專利名稱：一種用于新生兒葡萄糖六磷酸脫氫酶缺乏癥篩查的試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測試劑盒領(lǐng)域，具體涉及一種用于新生兒葡萄糖六磷酸脫氫酶缺乏癥篩查的試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
葡萄糖六磷酸脫氫酶缺乏癥為紅細(xì)胞葡萄糖六磷酸脫氫酶(G6PD)顯著缺乏所導(dǎo)致的一組異質(zhì)性疾病，俗稱“蠶豆病”，是一種最常見的遺傳性酶缺陷病。葡萄糖六磷酸脫氫酶缺乏癥(Glucose-6-phosphate dehydrogenase G6PD)是幾乎所有高、低等生物重要看家酶之一，分子量為59kDa，其活性形式由2個(gè)或4個(gè)亞單位組成，每個(gè)亞單位含515個(gè)氨基酸。該酶催化細(xì)胞能量代謝過程磷酸己糖旁路途徑的限速步驟，并在此過程中把NADP (輔酶II)還原為NADPH，后者為還原型谷胱甘肽合成所必需，是紅細(xì)胞抗氧化反應(yīng)中的重要因子。G6PD酶活性的缺乏直接影響到紅細(xì)胞的抗氧化能力，可導(dǎo)致溶血性貧血、蠶豆病、 新生兒高膽血紅素血癥等病患，是人類最常見的酶缺陷病，全球范圍內(nèi)約累及4億人。目前已發(fā)現(xiàn)400多種G6PD變異株，由150多種G6PD基因的突變引起，突變的類型和頻率呈現(xiàn)明顯的地域或群體特異性。此病主要見于非洲、地中海沿岸、中東、亞洲、太平洋諸島、南美洲等瘧疾曾一度流行的熱帶和亞熱帶地區(qū)，普遍認(rèn)為與瘧疾的抗性選擇有關(guān)，但一直缺乏足夠和必要的直接證據(jù)。我國是本病的高發(fā)區(qū)之一，呈南高北低的分布特點(diǎn)，患病率為 0. 2-44. 8%。主要分布在長江以南各省，以海南、廣東、廣西、云南、貴州、四川等省為高。G6PD 缺乏癥發(fā)病原因是由于G6PD基因突變，導(dǎo)致該酶活性降低，紅細(xì)胞不能抵抗氧化損傷而遭受破壞，引起溶血性貧血。G6PD缺乏癥的臨床表現(xiàn)與一般溶血性貧血大致相同。分新生兒黃疸、蠶豆病、藥物性溶血、感染性溶血、非球形細(xì)胞溶血性貧血等臨床類型。本病臨床表現(xiàn)的輕重程度不同， 多數(shù)患者，特別是女性雜合子，平時(shí)不發(fā)病，無自覺癥狀，部分患者可表現(xiàn)為慢性溶血性貧血癥狀。常因食用蠶豆、服用或接觸某些藥物、感染等誘發(fā)血紅蛋白尿、黃疸、貧血等急性溶血反應(yīng)。因G6PD缺乏誘發(fā)的嚴(yán)重的急性溶血性貧血因紅細(xì)胞破壞過多，如不及時(shí)處理，可引起肝、腎、或心功能衰竭，甚至死亡。60年代在廣東興寧地區(qū)在蠶豆收獲季節(jié)曾爆發(fā)G6PD 缺乏癥的流行，導(dǎo)致許多患者的死亡。G6PD缺乏癥又是新生兒病理性黃疸的主要原因。據(jù)中山醫(yī)大的一項(xiàng)統(tǒng)計(jì)表明，患G6PD缺乏癥的新生兒中，約50%的患兒會(huì)出現(xiàn)新生兒黃疸，其中約1 可發(fā)展為核黃疸，導(dǎo)致腦部損害，引起智力低下。G6PD缺乏癥在無誘因不發(fā)病時(shí)，與正常人一樣，無需特殊處理。防治的關(guān)鍵在于預(yù)防，嚴(yán)格遵照健康處方，預(yù)防發(fā)作。其次是對妊娠晚期孕婦或新生兒服用小劑量苯巴比妥， 可有效減低新生兒核黃疸的發(fā)生。