專利名稱：一種分子檢測信號放大技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分子檢測技術(shù)。
技術(shù)背景
生物分子包括蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、糖類。分子檢測方法主要包括析免疫滲濾、免疫層析、生物芯片技術(shù)、PCR技術(shù)等。其中生物芯片技術(shù)又包括包括基因芯片、蛋白芯片、細胞芯片、組織芯片等，是一項集合了生命科學(xué)、微電子學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)和材料科學(xué)等眾多學(xué)科的生物高新技術(shù)，是高效大規(guī)模獲取核酸、蛋白質(zhì)等生物信息的重要手段，在基因表達譜研究、疾病分子檢測和大規(guī)模藥物篩選等眾多領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。目前生物芯片檢測普遍使用熒光檢測法，使用的材料如Cy3、Cy5、FITC等，直接或者間接標(biāo)記在DNA或RNA、抗體、蛋白等分子上，產(chǎn)生的熒光信號采用激光共聚焦掃描檢測。該方法的缺點是檢測靈敏度低、檢測儀器價格昂貴，另外熒光信號易飽和、易淬滅、且穩(wěn)定性差。從而限制了生物芯片的使用，尤其是在中小型醫(yī)療機構(gòu)的推廣和應(yīng)用。
量子點(quantum dots, QDs)又稱半導(dǎo)體量子點。由II-VI族元素(如硒化鎘、 硫化鎘等)或III-V族元素(如磷化銦、砷化銦)組成的尺寸< IOOnm的半導(dǎo)體納米晶體。 量子點具有表面積效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、微觀量子隧道效應(yīng)等獨特的物理和化學(xué)性質(zhì)，使其具有獨特的光學(xué)和電學(xué)性質(zhì)。量子點因其顆粒粒徑小，比表面積大，表面具有的活性位點多， 量子點存在諸如納米金、納米銀類似的作為電子傳遞載體，在還原劑存在下可催化Ag+還原成單質(zhì)Ag沉積于表面的催化能力。小尺寸效應(yīng)使量子點顆粒具有很強的催化還原作用，可以將周圍的銀離子還原成銀顆粒；而銀顆粒又可以催化還原周圍的銀離子。這種級聯(lián)瀑布催化作用使得銀顆粒越聚越多，緊緊包裹量子點顆粒積聚成團狀銀殼，形成幾乎肉眼可見的黑色顆粒，用普通的光鏡甚至肉眼即可觀測。Chou等在觀測組織內(nèi)量子點的分布情況時利用量子點的催化特性，通過組織切片銀增強染色法直接定性觀測了 Cdk/ZnS量子點在各組織內(nèi)的分布。同時與熒光成像方法相比較，銀染方法更能準(zhǔn)確定位量子點的分布情況， 不受生物體內(nèi)熒光猝滅因素影響，方法快速、直觀、簡便。許國峰等以人IgG為檢測對象，對量子點可視化檢測方法進行了研究。
TSA(tyramine signal amplification，酪胺信號放大)由 Bobrow 等人于 1989 年提出。TSA的原理是在辣根過氧化物酶的催化下大量酪胺分子沉積。1992年，Adams將TSA 的原理首先引入免疫組化，應(yīng)用于抗原或者抗體的檢測。與常規(guī)的生物素-鏈霉親和素方法相比，該技術(shù)可以將檢測靈敏度提高100至1000倍。TSA技術(shù)在免疫印跡、酶聯(lián)免疫等領(lǐng)域已得到了廣泛應(yīng)用。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對目前分子檢測方法中檢測信號易飽和、信號穩(wěn)定性差、檢測靈敏度低、檢測儀器價格昂貴的問題，提供一種檢測信號穩(wěn)定、檢測靈敏度高且不需要昂貴檢測儀器設(shè)備的檢測法。
本發(fā)明提供的技術(shù)解決方案是將將量子點標(biāo)記、酪胺信號放大技術(shù)以及銀增強信號放大技術(shù)相結(jié)合的檢測方法，將待檢測的生物分子與固定在固相上的探針、抗體、多肽、 抗原結(jié)合；核酸、抗原、抗體、多肽、蛋白與待檢測分子特異性結(jié)合；通過生物分子特異性結(jié)合將量子點引入到待測分子上；使用銀染試劑進行銀增強染色，使信號放大；所得信號可用普通的光學(xué)掃描儀器掃描分析也可用肉眼觀察。本方法一方面實現(xiàn)了生物分子的高靈敏度檢測，另一方面實現(xiàn)了生物分子的可視化檢測。
