專利名稱：甘薯上馬鈴薯y病毒屬病毒的血清學(xué)檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及甘薯上的馬鈴薯Y病毒屬病毒的血清學(xué)檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
甘薯羽狀斑駁病毒potato feathery mottle 口>狀，SPFMV)、甘薯潛隱病 : {Sweet potato latent virus, SPLV)^1^ G ^ {Sweet potato virus SPVG)禾口甘薯脈花葉病毒(Sfveet potato vein mosaic virus, SPVMV)是危害甘薯的主要病毒，4種病毒都屬于馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)A種病毒或與其他病毒常?；旌锨秩靖适?，造成甘薯產(chǎn)量降低，品質(zhì)變劣和種性退化，對(duì)甘薯生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害。對(duì)甘薯病毒病目前尚無特別有效的化學(xué)防治方法，利用莖尖分生組織培養(yǎng)，培育脫毒甘薯是防治病毒病最有效的方法。 在脫毒甘薯的培養(yǎng)和脫毒種薯(苗)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化過程中，病毒的快速檢測(cè)技術(shù)是保證脫毒種薯質(zhì)量以及實(shí)現(xiàn)脫毒種薯產(chǎn)業(yè)化非常關(guān)鍵的技術(shù)。只有利用快速、高效的病毒檢測(cè)技術(shù)， 篩選出真正無毒的試管苗并及時(shí)淘汰不同級(jí)別的感病種苗，才能使真正的脫毒種薯用于生產(chǎn)，確保脫毒種薯的增產(chǎn)效果，進(jìn)而加快脫毒種薯的推廣進(jìn)程。因此，建立甘薯病毒高效的檢測(cè)技術(shù)是培育脫毒甘薯的前提和基礎(chǔ)。目前用于甘薯病毒檢測(cè)的常用方法是酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)技術(shù)，以及在此基礎(chǔ)上建立的硝酸纖維素膜酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(NCM-ELISA)技術(shù)。由于侵染甘薯的PoiJ^ir皿^病毒種類較多，當(dāng)不需要確定病毒種類，只需要確定樣品中是否含有病毒時(shí)(譬如對(duì)甘薯脫毒莖尖苗進(jìn)行檢測(cè))，利用上述方法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)需要對(duì)各種病毒逐一進(jìn)行檢測(cè)，往往費(fèi)時(shí)費(fèi)力，造成浪費(fèi)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題克服背景技術(shù)中的問題，提供一種簡(jiǎn)便、高效和低成本的檢測(cè)甘薯上四種馬鈴薯Y病毒屬病毒的試劑盒；
另外還提供了這種試劑盒的檢測(cè)方法。本發(fā)明的技術(shù)方案
甘薯上馬鈴薯Y病毒屬病毒的血清學(xué)檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒分為上、下兩層，上、下兩層之間設(shè)置有隔板，上層還設(shè)有試劑瓶插孔，插孔中放置有試劑瓶，下層為可推拉的抽屜，抽屜中放置有硝酸纖維素膜；不同試劑瓶中分別裝有馬鈴薯Y病毒屬病毒的特異性抗體、馬鈴薯Y病毒屬病毒的混合抗體以及堿性磷酸脂酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、氯化硝基四氮唑藍(lán)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽和1Tris-HCl溶液。所述試劑瓶為九個(gè)，其中一號(hào)試劑瓶裝有甘薯羽狀斑駁病毒SPFMV抗體，二號(hào)試劑瓶裝有甘薯潛隱病毒SPLV抗體，三號(hào)試劑瓶裝有甘薯G病毒SPVG抗體，四號(hào)試劑瓶裝有甘薯脈花葉病毒SPVMV抗體，五號(hào)試劑瓶裝有上述四種病毒的混合抗體；六號(hào)試劑瓶裝有工作濃度為1 :1000倍的堿性磷酸脂酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，七號(hào)試劑瓶裝有濃度為50mg/ml 的氯化硝基四氮唑藍(lán)NBT，八號(hào)試劑瓶裝有濃度50mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽BCIP，九號(hào)試劑瓶9裝有pH為7. 