輸血是本病急性發(fā)作時(shí)最有效的療法，其次是糾正酸中毒、處理腎衰。輕中度溶血患者一般用補(bǔ)液治療。目前，國際上WHO推薦的6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(G6PD/6P⑶)直接比值法(UVST)是臨床實(shí)驗(yàn)室確診G6PD缺乏癥的最佳方法。而我國新生兒G6PD缺乏癥篩查的普遍使用為熒光斑點(diǎn)和熒光分析法，其中最常用的方法為熒光分析法，該法原理為G-6-P底物在G6PD 催化下轉(zhuǎn)變6PG，同時(shí)伴隨發(fā)生NADPH (可發(fā)熒光)增加，通過檢測NADPH的量來測定葡萄糖 6磷酸脫氫酶活性。篩查血斑標(biāo)本與底物試劑G6P和NADP在室溫混合30min可發(fā)生上述反應(yīng)，加入銅溶液使反應(yīng)終止，用熒光儀在波長355nm激發(fā)光和波長460nm發(fā)射光下測定反應(yīng)物熒光。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得出未知樣本和質(zhì)控品中G6PD濃度(U/gHb)，G6PD活性低于正常值者為G6PD缺乏。但是熒光分析法對于貧血，溶血，凝血及陳舊的血樣標(biāo)本假陽性率高，準(zhǔn)確率低?，F(xiàn)有G6PD / 6P⑶比值法技術(shù)在檢測葡萄糖_6_磷酸脫氫酶缺乏癥，主要應(yīng)用于生化儀或者手工測定全血樣本中壓積紅細(xì)胞的G6PD和6PGD活性之定量比值。如廣州米基公司生產(chǎn)的改良葡萄糖-6-磷酸脫氫酶測定試劑盒(定量比值法)其原理是G6PD催化試劑中的葡萄糖六磷酸(6PG)生成六磷酸葡萄糖酸(6PG)，伴有還原型輔酶II (NADPH)的生成， NADPH的H在PMS的遞氫作用下，將氧化型的NBT (黃色)轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型NBT (藍(lán)色)。藍(lán)色的深淺與NADPH的生成量成正比關(guān)系，用分光光度計(jì)650nm比色(Si)。作為G6PD的同功酶 6P⑶，也有將氧化型輔酶II (NADP+)轉(zhuǎn)化成NADPH的作用，同法測得NADPH的量(S2)，通過 S1/S2的比值得出NADPH的相對含量。還有些技術(shù)的測定原理為檢測樣品中G6PD催化試劑中6PG生成六磷酸葡萄糖酸 (6PG)，同時(shí)將試劑中的NADP+轉(zhuǎn)化為NADPH。隨著NADPH的增多，檢測儀器通過監(jiān)測340nm 處吸光度上升的速率，可以計(jì)算出樣品中G6PD的活性。由于樣品中含有6PGD，它能催化6PG 生成五磷酸核酮糖，同時(shí)也把NADP+還原成NADPH，使吸光度上升，通過分別檢測G6PD+6P⑶ 共同作用的吸光度變化速率和G6PD單獨(dú)作用的變化速率，兩者相減，求出真正的葡萄糖六磷酸脫氫酶的活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有的G6PD缺乏癥檢測方法中存在的對于貧血，溶血，凝血及陳舊的血樣標(biāo)本假陽性率高，準(zhǔn)確率低等缺陷，提供一種對雜合子檢出率高，假陽性率低且重復(fù)性好的用于新生兒葡萄糖六磷酸脫氫酶缺乏癥篩查的試劑盒。本發(fā)明另一目的在于提供上述試劑盒的制備方法。本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供上述試劑盒的使用方法。本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
