，こ腈5mL，用渦旋混合器充分混勻I 2min，4000 6000r/min離心8 12min,收集上清液,再向原離心管中加入15mL體積比為2 : I的I %三氯こ酸和こ腈混合液重復(fù)提取一次，合并兩次上清液。作為改進(jìn),所述步驟2)的MCX固相萃取柱凈化的具體過程為用2 4mL甲醇活化MCX固相萃取小柱，再用4 6mL去離子水沖洗小柱，轉(zhuǎn)移過多的甲醇，然后將提取液分次轉(zhuǎn)移上柱，保持I. 5 2. 5mL/min的流速過柱，待上樣液全部完成后，再依次用4 6mL水、2 4mL甲醇淋洗近干，最后用5 7mL4 6 (v體積)％氨化甲醇溶液洗脫固相萃取小柱，分步洗脫，收集濾液并用氮吹儀吹干，用0. 9 I. ImL流動相定容。 再改進(jìn)，所述步驟3)的配制三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的步驟為稱取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品10. 0mg±0. Olg，用50%甲醇水溶液溶解并定容于IOOml容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為IOOmg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。再改進(jìn)，所述步驟4)中庚烷磺酸鈉-檸檬酸溶液的濃度為10mmol/L，pH = 3，流動相的配制過程為取こ腈、重蒸水、20mmol/L庚烷磺酸鈉-檸檬酸溶液按體積比為25 : 25 : 50的比列配成流動相，超聲波脫氣20 40min。進(jìn)ー步改進(jìn)，所述三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液在檢測前需用流動相稀釋成0. 2 g/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。優(yōu)選，所述毛細(xì)管電色譜柱選用規(guī)格為EP-100-20/45-3-C18，內(nèi)徑lOOym，有效柱長20cm,填料粒徑3 u m ODS。最后，所述步驟4)的電壓優(yōu)選為-10kv，柱壓優(yōu)選為9. 1MP，流動相的流速50ii L/min ;進(jìn)樣量1. 0 iiし與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于采用三氯こ酸和こ腈混合液作為提取劑，可以有效沉淀魚肉組織中的蛋白質(zhì)和去除脂肪，采用固相萃取對樣品進(jìn)行預(yù)處理，可以有效減少雜質(zhì)的含量和基質(zhì)干擾；采用庚烷磺酸鈉-檸檬酸與こ腈的混合液為流動相，由于三聚氰胺具有較強(qiáng)的極性，在反向色譜柱上不易保留，故采用離子對試劑與三聚氰胺形成離子對以延長其在色譜柱上的保留；庚烷磺酸鈉-檸檬酸溶液具有一定的PH緩沖能力，使pH不易變化，從而保證了流動相的PH穩(wěn)定性；采用毛細(xì)管電色譜進(jìn)行分析檢測，有機(jī)試劑消耗少，通過施加外電壓，可以三聚氰胺的保留時間，并且靈敏度得到提高，本發(fā)明的分析方法高效、準(zhǔn)確，有機(jī)試劑消耗少，有較高的靈敏度，可用于水產(chǎn)品中三聚氰胺的檢測。


圖I是加-IOkV電壓時三聚氰胺藥物標(biāo)準(zhǔn)品的毛細(xì)管電色譜圖；圖2是不加電壓的uHPLC圖；圖3是市售魚肉樣品的檢測電色譜圖。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)ー步詳細(xì)描述。
本實(shí)施例以秋刀魚為例，采用毛細(xì)管電色譜儀檢測秋刀魚中殘留的三聚氰胺，具體步驟為I、樣品制備將秋刀魚肌肉組織樣品，用剪刀剪碎后均質(zhì)，冷凍保存；2、樣品預(yù)處理(I)提取將樣品解凍，準(zhǔn)確稱取2±0. Olg(精確至0. Olg)均質(zhì)樣品置于50mL離心管中，加入I %的三氯こ酸IOmL,こ腈5mL,用潤旋混合器充分混勻I 2min, 5000r/min離心lOmin，收集上清液，再向原離心管中加入15mL體積比為2 I的1%三氯こ酸和こ腈
混合液重復(fù)提取一次，合并兩次上清液。(2)凈化用3mL甲醇活化MCX固相萃取小柱，再用5mL去離子水沖洗小柱，轉(zhuǎn)移過多的甲醇，然后將提取液分次轉(zhuǎn)移上柱，待上樣液全部完成后，再依次用5mL水、3mL甲醇淋洗近干，最后用6mL5%氨化甲醇溶液洗脫固相萃取小柱，分步洗脫，收集濾液并用氮吹儀吹干，用ImL流動相定容。經(jīng)0.22i!m濾膜過濾后，供毛細(xì)管電色譜測定。3、配制三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液；稱取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品10. 0mg±0. Olg，用50%甲醇水溶液溶解并定容于IOOml容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為100mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，避光冷藏保存。臨用前用流動相稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作液。4、流動相配制及色譜條件取こ腈、重蒸水、20mmol/L庚烷磺酸鈉-檸檬酸溶液按體積比為25 25 50的比列配成流動相，超聲波脫氣30min后備用。所用色譜條件(I)色譜柱選用規(guī)格EP-100-20/45-3-C18，內(nèi)徑100 y m，有效柱長20cm，填料粒徑3 u mODS 柱；(2)紫外檢測波長240nm ；(3)流動相こ腈庚烷磺酸鈉-檸檬酸溶液(10mmol/L,pH 3) = 25 75 (V/V)，(4)流速50 V- L/min ;進(jìn)樣量1 ii L ;(5)柱壓電壓-10kV，柱壓為9. IMP,柱溫為常溫。5、工作曲線和檢出限用流動相稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液為0. 2 5 y g/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按試驗(yàn)條件進(jìn)行檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y = 686. 4X+1. 8539，相關(guān)系數(shù)R2 = 0. 9993，結(jié)果表明三聚氰胺在0. 2 5 ii g/mL的濃度范圍內(nèi)其峰面積(Y)與三聚氰胺濃度(X)呈良好的線性關(guān)系。按3倍信噪比得出方法檢出限為0. 2 y g/mL。 6、回收率和精密度試驗(yàn)分別選取秋刀魚樣品，添加三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察方法的回收率。每ー添加濃度重復(fù)測定6次，考察方法的精密度，結(jié)果見表I.表I樣品加標(biāo)平均回收率(n = 6)