5的2M Tris-HCl溶液。所述四種馬鈴薯Y病毒屬病毒的特異性抗體均是利用大腸桿菌中表達(dá)的病毒外殼蛋白，通過純化蛋白、免疫家兔的方法制備獲得，所述四種馬鈴薯Y病毒屬病毒的特異性抗體和混合抗體的效價(jià)均為4096倍，工作濃度為1 :1000倍。甘薯上馬鈴薯Y病毒屬病毒的血清學(xué)檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，包括以下步驟
(1)準(zhǔn)備硝酸纖維素NC膜剪取合適大小的NC膜，用鉛筆在膜上做好標(biāo)記，以便于點(diǎn)
樣；
(2)樣品處理將0.Ig甘薯樣品于液氮中速凍，并研磨成粉末，加入ΙΟΟμΙ抽提緩沖液， 繼續(xù)研磨至徹底裂解并轉(zhuǎn)移到離心管中，5000rpm離心5min ；
(3)點(diǎn)樣將NC膜置于TBS中浸泡1min，用濾紙吸去膜表面的液體，取上清液5μ1點(diǎn)于膜上，室溫晾干；
(4)封閉加入IOml封閉液于培養(yǎng)皿中，將膜浸入其中，室溫孵育60min ；
(5)洗膜棄去封閉液，用TBS洗膜一次；
(6)加一抗將NC膜置于用抗體緩沖液稀釋至工作濃度的抗體中，室溫下以50rpm/min 的速度振蕩，孵育過夜；
(7)洗膜棄一抗，用T-TBS溶液洗NC膜3-4次，3min/次；
(8)加二抗用濾紙吸去NC膜上多余的溶液，然后將NC膜置于用抗體緩沖液稀釋至工作濃度的酶標(biāo)抗體中，室溫下以50rpm/min的速度振蕩，孵育1 h ；
(9)洗膜棄二抗，用T-TBS溶液洗NC膜3-4次，3min/次；
(10)顯色將NC膜置于NBT和BCIP的底物溶液中，每5ml底物緩沖液先加入33μ1 ΝΒΤ，再加入16. 5μ1 BCIP，室溫下以50 rpm/min的速度搖床振蕩，避光顯色5_30 min ；
(11)終止反應(yīng)將NC膜從底物溶液中取出，用蒸餾水洗NC膜3次，3-4min/次；
(12)陽性判斷將NC膜晾干后觀察顏色反應(yīng)，比較檢測(cè)樣品與正負(fù)對(duì)照的顏色反應(yīng)， 出現(xiàn)紫色的樣品為陽性。所述抽提緩沖液為TBS和0. 2%亞硫酸鈉的混合液。所述封閉液的成分為TBSJ%脫脂奶粉和洲聚乙二醇辛基苯基醚的混合物。 所述工作濃度的抗體為SPFMV、SPLV, SPVG, SPVMV抗體或混合抗體，抗體工作濃度均為1 :1000倍；所述酶標(biāo)抗體為堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，酶標(biāo)抗體的工作濃度為1 :1000倍。本發(fā)明的有益效果
(1)本發(fā)明提供了一種檢測(cè)甘薯上病毒的簡(jiǎn)便、高效和低成本的試劑盒。 檢測(cè)樣品時(shí)，當(dāng)只需要確定樣品中是否含有PoiJ^ir皿M病毒時(shí)使用試劑盒中裝有混合抗體的試劑瓶進(jìn)行檢測(cè)；當(dāng)需要確定含有某種特定病毒時(shí)，再使用其他試劑瓶中的特異性抗體，檢測(cè)方便，節(jié)省了檢測(cè)成本。(2)本發(fā)明的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、直觀，只需要將NC膜晾干后觀察顏色反應(yīng)，比較檢測(cè)樣品與正負(fù)對(duì)照的顏色反應(yīng)，出現(xiàn)紫色顏色反應(yīng)的樣品為陽性，從而判斷出是否含有Potyviruses病毒，方便實(shí)用。
(3)本試劑盒可應(yīng)用于脫毒甘薯莖尖苗和各級(jí)種薯的檢測(cè)，通過對(duì)/^ij^irMM 病毒的快速高效檢測(cè)，可以確保脫毒甘薯的質(zhì)量和增產(chǎn)效果；也可對(duì)甘薯病毒的種類進(jìn)行特異性檢測(cè)，可應(yīng)用于甘薯種薯調(diào)運(yùn)以及病害調(diào)查等過程中。
