專利名稱：一種紫膠桐酸含量的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于檢測分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種色譜檢測方法，特別涉及一種采用高效色譜檢測分析方法測定紫膠桐酸含量的方法。
背景技術(shù)：
紫膠樹脂是食品添加劑的重要原材料，由多羥基脂肪酸和倍半萜烯酸組成的聚酯混合物，其中多羥基脂肪酸為紫膠桐酸，是一種白色晶體，是紫膠樹脂結(jié)構(gòu)單體中的長鏈脂肪酸部分，分子式為C16H32O5,含有三個游離的羥基和一個游離的羧基，也稱作9，10，16-三羥基棕櫚酸。紫膠桐酸用途廣泛，不僅可以作為大環(huán)麝香類香料化合物、營養(yǎng)能量劑、前列 腺素、昆蟲信息素、環(huán)酰脲等的前體合成原料，也可應(yīng)用于防紫外線、防輻射、耐高溫等航空航天材料的制備。皂化處理是紫膠桐酸制備過程中的重要步驟，目前國內(nèi)已有常溫皂化法、普通加熱皂化法、超聲波輔助皂化法和微波皂化法，其中微波皂化法制備紫膠桐酸的方法具有操作簡單，時間短，效率高，安全無污染等特點(diǎn)。雖然紫膠桐酸的制備方法得到了改進(jìn)，但是目前國內(nèi)外尚無公認(rèn)的紫膠桐酸快速、準(zhǔn)確檢測方法。對紫膠桐酸含量測定方法的研究主要有如下3種(I)廖亞龍等用酸堿滴定法檢測紫膠桐酸含量，簡便快速，但酸堿滴定結(jié)果反映的是被測樣品中總有機(jī)酸的含量，并不能有效甄別樣品中的紫膠桐酸和其它有機(jī)酸；(2) —般含有長碳鏈脂肪酸結(jié)構(gòu)的有機(jī)物多是通過甲酯化后用氣相色譜來檢測，哈成勇等采用核磁共振法測定紫膠桐酸優(yōu)勢構(gòu)象時制備了紫膠桐酸甲酯，但制備時間長，且紫膠桐酸分子結(jié)構(gòu)中由于同時含有羧基和羥基，較易發(fā)生分子間或分子內(nèi)酯化，故此法用于氣相色譜檢測時較難實(shí)現(xiàn)；(3)液相色譜法可以分離紫膠桐酸，但因紫膠桐酸中沒有共軛結(jié)構(gòu)，在200nm SOOnm并無特征吸收峰，故不能利用紫外(UV)檢測器來檢測。Nagappayya等報道了采用高效液相色譜(HPLC)蒸發(fā)光散射(ELSD)法檢測紫膠桐酸，流動相為乙腈和水，因未明確色譜條件且無譜圖佐證，難以判斷其檢測效果；雖然ELSD檢測器靈敏度高，穩(wěn)定性好，但價格比較昂貴，難以推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有紫膠桐酸含量測定方法中存在的技術(shù)缺陷，提供一種能夠快速，準(zhǔn)確地測定樣品中紫膠桐酸含量的方法，本發(fā)明方法測定過程中色譜圖峰型完整、美觀，無拖尾現(xiàn)象；測定結(jié)果準(zhǔn)確、快速、選擇性強(qiáng)而且靈敏度高。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明一方面提供一種測定紫膠桐酸含量的方法，包括分別制備紫膠桐酸的對照品溶液和供試品溶液，采用高效液相色譜法測定對照品溶液和供試品溶液的峰面積，按照外標(biāo)法以峰面積計算供試品中紫膠桐酸的含量。其中，所述對照品溶液的制備包括，稱取紫膠桐酸標(biāo)準(zhǔn)品作為對照品，將對照品加入對照品溶劑，溶解，制成對照品溶液，其中，所述對照品溶劑為水或甲醇的水溶液；所述供試品溶液的制備包括，稱取含有紫膠桐酸的樣品，將樣品加入樣品溶劑，溶解，制成供試品溶液，其中，所述樣品溶劑為水或甲醇的水溶液；所述測定包括，分別吸取對照品溶液和供試品溶液注入液相色譜儀進(jìn)行液相色譜測定，采用示差折光檢測器檢測、記錄對照品溶液和供試品溶液的峰面積。特別是，所述對照品溶劑甲醇的水溶液中甲醇與水的體積之比為60 40。其中，所述甲醇的水溶液中還含有三氟乙酸。特別是，所述甲醇的水溶液的總體積與三氟乙酸的體積之比為100 0.1。 尤其是，所述對照品溶劑中甲醇、水、三氟乙酸的體積之比為60 40 0.1。特別是，所述樣品溶劑甲醇的水溶液中甲醇與水的體積之比為60 40。其中，所述甲醇的水溶液中還含有三氟乙酸。特別是，所述甲醇的水溶液的總體積與三氟乙酸的體積之比為100 0.1。尤其是，所述樣品溶劑中甲醇、水、三氟乙酸的體積之比為60 40 0.1。其中，所述的高效液相色譜采用的色譜柱為氨基色譜柱(即氨基柱)或C18反相色譜柱；所述高效液相色譜的流動相為含有甲醇的水溶液。