—種分子檢測信號放大技術(shù)檢測法，其特點包括以下步驟
一、基因芯片中的應(yīng)用
1.待測基因的純化、擴增與標(biāo)記純化方法參見分子克隆實驗指南(科學(xué)出版社， 作者J.薩姆布魯克)；基因擴增方法采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或反轉(zhuǎn)錄擴增聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR)；核酸標(biāo)記方法是對PCR的下游引物采用末端標(biāo)記法引入生物素，然后進行PCR或 RT-PCR 反應(yīng)。
2.芯片的制備和雜交在醛基修飾的玻璃片上點制所設(shè)計探針微陣列；將待檢測基因的PCR產(chǎn)物與基因芯片雜交。
3.酪胺信號放大過程將已經(jīng)雜交完成的基因芯片的相應(yīng)區(qū)域加入鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶(Str印tavidin-HRP)。通過靶標(biāo)上所標(biāo)記的生物素與鏈酶親和素特異性的結(jié)合引入HRP ；然后加入生物素標(biāo)記的酪胺(Biotin-Tyramine)，通過酶催化作用使大量標(biāo)記生物素的酪胺沉積。
4.量子點銀染過程在基因芯片的相應(yīng)區(qū)域加入鏈霉親和素標(biāo)記量子點 (Str印tavidin-QDs)。再次利用生物素與鏈霉親和素特異性的結(jié)合將量子點引入；加入銀染色試劑利用量子點小尺寸、催化還原作用，可以將周圍的銀離子還原成銀顆粒；而銀顆粒又可以催化還原周圍的銀離子。形成肉眼可見的檢測信號。
5.信號處理過程雜交信號可以肉眼觀察也可以用普通的光學(xué)掃描儀器掃描分析。
二、蛋白芯片中的應(yīng)用
1.芯片的制備在醛基修飾的玻璃片上點制抗原或抗體，封閉。
2.待測樣品與蛋白芯片特異性結(jié)合在蛋白芯片的相應(yīng)區(qū)域加入待測樣品。
3.生物素標(biāo)記的抗原或者抗體與蛋白芯片特異性結(jié)合在蛋白芯片的相應(yīng)區(qū)域加入生物素標(biāo)記的抗原或者抗體。
4.銀增強染色信號放大過程在蛋白芯片的相應(yīng)區(qū)域加入鏈霉親和素標(biāo)記量子點(Str印tavidin-QDs)。再次利用生物素與鏈霉親和素特異性的結(jié)合將量子點引入；加入銀染色試劑利用量子點小尺寸、催化還原作用，可以將周圍的銀離子還原成銀顆粒；而銀顆粒又可以催化還原周圍的銀離子。形成肉眼可見的檢測信號。
5.信號處理；雜交信號可以肉眼觀察也可以用普通的光學(xué)掃描儀器掃描分析。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點和效果
1.本方法提供一種分子檢測信號放大技術(shù)。該檢測方法具有較高的檢測靈敏度和特異性。
2.本方法檢測信號可以用普通的光學(xué)掃描儀器掃描分析或肉眼觀察，降低了分子檢測成本，有利于分子檢測技術(shù)推廣和應(yīng)用。
3.本方法檢測信號穩(wěn)定，有利于結(jié)果的保存和比較。


圖1為基因芯片的量子點標(biāo)記銀染可視化檢測法示意圖。
圖2為Ev71病毒的檢測結(jié)果信號掃描圖，比較Ev71病毒體外轉(zhuǎn)錄RNA模板為 (IO6Copies/ μ L至IO2Copies/ μ L)時雜交信號的強度。
圖3為輪狀病毒的檢測結(jié)果信號掃描圖，比較輪狀病毒體外轉(zhuǎn)錄RNA模板為 (IO6Copies/ μ L至IO2Copies/ μ L)時雜交信號的強度。
圖4為科薩齊Β3病毒、科薩齊Β4病毒、科薩齊Β5病毒、脊髓灰質(zhì)炎1病毒、脊髓灰質(zhì)炎2病毒、脊髓灰質(zhì)炎3病毒、艾科30病毒、科薩齊Α16病毒、腸道病毒71型和輪狀病毒病毒的檢測結(jié)果信號掃描圖。
圖5為檢測不同乙肝患者血清中的乙肝表面抗原HbsAg。結(jié)果信號掃描圖。
具體實施方式
實施實例1
檢測Ev71病毒和輪狀病毒
1.自制消化道病毒檢測基因芯片。