(4)本試劑盒特別適用于甘薯脫毒莖尖苗的檢測(cè)，也可直接推廣到基層農(nóng)技單位開展病害普查和預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)，或用于脫毒甘薯種薯的質(zhì)量監(jiān)測(cè)，使真正的脫毒甘薯應(yīng)用于生產(chǎn)。


圖1 本發(fā)明的試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖；圖2 本發(fā)明的試劑盒對(duì)甘薯樣品檢測(cè)結(jié)果顯示圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、甘薯上馬鈴薯Y病毒屬病毒的血清學(xué)檢測(cè)試劑盒，參見圖1，圖中1為試劑盒上層，2為試劑瓶，3為試劑盒下層。
試劑盒中含有四種馬鈴薯Y病毒屬病毒的特異性抗體和一種混合抗體，所述的試劑盒分為上、下兩層，上、下兩層之間設(shè)置有隔板，上層還設(shè)有試劑瓶插孔，插孔中放置有試劑瓶，下層為可推拉的抽屜，抽屜中放置有硝酸纖維素膜；上層的試劑瓶為九個(gè)，分別為一號(hào)至九號(hào)試劑瓶，其中一號(hào)試劑瓶中的甘薯羽狀斑駁病毒SPFMV抗體，二號(hào)試劑瓶為甘薯潛隱病毒SPLV抗體，三號(hào)試劑瓶為甘薯G病毒SPVG抗體，四號(hào)試劑瓶為甘薯脈花葉病毒 SPVMV抗體，五號(hào)試劑瓶為上述四種病毒的混合抗體；六號(hào)試劑瓶為工作濃度為1 :1000倍的堿性磷酸脂酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗，七號(hào)試劑瓶為濃度為50mg/ml的氯化硝基四氮唑藍(lán)NBT，八號(hào)試劑瓶為濃度50mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽BCIP，九號(hào)試劑瓶 9 為 pH 為 7. 5 的 2M Tris-HCl 溶液。
SPFMV、SPLV、SPVG、SPVMV 4種病毒的抗體均是利用在大腸桿菌中表達(dá)的病毒外殼蛋白，通過純化蛋白，免疫家兔的方法制備獲得，4種病毒的抗體以及混合抗體的效價(jià)均為 4096倍，工作濃度為1 :1000倍。
用試劑盒檢測(cè)樣品時(shí)，當(dāng)只需要確定樣品中是否含有馬鈴薯Y病毒屬病毒時(shí)，使用混合抗體的五號(hào)試劑瓶進(jìn)行檢測(cè)；當(dāng)需要確定含有馬鈴薯Y病毒屬病毒的某種病毒時(shí)， 則使用一號(hào)至四號(hào)試劑瓶進(jìn)行檢測(cè)。
實(shí)施例2、甘薯上馬鈴薯Y病毒屬病毒的血清學(xué)檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，包括以下步驟1、緩沖液的配制(1)TBS 0. 02M Tris+0. 50M NaCl，ρΗ7·5 ；(2)抽提緩沖液TBS+0.2%亞硫酸鈉；(3)封閉液:TBS+2%脫脂奶粉 +2% triton X-100 ；(4)抗體緩沖液TBS+^)脫脂奶粉；(5)T-TBS :TBS+0. 05% Tween 20 ；(6)底物緩沖液0.IM Tris+ 0. IM NaCl+5mM MgCl2'6H20, pH=9. 5 ；其中M是指單位mol/L。
2、檢測(cè)步驟(1)準(zhǔn)備硝酸纖維素膜(NC膜):剪取合適大小的NC膜，用鉛筆在膜上做好標(biāo)記，以便于點(diǎn)樣。
(2)樣品處理將0. Ig甘薯樣品于液氮中速凍并研磨呈粉末，加入ΙΟΟμΙ抽提緩沖液(TBS+ 0. 2%亞硫酸鈉)繼續(xù)研磨至徹底裂解，并轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，5000rpm離心 5min。
(3)點(diǎn)樣將NC素膜于TBS中浸泡1 min，用濾紙吸去膜表面液體，取上清液5μ1 點(diǎn)于膜上，室溫晾干。
(4)封閉加入IOml封閉液(TBS+覬脫脂奶粉+2%triton X-100)于培養(yǎng)皿中，將 NC膜浸入其中，室溫孵育60 min。
(5)洗膜棄去封閉液，用TBS洗NC膜一次。
(6)加一抗(SPFMV、SPLV、SPVG、SPVMV 抗體或混合抗體)將NC膜置于用抗體緩沖液(TBS+洲脫脂奶粉)稀釋至工作濃度的抗體(SPFMV、SPLV、 SPVG、SPVMV抗體或混合抗體)中，室溫下振蕩(50rpm/min)孵育過夜，所有抗體的工作濃度均為1 :1000倍。
(7)洗膜棄一抗，用T-TBS溶液洗NC膜3-4次，3min/次。
