專利名稱：小分子有機物的量子點標記抗體非競爭均相免疫分析方法
技術領域：
本發(fā)明涉及小分子有機物(農(nóng)藥、藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物)的量子點標記抗體均相免疫分析技術。
背景技術：
環(huán)境和農(nóng)畜產(chǎn)品中農(nóng)藥、藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的殘留超標，對環(huán)境和環(huán)境生物構成一定威脅，影響食品安全和人類健康。加強環(huán)境和食品安全監(jiān)控，需要高效快速的分析技術。目前已報道的農(nóng)藥、藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物殘留的檢測方法主要有色譜法和色質(zhì)聯(lián)用法。采用這些方法需要昂貴的儀器設備、專業(yè)化的實驗室和訓練有素的專門人才， 樣品前處理要求高、過程復雜、速度慢，檢測成本高，特異性不強，難以適應大量樣品和現(xiàn)場快速檢測的要求。現(xiàn)有小分子有機物的免疫分析，通常采用聚苯乙烯微孔板作固相載體固定抗體或抗原，在固相和液相界面進行競爭性免疫反應，反應速度慢，需要通過洗滌方式將固、液兩相分離。其中酶聯(lián)免疫吸附分析需要加入酶的底物進行顯色反應后檢測，步驟較多且時間較長；放射性同位素標記免疫分析方法趨向于淘汰；以有機熒光分子作標記物的熒光免疫分析存在穩(wěn)定性差、易發(fā)生光漂白等問題，與化學發(fā)光免疫分析類似，經(jīng)典的熒光免疫分析容易受背景的干擾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是以高效水溶性量子點作為納米熒光探針標記抗目標分析小分子有機物(農(nóng)藥、藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物)抗體，建立一種特異性強、靈敏度高、簡便高效、用于目標分析小分子有機物快速檢測的量子點標記抗體非競爭均相免疫分析新技術。本發(fā)明的原理和技術方案是以激發(fā)波長寬、發(fā)射波長窄、熒光量子效率高、穩(wěn)定性好的水溶性量子點作為納米熒光探針，采用碳二亞胺法與抗目標分析農(nóng)藥、藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物抗體共價偶聯(lián)制備量子點標記抗體；將適量量子點標記抗體用磷酸鹽緩沖液稀釋成適當濃度，加入含對應目標分析物的標樣，與量子點標記抗體發(fā)生均相免疫反應，降低了量子點標記抗體的熒光強度(量子點標記抗體發(fā)生熒光淬滅)，同樣條件下以待測樣品和目標分析物空白代替標樣，設置樣品和空白對照反應體系；免疫反應平衡后，分別檢測空白對照體系的熒光強度Ftl和含對應目標分析物體系的熒光強度F，依據(jù)空白對照體系的熒光強度Ftl與標樣體系的熒光強度的比值FcZF的大小(即量子點標記抗體的熒光淬滅程度)與體系中對應目標分析物濃度在一定范圍內(nèi)成正比的規(guī)律，在條件優(yōu)化的基礎上建立免疫分析標準曲線；根據(jù)待測樣品的FcZF和所述免疫分析標準曲線，計算待測樣品中目標分析物的含量，建立高靈敏度快速檢測目標分析小分子有機物(農(nóng)藥、藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物)的量子點標記抗體非競爭均相免疫分析方法。本發(fā)明綜合利用免疫分析特異性強、量子點熒光性能優(yōu)異、均相免疫反應速度快、 平衡時間短、可直接進行熒光檢測等優(yōu)勢。與常規(guī)免疫分析技術相比，本發(fā)明所建立的量子點標記抗體非競爭均相免疫分析方法不僅特異性強、靈敏度高、重現(xiàn)性好，而且更加簡便高效，不需要進行固液分和顯色反應，檢測時間約為常規(guī)免疫分析的1/4，是對現(xiàn)有小分子有機物免疫分析技術的發(fā)展和創(chuàng)新，迄今尚未見同類報道，在環(huán)境和食品中農(nóng)藥、藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物等小分子有機物快速檢測方面具有很高的開發(fā)應用前景。