本發(fā)明提供的試劑盒，原理是G6P(6-磷酸葡萄糖)底物在G6PD催化下轉(zhuǎn)變6PG(6_磷酸葡萄糖酸酯)，同時(shí)伴隨發(fā)生NADPH (可發(fā)熒光)增加，NADPH可以通過熒光儀在波長355nm 激發(fā)光和波長460nm發(fā)射光下測定其熒光強(qiáng)度。作為G6PD同功酶的6PGD也有將NADP轉(zhuǎn)化為NADPH的作用，而人類6PGD缺乏極為罕見。通過分別檢測這兩種酶的熒光強(qiáng)度，計(jì)算比值G6PD/6P⑶，以6P⑶作為內(nèi)質(zhì)控，若比值降低即反應(yīng)G6PD活性降低，可以正確判斷葡萄糖六磷酸脫氫酶缺乏癥或減少。一種用于新生兒葡萄糖六磷酸脫氫酶缺乏癥篩查的試劑盒，包括如下組分
(1)16ml/瓶的G6P底物試劑干粉；
(2)16ml/瓶的6PG底物試劑干粉；(3)35ml/瓶的銅試劑用硫酸銅、酒石酸鉀鈉及碳酸鈉制成；
(4)G6PD濾紙干血片質(zhì)控品，Cl陽性，C2陰性；
(5)35ml/瓶的底物復(fù)溶試劑用MgCl2、雙甘氨酸及Tris-Hcl制成；
(6)微孔白色反應(yīng)板。上述用于新生兒葡萄糖六磷酸脫氫酶缺乏癥篩查的試劑盒的制備方法包括如下步驟
(1)制備G6P和6PG兩種底物試劑干粉、底物復(fù)溶試劑、銅試劑；
(2)制備濾紙干血片質(zhì)控品；
(3)分裝上述底物試劑干粉、底物復(fù)溶試劑、銅試劑；
(4)貼標(biāo)簽;
(5)組裝為成品試劑盒；
步驟(1)中，G6P底物試劑的制備是將1. 2g的G6P加純化水，充分?jǐn)嚢枞芙?，待完全溶解后，加?. 6 g的NADP · Na2,補(bǔ)足純化水至100ml，混勻；6PG底物試劑的制備是將1. 5 g的6PG加純化水，充分?jǐn)嚢枞芙猓耆芙夂?，加?. 6 g的NADP · Na2,補(bǔ)足純化水至 100ml，混勻；底物復(fù)溶試劑的制備是將0.2 g Tris和5. 4 g NaCl加純化水，充分?jǐn)嚢枞芙?，待完全溶解后，加?.8 g MgCl2和2. 5 g雙甘氨酸，補(bǔ)足純化水至100ml，混勻；銅試劑溶液的制備是分別將0. 03gCuS04 · 5H20、0. 05gNa2C03和0. 03g酒石酸鉀鈉加入到裝有純化水的容器中，待完全溶解后，補(bǔ)足純化水至100ml，混勻；
步驟(2)中，所述濾紙干血片質(zhì)控品的制備方法如下將枸櫞酸抗凝綿羊全血用低速離心機(jī)3000rmp，離心l(Tl5min分離出血漿和紅細(xì)胞。按紅細(xì)胞血漿=1.1 1. 0調(diào)整紅細(xì)胞壓積；分別加入G6PD和6P⑶純品原料，使Cl全血中G6PD/6P⑶< 1. 0，C2全血中 G6PD/6P⑶> 1. 0 ；將C1、C2分別放在磁力攪拌器上不斷攪拌，充分混勻；將裁好的903#濾紙懸掛在架子上，用移液器將質(zhì)控品滴加到濾紙片上。取液量為50ul/血斑，對準(zhǔn)中心滴下，室溫陰干3、小時(shí)，不可重疊擺放，陰干后裝入貯存袋，袋內(nèi)放干燥劑，放入2、°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> 步驟(3)中將步驟(2)中配制好的G6P底物試劑、6GP底物試劑、底物復(fù)溶試劑、銅試劑進(jìn)行分裝，將分裝好的G6P底物試劑、6GP底物試劑利用凍干機(jī)制成凍干粉。上述用于新生兒葡萄糖六磷酸脫氫酶缺乏癥篩查的試劑盒的使用方法包括如下步驟
