專利名稱：豬體內(nèi)雌二醇殘留的快速檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測雌二醇的試劑盒。本發(fā)明還涉及使用上述試劑盒檢測雌二醇殘留的方法。
背景技術：
雌激素類藥物是動物飼養(yǎng)中應用最為廣泛、效果顯著的一類生長促進劑，由于具有促進動物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)沉積和改善生產(chǎn)性能的作用，用來提高飼料轉(zhuǎn)化率，促進動物生長，可以很快為畜牧養(yǎng)殖業(yè)帶來顯著的經(jīng)濟效應，曾廣泛應用于畜牧養(yǎng)殖過程中。而雌二醇是養(yǎng)殖過程中最常用的一種雌激素，濫用雌二醇會造成動物體內(nèi)不同程度的殘留，人體一旦食用有雌二醇殘留的動物性食品后，就可通過食物鏈擾亂人體內(nèi)激素平衡，使女性兒童提前發(fā)育，男性兒童呈女性化，使男性生殖系統(tǒng)病變及女性乳腺癌發(fā)生率上升。自上世紀90 年代開始，歐盟對雌二醇藥物殘留進行了嚴格的限制。我國農(nóng)業(yè)部176公告已經(jīng)明確規(guī)定禁止在動物飼養(yǎng)過程中使用雌二醇。目前，國內(nèi)外有關尿液中雌二醇物檢測方法的研究較多，主要包括高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜法。但是，液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜法檢測時需要對樣品進行酶解，氣相色譜-質(zhì)譜法檢測時需要對樣品進行衍生化，前處理繁瑣，耗時較長，且用較多的試劑，從而對環(huán)境造成污染。目前已知雌二醇在動物體內(nèi)通過代謝轉(zhuǎn)化為葡萄糖醛酸類的代謝產(chǎn)物，這些雌二醇及其代謝產(chǎn)物最終可通過尿液排出體外。而檢測雌二醇的代謝物就可避免這些繁瑣的前處理操作，而且代謝物的響應值比雌二醇的響應值要尚ο

發(fā)明內(nèi)容
所以本發(fā)明研制了一種用于檢測尿液中雌二醇代謝產(chǎn)物的試劑盒，并采用液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜分析。故本發(fā)明通過對豬尿中的雌二醇-17-葡萄糖醛酸進行檢測，避免了雌二醇的酶解和衍生的復雜過程，從而可以快速判斷生豬是否喂食了違禁藥物雌二醇， 在養(yǎng)殖和屠宰方面做到很好的監(jiān)控。本發(fā)明的目的在于主要為養(yǎng)殖場和屠宰場提供一種靈敏度高，可以快速且準確地測定雌二醇的代謝產(chǎn)物雌二醇-17-葡萄糖醛酸，進而可以判斷生豬是否喂食違禁藥物雌二醇的試劑盒和方法。一種檢測雌二醇-17-葡萄糖醛酸試劑盒，包括標準品溶液、甲醇、氨化甲醇和 C18SPE 柱。所述的檢測雌二醇-17-葡萄糖醛酸試劑盒，其特征在于標準品溶液儲存在安瓿瓶中，體積為l-5ml，濃度為0. lmg/L-5mg/L，溶劑為甲醇或乙腈。所述的檢測雌二醇-17-葡萄糖醛酸試劑盒，其特征在于甲醇溶液儲存在安瓿瓶中，體積為5-20ml，色譜純。所述的檢測雌二醇-17-葡萄糖醛酸試劑盒，其特征在于氨化甲醇儲存在安瓿瓶中，體積為5-20ml，氨化甲醇的比例為2% -25%。所述的檢測雌二醇-17-葡萄糖醛酸試劑盒，其特征在于C18SPE柱柱內(nèi)填料為 C18，柱容量為3cc-6cc。所述的試劑盒檢測尿液的方法，包括如下步驟1)分別用3-10ml的甲醇和水活化C18SPE柱；2)在活化好的C18SPE柱中加入l_3ml的尿液樣品；3)用 4_8ml 的水淋洗 C18SPE 柱；4)用4_8ml的氨化甲醇對C18SPE柱進行洗脫；5)洗脫液濃縮定容后過濾膜，上機檢測。所述的方法，其中步驟2中的待測樣品為尿液樣品。所述的方法，其中步驟5是采用液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜進行檢測。本發(fā)明具有以下優(yōu)點a)靈敏度高；b)測定速度快，單人次測定十個樣品的時間約為20分鐘；c)準確度，穩(wěn)定性和可靠性高，雌二醇代謝產(chǎn)物的響應值比原型藥物的響應值高， 更為其準確度提供了依據(jù)；d)實驗過程中試劑應用少，因此對環(huán)境的污染小。


圖1為加標尿液中雌二醇-17-葡萄糖醛酸的提取質(zhì)譜圖。