特別是，所述氨基色譜柱選擇YWG_NH2、Ultimate XB-NH2 > Inertsil-NH2 或Hypersi 1APS2 (NH2)色譜柱；所述 C18 反相色譜柱選擇 Sepax GP-C18、Sepax HP-C18 或Z0RBAXSB-C18 反相柱。尤其是，所述C18反相色譜柱為ZORBAX SB-C18反相柱。特別是，所述流動相中甲醇與水的體積之比為50-70 30-50，優(yōu)選為50-60 40-50，進(jìn)一步優(yōu)選為 60 40。特別是，所述流動相中還含有三氟乙酸。尤其是，所述甲醇、水、三氟乙酸的體積之比為50-70 30-50 0.05-0. 2，優(yōu)選為60 40 0. 05-0. 2，進(jìn)一步優(yōu)選為 60 40 0. 05-0. I 更進(jìn)一步優(yōu)選為 60 : 40 : 0. I。其中，所述高效液相色譜分析條件為流速為0. 7-1. 5ml/min,優(yōu)選為lml/min ;柱溫為25-35°C，優(yōu)選為30°C。其中，所述示差折光檢測器檢測過程中檢測溫度為25_35°C，優(yōu)選為30°C。本發(fā)明方法測定紫膠桐酸含量的測定方法具有如下優(yōu)點(diǎn)I、本發(fā)明方法測定紫膠桐酸含量準(zhǔn)確，測定速度快、方法簡便，測定效率高，測定時間短，紫膠桐酸的出峰時間快，即紫膠桐酸的保留時間(RT)為7.6-8.0min。2、本發(fā)明測定方法采用高效液相色譜法進(jìn)行測定，采用本發(fā)明的流動相能夠?qū)⒆夏z桐酸與雜質(zhì)完全分離，液相色譜法分離效果好，紫膠桐酸的色譜圖峰型完整、美觀，流動相中添加三氟乙酸，使得紫膠桐酸的色譜法沒有拖尾現(xiàn)象，測定結(jié)果準(zhǔn)確。3、本發(fā)明方法測定結(jié)果重現(xiàn)性好，系統(tǒng)精密度高，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差平均值(RSD)為0. 86% ;穩(wěn)定性好，穩(wěn)定性試驗的RSD平均值為0. 75% ;本方法的可信度高，在線性范圍0. 01 I. OOmg/mL (r = 0. 9994)實(shí)用性好。4、本發(fā)明檢測方法選擇性強(qiáng)，靈敏度高，本發(fā)明的檢測最小量即最低檢測限為
0.008mg/ml。5、本發(fā)明方法克服了因紫膠桐桐酸中沒有共軛結(jié)構(gòu)，在200nm 800nm并無特征吸收峰，不能利用紫外(UV)檢測器來檢測的缺陷，采用示差折光檢測器，利用樣品組分與流動相的折光系數(shù)的不同，精確地檢測紫膠桐酸，測定紫膠桐酸的含量。6、本發(fā)明方 法操作簡單，處理時間短，快速而且測定結(jié)果準(zhǔn)確，降低了紫膠桐酸的生產(chǎn)、檢測成本，適宜工業(yè)化大規(guī)模推廣應(yīng)用。


圖I是流動相為含有甲醇的水溶液的紫膠桐酸HPLC色譜條件選擇試驗的色譜圖；圖2是流動相為含有甲醇、水和三氟乙酸混合溶液的紫膠桐酸HPLC色譜條件選擇試驗的色譜圖；圖3是紫膠桐酸HPLC色譜條件流速選擇試驗的色譜圖；圖4是紫膠桐酸HPLC色譜條件柱溫選擇試驗的色譜圖；圖5是紫膠桐酸HPLC色譜分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。本發(fā)明實(shí)施例中使用的試驗材料、試劑和儀器如下紫膠桐酸標(biāo)準(zhǔn)樣品(純度95% ):美國BE公司；甲醇(色譜純)FisherScientific 公司；三氟乙酸(化學(xué)純)、鄰苯二甲酸氫鉀(分析純)國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鉀(分析純)西隴化工股份有限公司；實(shí)驗用水為超純水；紫膠桐酸樣品中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所特種生物資源工程技術(shù)研究中心制備。Agilentl200高效液相色譜儀美國安捷倫公司，配有型號為RID-G1362A示差折光檢測器和ZORBAX SB-C18反相色譜柱；Purelab Ultra超純水儀英國ELGA公司；KQ-300VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗機(jī)昆山市超聲儀器有限公司。實(shí)施例I高效液相色譜分析色譜條件的選擇11紫膠桐酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置準(zhǔn)確稱取0. IOOOg紫膠桐酸標(biāo)準(zhǔn)樣品(含量95%)，加入甲醇、水和三氟乙酸的混合溶液，攪拌溶解，其中甲醇與水的體積之比為60 40，甲醇與水的總體積與三氟乙酸的體積之比為100 0. 