(1)試劑準(zhǔn)備G6P底物試劑干粉，6PG底物試劑干粉分別加16ml底物復(fù)溶試劑，混勻， 靜置20分鐘；
(2)檢驗(yàn)操作
(a)加樣用打孔鉗從樣品濾紙干血片中打下下直徑為3mm或1/8英寸的樣本兩份， 打下紙片須被血液浸透，并依次分別加入G6PD和6P⑶測試的空白微孔中，每孔一片，一一對應(yīng)；
(b)加入底物向檢測G6PD熒光值的微孔中加入復(fù)溶好的G6P底物試劑150μ1；向檢測 6PGD熒光值的微孔中加入復(fù)溶好的6PG底物試劑150μ1并加貼封片；
(c)孵育在室溫下，緩慢振蕩30分鐘；
(d)加入銅試劑孵育完成后，立即加入150μ1/孔冷的銅試劑工作液，混勻；(e)檢測使用對應(yīng)的程序進(jìn)行檢測，檢測工作在15分鐘內(nèi)完成，激發(fā)波長355nm，發(fā)射波長460nm ；
(f)結(jié)果分析將檢測得到的G6PD的熒光值(Si)與6P⑶的熒光值(S2)，計(jì)算S1/S2的值，當(dāng)S1/S2彡1.0時(shí)，結(jié)果判斷為陽性，當(dāng)S1/S2 > 1.0時(shí)，結(jié)果判斷為陰性。本發(fā)明用于新生兒葡萄糖六磷酸脫氫酶缺乏癥篩查的試劑盒的結(jié)果判斷方法包括如下步驟
(1)檢測將加完銅試劑的微孔反應(yīng)板使用對應(yīng)的程序進(jìn)行檢測，檢測工作在15分鐘內(nèi)完成，激發(fā)波長355nm，發(fā)射波長460nm ；
(2)結(jié)果分析將檢測得到的G6PD的熒光值(Si)與6P⑶的熒光值(S2)，計(jì)算S1/S2的值，當(dāng)S1/S2彡1.0時(shí)，結(jié)果判斷為陽性，當(dāng)S1/S2 > 1.0時(shí)，結(jié)果判斷為陰性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明新生兒葡萄糖六磷酸脫氫酶篩查測定試劑盒主要應(yīng)用于對新生兒濾紙干血片樣品中G6PD/6PGD熒光比值的測定，對雜合子的檢出率高，大大的降低了樣品的假陽性率，為國際首創(chuàng)，填補(bǔ)國內(nèi)空白。該方法采用特定設(shè)備，測定在355nm激發(fā)光激發(fā)下產(chǎn)生的 460nm發(fā)射熒光信號(hào)，較傳統(tǒng)方法測定吸光度的變化，具有本底低、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)同時(shí)具有較高的敏感性和特異性；采用微孔反應(yīng)板作為檢測載體，操作簡便省時(shí)、花費(fèi)低，特別適于對大樣本進(jìn)行新生兒疾病篩查，免去了傳統(tǒng)方法單獨(dú)篩查的繁瑣；試劑盒在設(shè)計(jì)中還含有陰陽性對照質(zhì)控品，為產(chǎn)品應(yīng)用過程中的質(zhì)量控制提供保證；以濾紙干血片作為樣本，無需離心和洗滌等樣品前處理，大大減輕工作人員的負(fù)擔(dān)，而且一人份血片可同時(shí)可應(yīng)用于篩查四種先天性遺傳代謝疾病(先天性甲狀腺機(jī)功能減退癥、先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥、苯丙酮尿癥和G6PD缺乏癥)，非常值得在臨床上應(yīng)用推廣(表1)。表 1