具體實施例方式試劑盒的盒體是指放置標準品溶液安瓿瓶、甲醇安瓿瓶、氨化甲醇安瓿瓶和 C18SPE柱的包裝物，該包裝物通常是指可以防摔、防壓的塑料盒，也包括內(nèi)部具有隔熱保溫的泡沫塑料等材料，試劑盒存放時需要放置在冰箱的冷藏室，在運輸過程中可放置冰塊，但運輸時間不能超過3天。一個典型的盒體為長20cm，寬15cm，高8cm的塑料盒，外加里邊的保溫塑料泡沫。下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。實施例1從冰箱的冷藏室中取一個標準試劑盒，包括標準品溶液安瓿瓶、甲醇安瓿瓶、氨化甲醇安瓿瓶和C18SPE柱，盒體材質(zhì)為塑料，內(nèi)襯隔熱保溫的塑料泡沫等材料，盒體為長 20cm,寬15cm，高8cm的長方體形。其他實驗輔助設備包括移液槍、廢液收集器、洗脫液收集管、氮吹儀、濾膜等。具體過程如下A、通過逐級稀釋的方法，把標準品溶液稀釋為0. 5 μ g/L、l μ g/L、2 μ g/L、5 μ g/L、 10μ g/L、20y g/L、50y g/L 各 1ml，做標準曲線。B、取Iml豬尿，加標濃度為50 μ g/L,然后分別取5ml甲醇和水活化C18SPE柱，把 Iml加標豬尿樣品加入到活化好的C18SPE柱上，之后用5ml水淋洗，再用5ml氨化甲醇洗脫到洗脫液收集管中，在氮吹儀中吹干，用甲醇定容到1ml，過0. 2 μ m濾膜，上機檢測。
C、液相色譜四級桿質(zhì)譜條件流動相乙腈和0. 甲酸水，梯度:l-2min,20% -25% 乙腈，2_4min，25% -28% 乙腈，4-8minJ8% -20% 乙腈。負離子模式，去簇電壓40V，碰撞電壓30V，離子源溫度120°C。D、結(jié)果圖1為加標尿液中雌二醇-17-葡萄糖醛酸的提取質(zhì)譜圖，通過此圖可得到化合物的峰面積，并且通過標準曲線，得到樣品加標的測定結(jié)果，回收率為94.7%，方法的定量限為 0. Syg/kg。
權利要求
1.一種檢測雌二醇-17-葡萄糖醛酸的試劑盒，包括標準品溶液、甲醇、氨化甲醇和C18 SPE 柱。
2.根據(jù)要求1所述的試劑盒，其中，標準品溶液儲存在安瓿瓶中，體積為l_5ml，濃度為 0. lmg/L 5mg/L，溶劑為甲醇或乙腈。
3.根據(jù)要求1所述的試劑盒，其中，甲醇溶液儲存在安瓿瓶中，體積為5-20ml，色譜純。
4.根據(jù)要求1所述的試劑盒，其中，氨化甲醇儲存在安瓿瓶中，體積為5-20ml，氨化甲醇的比例為2% 25%。
5.根據(jù)要求1所述的試劑盒，其中，C18SPE柱內(nèi)的填料為C18，柱容量為3cc-6cc。
6.使用權利要求1所述試劑盒檢測雌二醇的方法，包括如下步驟1)分別用甲醇和水活化C18SPE柱；2)在活化好的C18SPE柱中加入待測樣品；3)用水淋洗C18SPE柱；4)用氨化甲醇對C18SPE柱進行洗脫；5)洗脫液濃縮定容后過濾膜，上機檢測。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中，步驟2中的待測樣品為尿液樣品。
8.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中，步驟5是采用液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜進行檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測雌二醇-17-葡萄糖醛酸的試劑盒，包括標準品溶液、甲醇、氨化甲醇和C18SPE柱。本發(fā)明使用上述試劑盒檢測雌二醇的方法，包括如下步驟1)分別用甲醇和水活化C18SPE柱；2)在活化好的C18SPE柱中加入待測樣品；3)用水淋洗C18SPE柱；4)用氨化甲醇對C18SPE柱進行洗脫；5)洗脫液濃縮定容后過濾膜，采用液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜進行檢測。本發(fā)明的檢測方法及試劑盒的靈敏度高于傳統(tǒng)的儀器分析方法，具有靈敏、簡單，快速，準確度高，有機溶劑消耗少，環(huán)境友好的優(yōu)點，檢出限為0.1μg/kg。
文檔編號G01N30/02GK102507795SQ201110380410
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月25日 優(yōu)先權日2011年11月25日
發(fā)明者儲曉剛, 張峰, 王秀娟, 許成保 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院