1，在超聲波輔助下溶解混勻，然后定容至IOOmL容量瓶中，搖勻配制成母液。分別吸取0. 1,0. 5、l、2、3、4、5、6、8、10mL母液于IOmL容量瓶中，用V(甲醇)V(水)=60 40(0. 1%三氟乙酸)的溶液定容至刻度。配置的紫膠桐酸標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的濃度分別為 0. 01,0. 05,0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 8、I. Omg/mL。
I. 2流動相的選擇色譜柱選擇ZORBAX SB-C18 反相色譜柱(5 u m, 0 4. 6 X 150mm)檢測器RID_G1362A示差折光檢測器；溫度柱溫30 V，檢測器溫度30 V ；流速lmL/min;分別精確吸取濃度為0. 5mg/mL的紫膠桐酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 U L，采用如表I中所述體積之比的流動相進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析，采用示差折光檢測器檢測，記錄色譜圖。高效液相色譜分析色譜條件選擇條件和結(jié)果如表I所示。 表IHPLC色譜分析流動性與色譜行為
流動相(體積之比)色譜行為
甲醇水=90 10極性過強(qiáng)，目標(biāo)峰不保留，直接隨溶劑峰一起出來
甲醇水=80 20極性強(qiáng)，目標(biāo)峰不保留，與溶劑峰不能有效分離
甲醇水=60 40色譜峰拖尾
甲醇水=50 50出峰時間較長，時間效率不高
甲醇水三氟乙酸=60 40 0.05 三氟乙酸加入量略低，峰型效果欠佳
甲醇水三氟乙酸=60 40 0.1 峰型、柱效果好，分離度高，RT適中，RT為7. 7min
甲醇水三氟乙酸=60 40 0.2 三氟乙酸加入量偏高，對分離柱損害較大流動相為甲醇水=90 10,80 20,60 40,50 50的HPLC譜圖見附圖I ;流動相為甲醇水三氟乙酸=60 40 0. 05,60 40 0. 1,60 40 0. 2 的 HPLC譜圖見附圖2。綜合分析圖1、2，選擇流動相為甲醇水溶液或甲醇、水與三氟乙酸的混合溶液，其中甲醇和水(60 40 (V/V))的總體積與三氟乙酸的體積之比為100 0.05-0. 2都可以作為流動相，考慮到保留時間(RT)、色譜峰的峰型等的因素，優(yōu)選甲醇-水(60 40)與三氟乙酸的體積之比為100 0.1的混合溶液為流動相，即流動相為甲醇、水和三氟乙酸的混合液，其中甲醇、水三氟乙酸的體積之比為60 40 0.1。I. 3流速的選擇以甲醇、水、三氟乙酸的體積之比為60 40 0. I的混合溶液為流動相，比較不同流速下紫膠桐酸出峰及分離效果的影響。精確吸取濃度為0. 5mg/mL的紫膠桐酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 U L,采用甲醇、水、三氟乙酸的體積之比為60 40 0. I的混合溶液為流動相，分別以流速為I. 5mL/min、lmL/min、
0.5mL/min速度進(jìn)行HPLC分析，采用示差折光檢測器檢測，記錄色譜圖。不同流速條件下高效液相色譜分析色譜圖如圖3所示。由圖3的分析結(jié)果表明流速為1.5mL/min，出峰時間提前，紫膠桐酸的RT為3min,與溶劑峰相臨近，分離度差，影響分析效果，而且色譜柱的柱壓過大，對色譜柱不益，影響色譜柱的分離效果；流速為0. 5mL/min，雖然柱壓降低，但出峰時間延長，紫膠桐酸的RT為12min左右,延長了分析時間,分析效率低；流速為lmL/min,出峰時間適中，紫膠桐酸的RT為7. 7min，色譜柱的柱壓合適，因此選擇HPLC的測定流速為lmL/min。I. 4柱溫的選擇在確定流動相配比及流速后，考慮柱溫對試驗的影響。分別精確吸取濃度為0. 3mg/mL的紫膠桐酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 U L，采用甲醇、水、三氟乙酸的體積之比為60 40 0. I的混合溶液為流動相，流速為lmL/min，分別在柱溫為25 V、30°C、35 V的色譜條件下進(jìn)行HPLC分析，在檢測器溫度為25 V、30°C、35 V下進(jìn)行示差折光檢測器檢測，記錄色譜圖。不同柱溫和檢測器溫度條件下高效液相色譜分析色譜圖如圖4所示。圖4的分析結(jié)果表明柱溫對出峰效果和分離效果的影響較小。