2.將Ev71病毒和輪狀病毒細胞培養(yǎng)液，按QIAamp Viral RNA Mini Kit核酸提取試劑盒OiIAGEN)說明書操作，得到純化的RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒I^rimeScript One Step RT-PCR Kit Ver. 2 (寶生物工程有限公司)進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為20 μ L :2 X One Step BufferlO μ L^PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 0. 8 μ L、0. 2 μ L(上游弓|物，10 μ M)、 1 μ L(下游引物，10 μ Μ)、RNA模板5 μ L，無核酸酶水補足體積至20 μ L體系。反應(yīng)條件 逆轉(zhuǎn)錄:50°C,30min ；預(yù)變性94°C，2min ；PCR 擴增:94°C，30s ；50°C，30s ；72°C, 30s ；延伸 72°C, IOmin0共45個循環(huán)于PCR擴增。
3.將已經(jīng)制備完成的基因芯片用0.2% SDS清洗20s，然后以去離子水清洗20s， 晾干備用。
4.分別以Ev71病毒和輪狀病毒外轉(zhuǎn)錄RNA為模板RT-PCR擴增，取模板濃度為 IO6Copies/ μ L、IO5Copies/ μ L、IO4Copies/ μ L、IO3Copies/ μ L 和 IO2Copies/ μ L 的 RT-PCR 擴增產(chǎn)物各取5 μ L分別與5 μ L雜交液(5 X SSC, 2. 5%甲酰胺，0. 2% SDS)均勻混合，將混合液加入到芯片相應(yīng)的區(qū)域，芯片置于雜交盒中，45°C溫育60min，雜交完成后芯片依次以洗液 A(1XSSC，0. 2% SDS)，洗液 B(0. 2XSSC)，洗液 C(0. 1 XSSC)各洗滌 20s，晾干。
5.取已經(jīng)雜交完成的基因芯片在相應(yīng)的區(qū)域加入Mi^ptavidin-HRP(1 500 稀釋，1XPBS-0. 5 % BSA) 10 μ L, 37 "C 溫育 30min，取出芯片用 PBST (1 XPBS+0. 05 % Tween20)重復(fù)洗滌三次每次20s，晾干；在相應(yīng)區(qū)域加入Biotin-Tyramine (1 1000稀釋， 1XPBS-0. 5% BSA) 10μ L，37°C溫育30min，取出芯片用PBST重復(fù)洗滌三次每次20s，晾干。
6.在相應(yīng)區(qū)域加入 Mi^ptavidin-QDs(l 50 稀釋，2XPBS-0. 1 % BSA-0. 01 %硫柳汞)，37°C溫育30min后用PBST洗滌三次每次20s，晾干；銀增強試劑A液和B液等體積混合，每個區(qū)域加混合液約30 μ L，避光顯色5-6min顯色，信號目視可見，顯色結(jié)束以去離子水沖洗。
7.雜交信號肉眼即可以觀察，用普通的光學(xué)掃描儀器掃描記錄并分析。
實施實例2
檢測科薩齊B3病毒、科薩齊B4病毒、科薩齊B5病毒、脊髓灰質(zhì)炎1病毒、脊髓灰質(zhì)炎2病毒、脊髓灰質(zhì)炎3病毒、艾科30病毒、科薩齊A16病毒、腸道病毒71型、輪狀病毒。
自制消化道病毒檢測基因芯片。
1.將科薩齊B3病毒、科薩齊B4病毒、科薩齊B5病毒、脊髓灰質(zhì)炎1病毒、脊髓灰質(zhì)炎2病毒、脊髓灰質(zhì)炎3病毒、艾科30病毒、科薩齊A16病毒、腸道病毒71、輪狀病毒細胞培養(yǎng)液，按QIAamp Viral RNA Mini Kit核酸提取試劑盒OiIAGEN)說明書操作，得到純化的 RNA溶液。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒I^rimeScript One Step RT-PCR Kit Ver. 2 (寶生物工程有限公司)進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為 20 μ L 10 μ U2 X One Step Buffer)、0· 8 μ L (PrimeScript IStep Enzyme Mix)、0· 2 μ L(上游引物，10 μ Μ)、1 μ L(下游引物，10 μ Μ)、5 μ L(LRNA 模板)，無核酸酶水補足體積至20 μ L體系。反應(yīng)條件逆轉(zhuǎn)錄5(TC，30min ；預(yù)變性94°C， 2min ；PCR 擴增-MV，30s ；50°C，30s ；72°C，30s ；延伸72°C，IOmin0 共 45 個循環(huán)于 PCR 擴增階段。