(8)加二抗(堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗兔IgG)用濾紙吸去膜上多余的溶液，然后將NC膜置于用抗體緩沖液(TBS+洲脫脂奶粉)稀釋至工作濃度的酶標(biāo)抗體(堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗兔IgG)中，室溫下振蕩(50rpm/min)孵育1 h ；二抗的工作濃度為1 :1000倍。
(9)洗膜棄二抗，用T-TBS溶液洗NC膜3-4次，3min/次。
(10)顯色將NC膜置于NBT/BCIP底物溶液中，每5ml底物緩沖液先加入33μ NBT, 再加入16. 5μ1 BCIP室溫下?lián)u床振蕩(50 rpm/min)避光顯色5_30 min (必要時(shí)增加顯色時(shí)間)。
(11)終止反應(yīng)將NC膜從底物溶液中取出，用蒸餾水洗NC膜3次，3-4min/次。
(12)陽性判斷晾干后觀察顏色反應(yīng)，比較檢測(cè)樣品與正負(fù)對(duì)照的顏色反應(yīng)，出現(xiàn)紫色顏色反應(yīng)的樣品為陽性。
實(shí)施例3、甘薯上/^ij^irMM病毒血清學(xué)檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用利用本試劑盒，對(duì)采自田間的M份田間甘薯樣品進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)步驟按實(shí)施例2的步驟。一抗采用混合抗體抗血清(五號(hào)試劑瓶)。工作濃度為1 :1000倍。結(jié)果表明，M份甘薯樣品中有10份甘薯樣品呈陽性反應(yīng)(見圖2)，陽性率為41. 7%，說明這些甘薯樣品上普遍每板Potyviruses病毒。
圖2中，上排1、2、3、4、5、6、7、8，以及下排1、2為陽性樣品。
權(quán)利要求
1.甘薯上馬鈴薯Y病毒屬病毒的血清學(xué)檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒分為上、 下兩層，上、下兩層之間設(shè)置有隔板，上層還設(shè)有試劑瓶插孔，插孔中放置有試劑瓶，下層為可推拉的抽屜，抽屜中放置有硝酸纖維素膜；不同試劑瓶中分別裝有馬鈴薯Y病毒屬病毒的特異性抗體、馬鈴薯Y病毒屬病毒的混合抗體以及堿性磷酸脂酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、氯化硝基四氮唑藍(lán)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽和Tris-HCl溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的血清學(xué)檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑瓶為九個(gè)，其中一號(hào)試劑瓶裝有甘薯羽狀斑駁病毒SPFMV抗體，二號(hào)試劑瓶裝有甘薯潛隱病毒SPLV抗體，三號(hào)試劑瓶裝有甘薯G病毒SPVG抗體，四號(hào)試劑瓶裝有甘薯脈花葉病毒SPVMV抗體，五號(hào)試劑瓶裝有上述四種病毒的混合抗體；六號(hào)試劑瓶裝有工作濃度為1 :1000倍的堿性磷酸脂酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，七號(hào)試劑瓶裝有濃度為50mg/ml的氯化硝基四氮唑藍(lán)NBT，八號(hào)試劑瓶裝有濃度50mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽BCIP，九號(hào)試劑瓶9裝有pH為7. 5 的 2M Tris-HCl 溶液。
3.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的血清學(xué)檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述四種馬鈴薯Y 病毒屬病毒的特異性抗體均是利用大腸桿菌中表達(dá)的病毒外殼蛋白，通過純化蛋白、免疫家兔的方法制備獲得，所述四種馬鈴薯Y病毒屬病毒的特異性抗體和混合抗體的效價(jià)均為 4096倍，工作濃度為1 :1000倍。