鑒于較低溫度下 儀器能耗較低、色譜柱壽命長、升溫時間短，故采用30°C作為最佳溫。實(shí)施例2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制按照實(shí)施例I中色譜分析條件進(jìn)行測定，色譜分析條件如下色譜柱Z0RBAXSB-C18 反相色譜柱(5 u m, 0 4. 6 X 150mm)流動相甲醇水三氟乙酸=60 40 0. I (V/V/V)；流速lmL/min;柱溫30°C；檢測器RID_G1362A示差折光檢測器；示差折光檢測器溫度30°C。2. I繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線取紫膠桐酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析，將配置的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別精密吸取IOu L，注入液相色譜儀，進(jìn)行測定，每個樣品測3次，取3次測定結(jié)果的平均值，以標(biāo)準(zhǔn)樣品峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線，如圖5所示。得回歸方程Y = 74584X+2899. 3，R2 = 0. 9994，結(jié)果表明，紫膠桐酸濃度在0. 01
I.Omg/mL的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，因此，可以根據(jù)此方程進(jìn)行定量分析。在上述的色譜條件下，當(dāng)信噪比S/N為3時，紫膠桐酸的最低檢測限為0. 008mg/mL。2. 2精密度試驗精密吸取濃度為0. 4mg/mL的紫膠桐酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 U L，連續(xù)進(jìn)樣9次，按照實(shí)施例I中選擇的色譜分析條件進(jìn)行測定，計算平均峰面積和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，評估精密度，測定結(jié)果見表2。表2紫膠桐酸精密度試驗結(jié)果(n = 9)次數(shù)保留時間(min) 峰面積平均峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD %)
17.81530058.0
27.81329974.9
37.81230453.2
47.80730310.3
57.80130247.3 30277.060.86
67.80230658.2
77.80130585.2
87.79829910.5
97.79930295.9測定結(jié)果表明9次測定數(shù)據(jù)的RSD平均值為0. 86%，表明本研究方法確定的紫膠桐酸分離檢測條件精密度良好。2. 4穩(wěn)定性試驗于紫膠桐酸標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液制備后0、l、2、3、4、5、6、7、8h，精密吸取濃度為0. 5mg/mL的紫膠桐酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 u L，連續(xù)進(jìn)樣9次，按照實(shí)施例I中選擇的色譜分析條件進(jìn)行測定，計算平均峰面積和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，評估精密度，測定結(jié)果見表3。表3紫膠桐酸穩(wěn)定性試驗結(jié)果(n = 9)
次數(shù)保留時間(min) 峰面積峰面積平均值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD %)
17.81938446.5
27.82238651.3
37.82138603.4
47.8238140.4
57.82438329.538295.40.75
67.82438560.3
77.82338034.6
87.8238019.8