2.將已經(jīng)制備完成的基因芯片用0.2% SDS清洗20s，然后以去離子水清洗20s， 晾干備用。
3.分別以科薩齊B3病毒、科薩齊B4病毒、科薩齊B5病毒、脊髓灰質(zhì)炎1病毒、 脊髓灰質(zhì)炎2病毒、脊髓灰質(zhì)炎3病毒、艾科30病毒、科薩齊A16病毒、腸道病毒71和輪狀病毒體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板RT-PCR擴增，取模板濃度為IO4Copies/ μ L的RT-PCR擴增產(chǎn)物各取5yL分別與5yL雜交液(5XSSC，2. 5%甲酰胺，0. 2% SDS)均勻混合，將混合液加入到芯片相應(yīng)的區(qū)域，芯片置于雜交盒中，45°C溫育60min，雜交完成后芯片依次以洗液 AdXSSC,0. 2% SDS)，洗液 B(0. 2XSSC)，洗液 C(0. 1 XSSC)各洗滌 20s，晾干。
4.取已經(jīng)雜交完成的基因芯片在相應(yīng)的區(qū)域加入Mi^ptavidin-HRP(1 500 稀釋，1XPBS-0. 5 % BSA) 10 μ L, 37 "C 溫育 30min，取出芯片用 PBST (1 XPBS+0. 05 % Tween20)重復(fù)洗滌三次每次20s，晾干；在相應(yīng)區(qū)域加入Biotin-Tyramine (1 1000稀釋， 1XPBS-0. 5% BSA) 10μ L，37°C溫育30min，取出芯片用PBST重復(fù)洗滌三次每次20s，晾干。
5.在相應(yīng)區(qū)域加入 Mi^ptavidin-QDs(l 50 稀釋，2XPBS-0. 1 % BSA-0. 01 %硫柳汞)，37°C溫育30min后用PBST洗滌三次每次20s，晾干；銀增強試劑A液和B液等體積混合，每個區(qū)域加混合液約30 μ L，避光顯色5-6min顯色，信號目視可見，顯色結(jié)束以去離子水沖洗。
6.雜交信號肉眼即可以觀察，用普通的光學(xué)掃描儀器掃描記錄并分析。
實施實例3
檢測病人血清中的乙肝表面抗原HBsAg
芯片制備在醛基修飾的玻璃片上點制HBsAb (0. 5mg/mL) ；BSA (lmg/mL)陰性對照。在4°C下放置1 后用封閉液(lXPBS+25%小牛血清)封閉2h，然后用 PBST(lXPBS+0. 5%吐溫)洗三次晾干4°C保存?zhèn)溆谩?br> 1.取已制備好的芯片依次加入樣本血清(1 5稀釋)，37°C溫育30min，取出芯片用PBST(lXPBS+0. 05% Tween20)重復(fù)洗滌三次每次20s，晾干。
2.在相應(yīng)區(qū)域加入 HbsAb-Biotin(l 1000，1 XPBS-0. 5% BSA，lmg/mL) 37°C溫育30min，取出芯片用PBST(lXPBS+0. 05% Tween20)重復(fù)洗滌三次每次20s，晾干。
3.在相應(yīng)區(qū)域加入 Mi^ptavidin-QDs(l 50 稀釋，2XPBS-0. 1 % BSA-0. 01 %硫柳汞)，37°C溫育30min后用PBST洗滌三次每次20s，晾干；銀增強試劑A液和B液等體積混合，每個區(qū)域加混合液約30 μ L，避光顯色5-6min顯色，信號目視可見，顯色結(jié)束以去離子水沖洗。
4.檢測信號肉眼即可以觀察，用普通的光學(xué)掃描儀器掃描記錄并分析。
權(quán)利要求
1.一種生物分子檢測信號放大技術(shù)，其特征在于將量子點標(biāo)記的鏈霉親和素、抗原、抗體、多肽與固定在固相材料上的生物分子特異性結(jié)合過程、酪胺信號放大過程和銀增強染色信號放大過程。
2.如權(quán)利要求1所述量子點，其特征在于 量子點為直徑小于IOOnm半導(dǎo)體納米材料。
3.如權(quán)利要求2所述量子點，其特征在于量子點為由II-VI族或III-V族元素中兩種或兩種以上元素組成的以及由II-VI族或 III-V族元素與其他元素組成的納米顆粒。