圖1為不同濃度氯氰菊酯與量子點標記抗氯氰菊酯抗體熒光強度變化的關系曲線。圖2為不同濃度氯霉素與量子點標記抗氯霉素抗體熒光強度變化的關系曲線。圖3為不同濃度雙酚A與量子點標記抗雙酚A抗體熒光強度變化的關系曲線。
具體實施例方式一、量子點標記抗氯氰菊酯抗體非競爭均相免疫分析技術實施例
采用水溶性碳二亞胺(EDO法(Greg Τ. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2ed 2008，p495-496)，將表面修飾有活性羧基的核殼結構(CdSe/SiS)熒光發(fā)射波長為625nmd 的高效水溶性量子點與對氯氰菊酯具特異性親和力的抗體共價偶聯(lián)，制備量子點標記抗氯氰菊酯抗體，經(jīng)透過分子量為5000的超濾離心管超濾純化后用含0. 5g/L疊氮化鈉和1M/L 甜菜堿、PH8. 3的硼酸鹽緩沖液溶解定容至1 μ moL/L，4°C保存?zhèn)溆茫R用前用0. 02mol/L、 pH7. 2 PBS 稀釋 400 倍。用0. 02mol/L、pH7. 2 PBS稀釋lmg/mL氯氰菊酯標樣的甲醇溶液，配置l(TlO_Vg/ mL氯氰菊酯標樣系列，分別與所述量子點標記抗氯氰菊酯抗體稀釋液等體積混合，在室溫下反應10 15min，同樣條件下分別以待測樣品和目標分析物空白代替標樣，設置樣品和空白對照反應體系。反應平衡后，在235nm的激發(fā)波長下分別檢測空白對照體系在625nm附近的最大熒光強度(Ftl)和含氯氰菊酯的體系相同波長的熒光強度(F)。優(yōu)化反應介質(zhì)、反應物濃度比、反應溫度和時間、激發(fā)波長與熒光發(fā)射波長等相關條件，選擇量子點標記抗氯氰菊酯抗體與氯氰菊酯免疫反應速度快、敏感性強、穩(wěn)定性好、 量子點標記抗體用量少、空白對照體系熒光強度(Ftl)與含氯氰菊酯體系的熒光強度(F)比值(Ftl/ F)高、背景干擾少的條件組合。在上述基礎上，依據(jù)空白對照體系熒光強度(Ftl)與含氯氰菊酯體系的熒光強度 (F)的比值(量子點標記抗體的熒光淬滅程度)與體系中氯氰菊酯濃度在一定范圍內(nèi)成正比的規(guī)律，建立氯氰菊酯的量子點標記抗體非競爭均相免疫分析標準曲線(見圖1)。根據(jù)樣品的Ftl/ F和標準曲線，計算樣品中氯氰菊酯的含量，對待測樣品中的氯氰菊酯進行定性定量快速檢測，從而建立高靈敏度快速檢測氯氰菊酯的量子點標記抗體非競爭均相免疫分析技術。二、量子點標記抗氯霉素抗體非競爭均相免疫分析技術實施例
采用水溶性碳二亞胺(EDO法(Greg Τ. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2ed 2008，p495-496)，將表面修飾有活性羧基的核殼結構(CdSe/SiS)熒光發(fā)射波長為625nmd 的高效水溶性量子點與對氯霉素具特異性親和力的抗體共價偶聯(lián)，制備量子點標記抗氯霉素抗體，經(jīng)透過分子量為5000的超濾離心管超濾純化后用含0. 5g/L疊氮化鈉和1M/L甜菜堿、PH8. 3的硼酸鹽緩沖液溶解定容至1 μ moL/L，4°C保存?zhèn)溆?，臨用前用0. 02mol/L、pH6. 8 PBS稀釋400倍。用0. 02mol/L、pH6. 8 PBS稀釋lmg/mL氯霉素標樣的甲醇溶液，配置廣10_Vg/mL 氯霉素標樣系列，分別與所述量子點標記抗氯霉素抗體稀釋液等體積混合，在室溫下反應 10 15min，同樣條件下分別以待測樣品和目標分析物空白代替標樣，設置樣品和空白對照反應體系；
反應平衡后，在235nm的激發(fā)波長下分別檢測空白對照體系625nm附近的熒光強度 (F0)和含氯霉素的體系相同波長的熒光強度(F)。優(yōu)化反應介質(zhì)、反應物濃度比、反應溫度和時間、激發(fā)波長與熒光發(fā)射波長等相關條件，選擇量子點標記抗氯霉素抗體與氯霉素免疫反應速度快、敏感性強、穩(wěn)定性好、量子點標記抗體用量少、空白對照體系熒光強度(Ftl)與含氯霉素體系的熒光強度(F)比值(Ftl/ F)高、背景干擾少的條件組合。在上述基礎上，依據(jù)空白對照體系熒光強度(Ftl)與含氯霉素體系的熒光強度(F) 的比值(量子點標記抗體的熒光淬滅程度)與體系中氯霉素濃度在一定范圍內(nèi)成正比的規(guī)律，建立氯霉素的量子點標記抗體非競爭均相免疫分析標準曲線(見圖2)。根據(jù)樣品的Ftl/ F和標準曲線，計算樣品中氯霉素的含量，對待測樣品中的氯霉素進行定性定量快速檢測， 從而建立高靈敏度快速檢測氯霉素的量子點標記抗體非競爭均相免疫分析技術。三、量子點標記抗雙酚A抗體非競爭免疫分析技術實施例