97.82337872.8測定結(jié)果表明9次測定數(shù)據(jù)的RSD平均值為0. 75%，表明紫膠桐酸樣品檢測穩(wěn)定性良好。2. 5加標(biāo)回收率試驗按照實(shí)施例I選定的色譜分析條件和回歸方程Y = 74584X+2899. 3的定量分析，測定紫膠桐酸樣品含量為95. 31% ；精密稱取已測定的含量為95. 31%的紫膠桐酸樣品0.0500g溶于IOOmL實(shí)施例I中選擇的流動相中，其中流動相中甲醇、水、三氟乙酸的體積之別為60 40 0.1，制得濃度為0. 50mg/ml的紫膠桐酸樣品溶液；接著分別精確吸取3. 00,3. 50,4. 00,4. 50、5. 00,5. 50,6. 00,6. 50和7. OOml紫膠桐酸樣品溶液置于IOml容量瓶中，即加入容量瓶中的紫膠桐酸樣品的質(zhì)量分別為 I. 42965mg、l. 66792mg、l. 90620mg、2. 14470mg、2. 38275mg、
2.62102mg、2. 62102mg、3. 09757mg 和 3. 33585mg ;然后向每個瓶中加入濃度為 0. 5mg/ml 的紫膠桐酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液2ml，即加入每個瓶中的紫膠桐酸標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量為0. 95000mg，加流動相定容至10mL，搖勻，分別計算加標(biāo)回收率，回收率計算公式如下
權(quán)利要求
1.一種測定紫膠桐酸含量的方法，其特征是包括分別制備紫膠桐酸的對照品溶液和供試品溶液，采用高效液相色譜法測定對照品溶液和供試品溶液的峰面積，按照外標(biāo)法以峰面積計算供試品中紫膠桐酸的含量。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征是 所述對照品溶液的制備包括，稱取紫膠桐酸標(biāo)準(zhǔn)品作為對照品，將對照品加入對照品溶劑，溶解，制成對照品溶液，其中，所述對照品溶劑為水或甲醇的水溶液； 所述供試品溶液的制備包括，稱取含有紫膠桐酸的樣品，將樣品加入樣品溶劑，溶解，制成供試品溶液，其中，所述樣品溶劑為水或甲醇的水溶液； 所述測定包括，分別吸取對照品溶液和供試品溶液注入液相色譜儀進(jìn)行液相色譜測定，采用示差折光檢測器檢測、記錄對照品溶液和供試品溶液的峰面積。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征是所述高效液相色譜采用的色譜柱為氨基色譜柱或C18反相色譜柱。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征是所述C18反相色譜柱為SepaxGP-C18、SepaxHP-C18 或 ZORBAX SB-C18 反相柱。
5.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征是所述高效液相色譜法測定的流動相為含有甲醇的水溶液。
6.如權(quán)利要求5所述的測定方法，其特征是所述流動相中甲醇與水的體積之比為50-70 30-50。
7.如權(quán)利要求6所述的測定方法，其特征是所述流動相中還含有三氟乙酸。
8.如權(quán)利要求7所述的測定方法，其特征是所述甲醇、水、三氟乙酸的體積之比為50-70 30-50 0.05-0.2。
9.如權(quán)利要求I或2所述的測定方法，其特征是所述高效液相色譜分析條件為流速為lml/min，柱溫為 25_35°C。
10.如權(quán)利要求2所述的測定方法，其特征是所述示差折光檢測器檢測過程中檢測溫度為 25-35°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種紫膠桐酸含量的測定方法，包括采用高效液相色譜法進(jìn)行測定，以含有甲醇的水溶液為流動相，采用示差折光檢測器進(jìn)行測定，按照外標(biāo)法以峰面積分別計算紫膠桐酸樣品中的紫膠桐酸的含量。本發(fā)明方法提高了含量測定的精確性，縮短了測定時間，重復(fù)性好，適應(yīng)性高，而且本發(fā)明方法的選擇性強(qiáng)，靈敏度高，最低檢測限小，克服了紫膠桐酸沒有共軛結(jié)構(gòu)，不能利用紫外(UV)檢測器來檢測的缺陷，降低了紫膠桐酸的生產(chǎn)、檢測成本，適宜于紫膠桐酸的檢測應(yīng)用。
文檔編號G01N30/02GK102759583SQ20111037184
公開日2012年10月31日 申請日期2011年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月21日
發(fā)明者馮穎, 劉世平, 周梅村, 張弘, 張敏, 張雯雯, 鄭華, 陳曉鳴 申請人:中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所