丨英國朗道 I廣州米基丨專利丨本試劑
方法速率A法比值終點(diǎn)法_樣品速率空白法_熒光比值法_
蠶豆病診斷蠶豆病-診斷蠶豆病^診斷蠶豆病—
優(yōu)點(diǎn)保存時(shí)間長不用離心，不用檢測血一年有效期,雙液體,不用配制使用濾紙干血片檢測，方便樣本的保存運(yùn)輸；可以同時(shí)檢測紅蛋白濃度。直接使用。不用測定血紅蛋白大量樣本，可用于新生兒篩查；不用測定血紅蛋白濃度；可
___ a._以隨到隨做。_
缺點(diǎn)需檢測血紅全手工操作，操作時(shí)間要求使用壓積紅細(xì)胞。需要30分鐘的孵育時(shí)間。
蛋白濃度。長，試劑配制后保存時(shí)
__間短。___
樣本用生理鹽水不用WE
前處洗滌紅細(xì)胞
理三次。____
雜合低fM]rajRi
子檢
出率I____
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。實(shí)施例中的G6P_Na2購于Sigma公司；96孔微孔空白板(8X12孔)為Therom產(chǎn)品；6PG (6 磷酸葡萄糖)為 ORIENTAL 公司產(chǎn)品；β -NADP-Na2 購自 Regal Biotechnology Company公司；雙甘氨酸(GLY-GLY)購于Sigma公司；G6PD購自W0RTHINGT0N公司；6PGD購自PR0SPEC公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純；時(shí)間分辨熒光免疫分析儀(PE公司1420型)，恒溫振蕩儀為廣州市豐華生物有限公司生產(chǎn)。實(shí)施例1
制備本發(fā)明的同時(shí)檢測G6PD測定試劑盒(熒光比值法)組分包括
(1)G6P底物試劑干粉用G-6-P和NADP制成分裝并凍干；
(2)6PG底物試劑干粉用6-PG和NADP制成分裝并凍干；
(3)銅試劑用硫酸銅、酒石酸鉀鈉及碳酸鈉制成；
(4)G6PD濾紙干血片質(zhì)控品，Cl陽性，C2陰性用含抗凝綿羊全血紅細(xì)胞制備成濾紙干血片；
(5)底物復(fù)溶試劑用MgC12、Gly-Gly(雙甘氨酸)及Tris-Hcl制成。(6)紙片質(zhì)控品將枸櫞酸抗凝綿羊全血用低速離心機(jī)3000rmp，離心10 15min 分離出血漿和紅細(xì)胞。按比例(紅細(xì)胞血漿=1. 2 1. 0)調(diào)整紅細(xì)胞壓積；分別加入G6PD 和 6PGD 純品原料，使 Cl 全血中 G6PD/6PGD < 1. 0，C2 全血中 G6PD/6PGD >1.0。將 Cl、C2 分別放在磁力攪拌器上不斷攪拌(避免產(chǎn)生氣泡)，充分混勻。將裁好的903#濾紙懸掛在架子上，用移液器將質(zhì)控品滴加到濾紙片上。取液量為50ul/血斑，對準(zhǔn)中心滴下。室溫陰干 (3 4小時(shí))，不可重疊擺放。陰干后裝入貯存袋(袋內(nèi)放干燥劑)，放入2 8°C冰箱可保存?zhèn)溆谩?7)微孔白色反應(yīng)板。本發(fā)明檢測G6PD缺乏癥試劑盒的主要工藝制備如下