權(quán)利要求
1.一種加壓毛細(xì)管電色譜儀檢測水產(chǎn)品中三聚氰胺的方法，其特征在于包括以下步驟 1)樣品制備將水產(chǎn)品肌肉組織樣品剪碎后均質(zhì)，冷凍保存； 2)樣品預(yù)處理將樣品經(jīng)體積比為I.5 2. 5 I的質(zhì)量濃度為0. 8 I. 2%三氯こ酸和こ腈混合液離心提取，MCX固相萃取柱凈化，再經(jīng)0. 20 0. 24 m濾膜過濾后供毛細(xì)管電色譜測定用； 3)配制三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液； 4)采用加壓毛細(xì)管電色譜進(jìn)行分析以反相鍵和C18為填料的毛細(xì)管電色譜柱作為檢測柱；流動相采用9 llmmol/L，pH = 2. 5 3. 5的庚烷磺酸鈉-檸檬酸溶液與こ腈的混合液，其體積比為80 70 20 30 ;所加電壓為-9 -Ilkv，柱壓為9.0 9. 2MP，柱溫為常溫，流動相的流速40 60 ii L/min ;進(jìn)樣量0. 9 I. I y L的エ藝條件下，用紫外檢測器在波長240nm處進(jìn)行檢測，同時繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； 5)將樣品經(jīng)檢測分析后根據(jù)其保留時間進(jìn)行定量分析，利用外標(biāo)法根據(jù)其峰面積進(jìn)行定量分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟2)中的三氯こ酸的質(zhì)量濃度為1%，混合液中三氯こ酸與こ腈的體積比為2 :1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟2)中的離心提取的具體過程為準(zhǔn)確稱取2±0. Olg均質(zhì)樣品置于50mL離心管中，加入1%的三氯こ酸10mL，こ腈5mL，用渦旋混合器充分混勻I 2min,4000 6000r/min離心8 12min,收集上清液,再向原離心管中加入15mL體積比為2 I的1%三氯こ酸和こ腈混合液重復(fù)提取一次，合并兩次上清液。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟2)的MCX固相萃取柱浄化的具體過程為用2 4mL甲醇活化MCX固相萃取小柱，再用4 6mL去離子水沖洗小柱，轉(zhuǎn)移過多的甲醇，然后將提取液分次轉(zhuǎn)移上柱，保持I. 5 2. 5mL/min的流速過柱，待上樣液全部完成后，再依次用4 6mL水、2 4mL甲醇淋洗近干,最后用5 7mL4 6 (v) %氨化甲醇溶液洗脫固相萃取小柱，分步洗脫，收集濾液并用氮吹儀吹干，用0. 9 I. ImL流動相定容。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟3)的配制三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的步驟為稱取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品10. 0mg±0. Olg，用50%甲醇水溶液溶解并定容于IOOml容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為100mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟4)中庚烷磺酸鈉-檸檬酸溶液的濃度為10mmol/L，pH= 3，流動相的配制過程為取こ腈、重蒸水、20mmol/L庚烷磺酸鈉-檸檬酸溶液按體積比為25 25 50的比列配成流動相，超聲波脫氣20 40min。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液在檢測前需用流動相稀釋成0. 2 5 ii g/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述毛細(xì)管電色譜柱選用規(guī)格為EP-100-20/45-3-C18,內(nèi)徑 100 u m,有效柱長 20cm，填料粒徑 3 y m ODS。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟4)的電壓為-10kv，柱壓為9.1MP，流動相的流速50uL/min ;進(jìn)樣量1.0uLo
全文摘要
本發(fā)明涉及一種加壓毛細(xì)管電色譜儀檢測水產(chǎn)品中三聚氰胺的方法，步驟為1)樣品制備；2)樣品預(yù)處理將樣品經(jīng)體積比為1.5～2.5∶1的質(zhì)量濃度為0.8～1.2％三氯乙酸和乙腈混合液離心提取，MCX固相萃取柱凈化，再經(jīng)0.20～0.24μm濾膜過濾后供毛細(xì)管電色譜測定用；3)配制三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液；4)采用加壓毛細(xì)管電色譜進(jìn)行分析；5)將樣品經(jīng)檢測分析后根據(jù)其保留時間進(jìn)行定量分析，利用外標(biāo)法根據(jù)其峰面積進(jìn)行定量分析。本發(fā)明的分析方法高效、準(zhǔn)確、靈敏度高，可以滿足日常水產(chǎn)品三聚氰胺藥物檢測的需求。
文檔編號G01N30/88GK102650627SQ20111036636
公開日2012年8月29日 申請日期2011年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月17日
發(fā)明者劉在美, 曹國洲, 朱曉艷, 楊文潮, 肖道清, 董潔瑩, 鄭琳, 陳少鴻, 陳建國 申請人:寧波檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院