4.如權(quán)利要求2所述量子點，其特征在于量子點為直徑在I-IOOnm之間，能夠發(fā)射熒光的具有核殼結(jié)構(gòu)的半導(dǎo)體納米晶體粒子，如:ZnS, CdS, HgS, CdSe, CdTe, MgSe, MgS, MgTe, ZnO, ZnTe, CdSe/HgSe, CdS/ZnS, CdS/ Ag2S, CdS/PbS, CdS/Cd(0H)2, CdS/HgS, CdSe/CdS, MgS，MgSe，MgTe，CaS，CaSe，CaTe，SrS, SrSe, BaS, BMe。由以上任意兩種及以上納米粒子組成和由一種及一種以上納米粒子為核形成的納米復(fù)合粒子。
5.如權(quán)利要求1所述固相材料，其特征在于固相材料包括玻璃、塑料、金屬、高分子材料和聚苯乙烯、NC膜、纖維素膜、96孔板。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于包括以下步驟(1)待檢測分子與探針分子特異性結(jié)合；(2)抗原或者抗體與待檢測分子特異性結(jié)合；(3)酪胺信號放大過程；(4)銀增強染色信號放大過程；(5)信號處理；
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于包括以下步驟(1)待檢測分子與探針分子特異性結(jié)合；(2)生物素標(biāo)記的抗原、抗體或蛋白與待檢測分子特異性結(jié)合；(3)量子點標(biāo)記的鏈霉親和素特異性結(jié)合；(4)銀增強染色信號放大過程；(5)信號處理；
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于包括以下步驟(1)待測基因的純化、擴增，對擴增的下游引物末端標(biāo)記法引入生物素進行核酸標(biāo)記；(2)雜交；(3)量子點標(biāo)記的鏈霉親和素特異性結(jié)合；(4)銀增強染色信號放大過程；(5)信號處理；
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于包括以下步驟(1)待測基因的純化、擴增，對擴增的下游引物末端標(biāo)記法引入生物素進行核酸標(biāo)記；(2)雜交；(3)酪胺信號放大過程；(4)銀增強染色信號放大過程；(5)信號處理；
10.根據(jù)權(quán)利要求6、9所述的檢測方法，其特征在于步驟(3)酪胺信號放大過程 在已經(jīng)完成特異性結(jié)合的相應(yīng)區(qū)域加入鏈酶親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶。通過生物素與鏈酶親和素特異性的結(jié)合引入HRP;然后加入生物素標(biāo)記的酪胺，通過酶催化作用使大量標(biāo)記生物素的酪胺分子沉積。
11.根據(jù)權(quán)利要求6、7、8、9所述的檢測方法，其特征在于步驟(4)銀增強染色信號放大過程在相應(yīng)區(qū)域加入鏈酶親和素標(biāo)記量子點。生物素與鏈霉親和素特異性的結(jié)合，將量子點引入到待檢測分子上；加入銀染色試劑利用量子點小尺寸催化還原作用，可以將周圍的銀離子還原成銀顆粒；而銀顆粒又可以催化還原周圍的銀離子，形成肉眼可見的檢測信號。
12.根據(jù)權(quán)利要求6、7、8、9所述的檢測方法，其特征在于步驟( 信號處理 信號可以肉眼觀察也可以用普通的光學(xué)掃描儀器掃描分析或普通成像儀器記錄。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是一種新的分子檢測信號放大技術(shù)。其特征在于將量子點標(biāo)記的鏈霉親和素、抗原、抗體、多肽等，通過酪胺信號放大和銀增強染色信號放大形成的一種生物分子高靈敏度檢測方法。該檢測方法包括以下步驟待檢測的生物分子與固定在固相材料上的核酸、抗體、抗原、多肽等相結(jié)合；通過生物分子特異性結(jié)合將量子點引入到待測分子上；使用銀染試劑對量子點進行銀增強染色，使信號放大；所得信號可用普通的光學(xué)掃描儀器掃描或普通的成像儀器分析，也可用肉眼觀察。本方法一方面實現(xiàn)了生物分子的高靈敏度檢測，另一方面降低了生物分子檢測的應(yīng)用成本。
文檔編號G01N33/53GK102492772SQ201110394708
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月2日
發(fā)明者劉琪琦, 張春, 彭賢慧, 王升啟, 陳蘇紅 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所