(1 )G6P底物試劑干粉的制備將1. 2 g的G6P于專用桶內(nèi)，加適量純化水，充分?jǐn)嚢枞芙?。待完全溶解后，加?. 6g的NADP · Na2,補(bǔ)足純化水至100ml，混勻。分裝凍干即可。(2)6PG底物試劑干粉的制備將1. 5 g的6PG于專用桶內(nèi)，加適量純化水，充分?jǐn)嚢枞芙狻４耆芙夂?，加?.6 g的NADP ·Νει2，補(bǔ)足純化水至100ml，混勻。分裝凍干即可。(3)銅試劑的制備分別將0. 03gCuS04 ·5Η20、0. 05gNa2C03和0. 03g酒石酸鉀鈉加入到裝有純化水的專用容器中，待完全溶解后，補(bǔ)足純化水至100ml，混勻。(4)底物復(fù)溶試劑的制備將0.2 g Tris和5. 4 g NaCl加純化水，充分?jǐn)嚢枞芙?，待完全溶解后，加?. 8 g MgCl2和2. 5g雙甘氨酸，補(bǔ)足純化水至100ml，混勻。(5)G6PD質(zhì)控品，Cl陽性，C2陰性的制備將枸櫞酸抗凝全血用低速離心機(jī) 3000rmp，離心10 15min分離出血漿和紅細(xì)胞待用。將枸櫞酸抗凝綿羊全血用低速離心機(jī)3000rmp，離心10 15min分離出血漿和紅細(xì)胞。按比例(紅細(xì)胞血漿=1. 1 1.0) 調(diào)整紅細(xì)胞壓積；分別加入G6PD和6P⑶純品原料，使Cl全血中G6PD/6P⑶< 1. 0，C2全血中G6PD/6P⑶> 1. 0。將Cl、C2分別放在磁力攪拌器上不斷攪拌(避免產(chǎn)生氣泡)，充分混勻。將裁好的903#濾紙懸掛在架子上，用移液器將質(zhì)控品滴加到濾紙片上。取液量為 50ul/血斑，對準(zhǔn)中心滴下。室溫陰干(3 4小時(shí))，不可重疊擺放。陰干后裝入貯存袋(袋內(nèi)放干燥劑)，放入2 8 °C冰箱可保存?zhèn)溆谩?6)微孔白色反應(yīng)板； (7)貼標(biāo)簽;(8)成品組裝。上述步驟所得產(chǎn)品分裝即為半成品。抽出3份經(jīng)過特異性、精密性、靈敏度及穩(wěn)定性檢定合格才能組裝成新生兒篩查G6PD試劑盒(熒光比值法)。組裝完成后還需抽檢合格后才能出廠。實(shí)施例2本發(fā)明試劑盒的使用方法
以上實(shí)施例1制備的新生兒G6PD篩查試劑盒(熒光比值法)的具體操作如下 試劑準(zhǔn)備
底物的復(fù)溶G6P底物試劑干粉，6PG底物試劑干粉分別加16ml底物復(fù)溶試劑，混勻，靜置20分鐘；
銅試劑的冷卻試劑使用前須放入4°C冰箱中冷卻備用。檢驗(yàn)操作
加樣用打孔鉗從樣品濾紙干血片中打下下直徑約為3mm(l/8 inch)的樣本兩份(打下紙片須被血液浸透)，并依次分別加入G6PD和6P⑶測試的空白微孔中，每孔一片，一一對應(yīng)。控制打孔的一致性，使紙片盡量一致。加入底物向檢測G6PD熒光值的微孔中加入復(fù)溶好的G6PD底物試劑150μ1 ；向檢測6PGD熒光值的微孔中加入復(fù)溶好的6PGD底物試劑150μ1并加貼封片。孵育在室溫下，緩慢振蕩30分鐘。加入銅試劑孵育完成后，立即加入150μ1/孔冷的銅試劑工作液(剛從冰箱取出， 不復(fù)溫)，混勻。檢測使用對應(yīng)的程序進(jìn)行檢測，檢測工作在15分鐘內(nèi)完成(激發(fā)波長355nm，發(fā)射波長460nm)。結(jié)果分析將檢測得到的G6PD的熒光值(Si)與6P⑶的熒光值(S2)，計(jì)算S1/S2 的值，當(dāng)S1/S2彡1.0時(shí)，結(jié)果判斷為陽性，當(dāng)S1/S2 > 1.0時(shí)，結(jié)果判斷為陰性。實(shí)施例3本發(fā)明的試劑盒的分析性能評價(jià)指標(biāo)
以上實(shí)施例1制備的新生兒篩查測定G6PD試劑盒(熒光比值法)的性能評價(jià)指標(biāo)如