采用水溶性碳二亞胺(EDO法(Greg Τ. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2ed 2008，p495-496)，將表面修飾有活性羧基的核殼結構(CdSe/SiS)熒光發(fā)射波長為655nm 的高效水溶性量子點與對雙酚A具特異性親和力的抗體共價偶聯(lián)，制備量子點標記抗雙酚 A抗體，經(jīng)透過分子量為5000的超濾離心管超濾純化后用含0. 5g/L疊氮化鈉和1M/L甜菜堿、PH8. 3的硼酸鹽緩沖液溶解定容至1 μ moL/L，4°C保存?zhèn)溆?，臨用前用0. 02mol/L、pH7. 0 PBS稀釋400倍。用0. 02mol/L、ρΗ7· 0 PBS稀釋lmg/mL雙酚A標樣的甲醇溶液，配置1 IO-Vg/ mL雙酚A標樣系列，分別與所述量子點標記抗雙酚A抗體稀釋液等體積混合，在室溫下反應10 15min，同樣條件下分別以待測樣品和目標分析物空白代替標樣，設置樣品和空白對照反應體系。反應平衡后，在235nm的激發(fā)波長下分別檢測空白對照體系655nm附近的最大熒光強度(Ftl)和含雙酚A的體系相同波長的熒光強度(F)。優(yōu)化反應介質(zhì)、反應物濃度比、反應溫度和時間、激發(fā)波長與熒光發(fā)射波長等相關條件，選擇量子點標記抗雙酚A抗體與雙酚A免疫反應速度快、敏感性強、穩(wěn)定性好、量子點標記抗體用量少、空白對照體系熒光強度(Ftl)與含雙酚A體系的熒光強度(F)比值(Ftl/ F) 高、背景干擾少的條件組合。在上述基礎上，依據(jù)空白對照體系熒光強度(Ftl)與含雙酚A體系的熒光強度(F) 的比值(量子點標記抗體的熒光淬滅程度)與體系中雙酚A濃度在一定范圍內(nèi)成正比的規(guī)律，建立雙酚A的量子點標記抗體非競爭均相免疫分析標準曲線(見圖3)。根據(jù)樣品的Ftl/ F和標準曲線，計算樣品中雙酚A的含量，對待測樣品中的雙酚A進行定性定量快速檢測，從而建立高靈敏度快速檢測雙酚A的量子點標記抗體非競爭均相免疫分析技術。
權利要求
1.小分子有機物的量子點標記抗體非競爭均相免疫分析方法，其特征在于采用混合酸酐法或碳二亞胺法，將激發(fā)波長寬、熒光發(fā)射波長窄、穩(wěn)定性好、表面具有活性氨基的核殼結構高效水溶性量子點與抗目標分析小分子有機物抗體共價偶聯(lián)制備量子點標記抗體； 將量子點標記抗體用磷酸鹽緩沖液稀釋成適當濃度，加入含對應目標分析物的標準樣品混勻，進行均相免疫反應，同樣條件下以待測樣品和目標分析物空白代替標樣，設置樣品和空白對照反應體系；反應平衡后分別檢測空白對照體系的熒光強度Ftl和含對應目標分析物體系的熒光強度F，依據(jù)空白對照體系的熒光強度Ftl與標樣體系的熒光強度的比值FcZF的大小與體系中目標分析物濃度在一定范圍內(nèi)成正比的規(guī)律，在條件優(yōu)化的基礎上建立免疫分析標準曲線；根據(jù)待測樣品的FcZF和所述免疫分析標準曲線，計算待測樣品中目標分析物的含量，建立高靈敏度快速檢測目標分析小分子有機物的量子點標記抗體非競爭均相免疫分析方法。
全文摘要
小分子有機物的量子點標記抗體非競爭均相免疫分析方法，涉及用于小分子有機物高靈敏度快速檢測的納米熒光探針標記抗體非競爭均相免疫分析技術。以高效水溶性量子點標記抗目標分析小分子有機物抗體，將量子點標記抗體用磷酸鹽緩沖液稀釋后加入含對應目標分析小分子有機物的標準樣品進行均相免疫反應，同樣條件下以待測樣品和目標分析物空白代替標樣，設置樣品和空白對照反應體系；將反應平衡后的標樣、樣品及空白對照體系直接進行熒光檢測，依據(jù)空白對照體系和標樣體系熒光強度的比值大小與體系中對應目標分析物的濃度在一定范圍內(nèi)呈正比的原理和規(guī)律，建立高靈敏度快速檢測目標分析小分子有機物的量子點標記抗體非競爭均相免疫分析技術。
文檔編號G01N21/64GK102495210SQ20111039938
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月6日 優(yōu)先權日2011年12月6日
發(fā)明者馮大和, 劉曙照, 劉騰飛 申請人:揚州大學