4.甘薯上馬鈴薯Y病毒屬病毒的血清學(xué)檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于所述檢測(cè)方法包括以下步驟(1)準(zhǔn)備硝酸纖維素NC膜剪取合適大小的NC膜，用鉛筆在膜上做好標(biāo)記，以便于點(diǎn)樣；(2)樣品處理將0.Ig甘薯樣品于液氮中速凍，并研磨成粉末，加入ΙΟΟμΙ抽提緩沖液， 繼續(xù)研磨至徹底裂解并轉(zhuǎn)移到離心管中，5000rpm離心5min ；(3)點(diǎn)樣將NC膜置于TBS中浸泡1min，用濾紙吸去膜表面的液體，取上清液5μ1點(diǎn)于膜上，室溫晾干；(4)封閉加入IOml封閉液于培養(yǎng)皿中，將膜浸入其中，室溫孵育60min ；(5)洗膜棄去封閉液，用TBS洗膜一次；(6)加一抗將NC膜置于用抗體緩沖液稀釋至工作濃度的抗體中，室溫下以50rpm/min 的速度振蕩，孵育過夜；(7)洗膜棄一抗，用T-TBS溶液洗NC膜3-4次，3min/次；(8)加二抗用濾紙吸去NC膜上多余的溶液，然后將NC膜置于用抗體緩沖液稀釋至工作濃度的酶標(biāo)抗體中，室溫下以50rpm/min的速度振蕩，孵育1 h ；(9)洗膜棄二抗，用T-TBS溶液洗NC膜3-4次，3min/次；(10)顯色將NC膜置于NBT和BCIP的底物溶液中，每5ml底物緩沖液先加入33μ1 ΝΒΤ，再加入16. 5μ1 BCIP，室溫下以50 rpm/min的速度搖床振蕩，避光顯色5_30 min ；(11)終止反應(yīng)將NC膜從底物溶液中取出，用蒸餾水洗NC膜3次，3-4min/次；(12)陽性判斷將NC膜晾干后觀察顏色反應(yīng)，比較檢測(cè)樣品與正負(fù)對(duì)照的顏色反應(yīng)， 出現(xiàn)紫色的樣品為陽性。
5.如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述抽提緩沖液為TBS和0.2%亞硫酸鈉的混合液。
6.如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述封閉液的成分為TBSJ%脫脂奶粉和洲聚乙二醇辛基苯基醚的混合物。
7.如權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述工作濃度的抗體為 SPFMV, SPLV, SPVG, SPVMV抗體或混合抗體，抗體工作濃度均為1 :1000倍。
8.如權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述酶標(biāo)抗體為堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，酶標(biāo)抗體的工作濃度為1 :1000倍。
全文摘要
本發(fā)明涉及涉及甘薯上的馬鈴薯Y病毒屬病毒的血清學(xué)檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。試劑盒分為上、下兩層，上層放置有試劑瓶，下層為可推拉的抽屜，抽屜中放有硝酸纖維素膜；不同試劑瓶中分別裝有馬鈴薯Y病毒屬病毒的特異性抗體、馬鈴薯Y病毒屬病毒的混合抗體以及堿性磷酸脂酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、NBT、BCIP和Tris-HCl溶液。檢測(cè)樣品時(shí)，當(dāng)需要確定樣品中是否含有馬鈴薯Y病毒屬病毒時(shí)，使用混合抗體試劑瓶檢測(cè)；當(dāng)需要確定某種特定病毒時(shí)，使用其他特異性抗體檢測(cè)，檢測(cè)方便，節(jié)省成本，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、直觀，方便實(shí)用。本發(fā)明可應(yīng)用于脫毒甘薯莖尖苗和各級(jí)種薯的檢測(cè)，通過對(duì)Potyviruses病毒的快速高效檢測(cè)，可以確保脫毒甘薯的質(zhì)量和增產(chǎn)效果。
文檔編號(hào)G01N33/558GK102520185SQ201110368009
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月18日
發(fā)明者喬奇, 張德勝, 張振臣, 王永江, 王爽, 田雨婷, 秦艷紅 申請(qǐng)人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院