下
靈敏度測定由公司實(shí)驗(yàn)室建立的陽性參考品1套。陽性參考品為經(jīng)臨床檢測確定為 G6PD缺陷癥患者的標(biāo)本，由100份標(biāo)本組成。陽性參考品符合率(％)=實(shí)測陽性參考品數(shù)量/10*100%。表2本發(fā)明試劑盒的靈敏度測試 _
I陽性(比值< ι. ο) I陰性(比值> ι. 0)— 檢測結(jié)果IlOOIo
通過上表繼續(xù)可得陽性符合率為100%。特異性
陰性參考品符合率測定由公司實(shí)驗(yàn)室建立的陰性參考品1套。陰性參考品為經(jīng)臨床檢測確定G6PD正常的標(biāo)本，由100份標(biāo)本組成。陰性參考品符合率(％)=實(shí)測陰性參考品數(shù)量/10*100% 。表3本發(fā)明試劑盒的特異性測試 _
I陽性(比值<ι.ο) I陰性(比值>ι.ο)— 檢測結(jié)果|oIlOO通過上表計(jì)算可得陰性符合率為100%。精密性
批內(nèi)精密度
使用一個(gè)批次試劑，10孔平行測定陰性和陽性質(zhì)控品，計(jì)算測定結(jié)果的陰陽性符合度。表4本發(fā)明試劑盒的批內(nèi)精密度測試
權(quán)利要求
1.一種用于新生兒葡萄糖六磷酸脫氫酶缺乏癥篩查的試劑盒，其特征在于包括如下組分(1)16ml/瓶的G6P底物試劑干粉；(2)16ml/瓶的6PG底物試劑干粉；(3)35ml/瓶的銅試劑用硫酸銅、酒石酸鉀鈉及碳酸鈉制成；(4)G6PD濾紙干血片質(zhì)控品，Cl陽性，C2陰性；(5)35ml/瓶的底物復(fù)溶試劑用MgCl2、雙甘氨酸及Tris-Hcl制成；(6)微孔白色反應(yīng)板。
2.權(quán)利要求1所述用于新生兒葡萄糖六磷酸脫氫酶缺乏癥篩查的試劑盒的制備方法， 其特征在于包括如下步驟(1)制備G6P和6PG兩種底物試劑干粉、底物復(fù)溶試劑、銅試劑；(2)制備濾紙干血片質(zhì)控品；(3)分裝上述底物試劑干粉、底物復(fù)溶試劑、銅試劑；(4)貼標(biāo)簽;(5)組裝為成品試劑盒；步驟(1)中，G6P底物試劑的制備是將1.2g的G6P加純化水，充分?jǐn)嚢枞芙猓耆芙夂?，加?. 6 g的NADP · Na2,補(bǔ)足純化水至100ml，混勻；6PG底物試劑的制備是將1. 5 g的6PG加純化水，充分?jǐn)嚢枞芙猓耆芙夂?，加?. 6 g的NADP · Na2,補(bǔ)足純化水至 100ml，混勻；底物復(fù)溶試劑的制備是將0.2 g Tris和5. 4 g NaCl加純化水，充分?jǐn)嚢枞芙?，待完全溶解后，加?.8 g MgCl2和2. 5 g雙甘氨酸，補(bǔ)足純化水至100ml，混勻；銅試劑溶液的制備是分別將0. 03gCuS04 · 5H20、0. 05gNa2C03和0. 03g酒石酸鉀鈉加入到裝有純化水的容器中，待完全溶解后，補(bǔ)足純化水至100ml，混勻；步驟(2)中，所述濾紙干血片質(zhì)控品的制備方法如下將枸櫞酸抗凝綿羊全血用低速離心機(jī)3000rmp，離心l(Tl5min分離出血漿和紅細(xì)胞。
3.按紅細(xì)胞血漿=1.1:1.0調(diào)整紅細(xì)胞壓積；分別加入G6PD和6P⑶純品原料，使 Cl全血中G6PD/6P⑶< 1. 0，C2全血中G6PD/6P⑶> 1. 0 ；將Cl、C2分別放在磁力攪拌器上不斷攪拌，充分混勻；將裁好的903#濾紙懸掛在架子上，用移液器將質(zhì)控品滴加到濾紙片上。
4.取液量為50ul/血斑，對準(zhǔn)中心滴下，室溫陰干；Γ4小時(shí)，不可重疊擺放，陰干后裝入貯存袋，袋內(nèi)放干燥劑，放入2、°C冰箱保存?zhèn)溆?；步驟(3)中將步驟(2)中配制好的G6P底物試劑、6GP底物試劑、底物復(fù)溶試劑、銅試劑進(jìn)行分裝，將分裝好的G6P底物試劑、6GP底物試劑利用凍干機(jī)制成凍干粉。
5.權(quán)利要求1所述用于新生兒葡萄糖六磷酸脫氫酶缺乏癥篩查的試劑盒的使用方法， 其特征在于包括如下步驟(1)試劑準(zhǔn)備G6P底物試劑干粉，6PG底物試劑干粉分別加16ml底物復(fù)溶試劑，混勻， 靜置20分鐘；(2)檢驗(yàn)操作(a)加樣用打孔鉗從樣品濾紙干血片中打下下直徑為3mm或1/8英寸的樣本兩份， 打下紙片須被血液浸透，并依次分別加入G6PD和6P⑶測試的空白微孔中，每孔一片，一一對應(yīng)；(b)加入底物向檢測G6PD熒光值的微孔中加入復(fù)溶好的G6P底物試劑150μ1；向檢測 6PGD熒光值的微孔中加入復(fù)溶好的6PG底物試劑150μ1并加貼封片；(c)孵育在室溫下，緩慢振蕩30分鐘；(d)加入銅試劑孵育完成后，立即加入150μ1/孔冷的銅試劑工作液，混勻；(e)檢測使用對應(yīng)的程序進(jìn)行檢測，檢測工作在15分鐘內(nèi)完成，激發(fā)波長355nm，發(fā)射波長460nm ；(f)結(jié)果分析將檢測得到的G6PD的熒光值(Si)與6P⑶的熒光值(S2)，計(jì)算S1/S2的值，當(dāng)S1/S2彡1.0時(shí)，結(jié)果判斷為陽性，當(dāng)S1/S2 > 1.0時(shí)，結(jié)果判斷為陰性。
6.權(quán)利要求1所述用于新生兒葡萄糖六磷酸脫氫酶缺乏癥篩查的試劑盒的結(jié)果判斷方法，其特征在于包括如下步驟(1)檢測將加完銅試劑的微孔反應(yīng)板使用對應(yīng)的程序進(jìn)行檢測，檢測工作在15分鐘內(nèi)完成，激發(fā)波長355nm，發(fā)射波長460nm ；(2)結(jié)果分析將檢測得到的G6PD的熒光值(Si)與6P⑶的熒光值(S2)，計(jì)算S1/S2的值，當(dāng)S1/S2彡1.0時(shí)，結(jié)果判斷為陽性，當(dāng)S1/S2 > 1. 0時(shí)，結(jié)果判斷為陰性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于新生兒葡萄糖六磷酸脫氫酶缺乏癥篩查的試劑盒及其制備方法。本發(fā)明所述用于新生兒葡萄糖六磷酸脫氫酶缺乏癥篩查的試劑盒由底物試劑干粉、底物復(fù)溶試劑、銅試劑、反應(yīng)板以及濾紙干血片質(zhì)控品組成。本發(fā)明所述試劑盒的檢測結(jié)果準(zhǔn)確性和靈敏度高，穩(wěn)定性好，兼具經(jīng)濟(jì)、簡便、高效等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用于新生兒篩查工作中時(shí)，有利于提高雜合子的檢出率，增加判斷的準(zhǔn)確性。
文檔編號(hào)G01N33/52GK102519925SQ201110394189
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月2日
發(fā)明者何海榮, 馮健明, 吳道貧, 孫勇, 汪勤, 沈健, 王云愛, 趙可輝 申請人:廣州市豐華生物工程有限公司