專利名稱：小分子有機(jī)物的量子點(diǎn)標(biāo)記抗體多組分非競爭均相免疫分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及小分子有機(jī)物(農(nóng)藥、藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物)的量子點(diǎn)標(biāo)記抗體多組分非競爭均相免疫分析技術(shù)。
背景技術(shù)：
環(huán)境和農(nóng)畜產(chǎn)品中農(nóng)藥、藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的殘留超標(biāo)，對(duì)環(huán)境和環(huán)境生物構(gòu)成一定威脅，影響食品安全和人類健康。加強(qiáng)環(huán)境和食品安全監(jiān)測(cè)，需要高效快速的分析技術(shù)。目前已報(bào)道的農(nóng)藥、藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物多殘留的檢測(cè)方法主要有色譜法和色質(zhì)聯(lián)用法。采用這些方法需要昂貴的儀器設(shè)備、專業(yè)化的實(shí)驗(yàn)室和訓(xùn)練有素的專門人才， 樣品前處理要求高、過程復(fù)雜、速度慢，檢測(cè)成本高，特異性不強(qiáng)，難以適應(yīng)大量樣品和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的要求?，F(xiàn)有小分子有機(jī)物多組分免疫分析，通常采用在聚苯乙烯微孔板的不同部位固定不同抗體或抗原，通過空間分辨進(jìn)行不同免疫反應(yīng)，反應(yīng)在固相和液相界面進(jìn)行， 通過洗滌方式實(shí)現(xiàn)固液分離，操作復(fù)雜；或采用不同標(biāo)記物，如酶、熒光素等標(biāo)記不同抗體或抗原，反應(yīng)條件和檢測(cè)手段難以兼容。因此，真正意義上的小分子有機(jī)物多組分免疫分析技術(shù)尚待建立。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是以不同熒光發(fā)射波長的高效水溶性量子點(diǎn)作為納米熒光探針標(biāo)記抗不同目標(biāo)分析小分子有機(jī)物(農(nóng)藥、藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物)的抗體，建立一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡便高效、用于多種目標(biāo)分析物快速檢測(cè)的量子點(diǎn)標(biāo)記抗體非競爭多組分均相免疫分析技術(shù)。本發(fā)明的技術(shù)方案是以激發(fā)波長寬、熒光發(fā)射波長窄且互不干擾、熒光量子效率高、穩(wěn)定性好、表面具活性羧基的不同水溶性量子點(diǎn)作為納米熒光探針，采用碳二亞胺法分別標(biāo)記抗不同目標(biāo)分析物(農(nóng)藥、藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物)抗體；將不同的量子點(diǎn)標(biāo)記抗體用磷酸鹽緩沖液稀釋成適當(dāng)濃度的混合溶液，加入含對(duì)應(yīng)目標(biāo)分析物的混合標(biāo)樣，在均相體系中同時(shí)發(fā)生多種免疫反應(yīng)，同樣條件下以待測(cè)樣品和目標(biāo)分析物空白代替標(biāo)樣，設(shè)置樣品和空白對(duì)照反應(yīng)體系，量子點(diǎn)標(biāo)記抗體與對(duì)應(yīng)目標(biāo)分析物結(jié)合后發(fā)生熒光淬滅；將達(dá)到平衡的反應(yīng)體系在同一激發(fā)波長下直接進(jìn)行熒光掃描或多波長檢測(cè)，分別計(jì)算空白對(duì)照體系中各量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的特征熒光強(qiáng)度Ftl與標(biāo)樣體系中各對(duì)應(yīng)量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的特征熒光強(qiáng)度Fs之比值FcZFs ；在條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，依據(jù)FcZFs (特征熒光的淬滅程度)與對(duì)應(yīng)目標(biāo)分析物的濃度在一定范圍內(nèi)呈正比的規(guī)律以及待測(cè)樣品體系的FcZFs,計(jì)算待測(cè)樣品中各目標(biāo)分析物的含量，建立高靈敏度快速檢測(cè)多種目標(biāo)分析小分子有機(jī)物(農(nóng)藥、藥物、 環(huán)境內(nèi)分泌干擾物)的量子點(diǎn)標(biāo)記抗體多組分非競爭均相免疫分析方法。本發(fā)明綜合利用免疫分析特異性強(qiáng)、量子點(diǎn)熒光性能優(yōu)異、均相免疫反應(yīng)速度快、多種免疫反應(yīng)在均相體系中同時(shí)進(jìn)行、平衡時(shí)間短、反應(yīng)平衡后直接進(jìn)行熒光檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)。 與常規(guī)免疫分析技術(shù)相比，本發(fā)明所建立的量子點(diǎn)標(biāo)記抗體多組分非競爭均相免疫分析技術(shù)，可同時(shí)對(duì)多種目標(biāo)分析小分子有機(jī)物(農(nóng)藥、藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物)物進(jìn)行定性定量檢測(cè)，省去了固液分離和顯色反應(yīng)步驟，不僅特異性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好，而且更加簡便高效，檢測(cè)時(shí)間約為常規(guī)單組分ELISA的1/4，是對(duì)現(xiàn)有小分子有機(jī)物免疫分析技術(shù)的發(fā)展和創(chuàng)新，迄今尚未見同類報(bào)道，具有很高的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。另，本發(fā)明所述高效水溶性量子點(diǎn)在200 350nm范圍內(nèi)用同一波長紫外光激發(fā)， 發(fā)射半峰寬小于30nm、互不干擾的特征熒光，不同量子點(diǎn)的最大熒光波長的間隔>50nm，熒光量子效率高于60%。


圖1為量子點(diǎn)標(biāo)記抗農(nóng)藥抗體多組分非競爭均相免疫分析熒光光譜圖。圖2為量子點(diǎn)標(biāo)記抗藥物抗體多組分非競爭均相免疫分析熒光光譜圖。圖3為不同濃度氯霉素與量子點(diǎn)標(biāo)記抗氯霉素抗體熒光強(qiáng)度變化的關(guān)系曲線。
具體實(shí)施例方式一、量子點(diǎn)標(biāo)記抗農(nóng)藥抗體多組分非競爭均相免疫分析技術(shù)實(shí)施例1
將熒光發(fā)射波長為545nm、625nm、705nm的高效水溶性量子點(diǎn)采用碳二亞胺法(Greg Τ. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2ed 2008, p495-496) ^ !!^^ !^ 氰菊酯抗體、抗克百威抗體共價(jià)偶聯(lián)，分別制備熒光發(fā)射波長約為M5nm的量子點(diǎn)標(biāo)記抗烯效唑抗體、熒光發(fā)射波長約為625nm的量子點(diǎn)標(biāo)記抗氯氰菊酯抗體和熒光發(fā)射波長約為 705nm的量子點(diǎn)標(biāo)記抗克百威抗體，經(jīng)超濾純化后用pH8. 3、含0. 5g/L疊氮化鈉和lmol/ L甜菜堿的0. 05mol/L硼酸鹽緩沖液溶解定容至1 μ moL/L，4°C保存?zhèn)溆?，臨用前分別將所述量子點(diǎn)標(biāo)記抗烯效唑抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記抗氯氰菊酯抗體和量子點(diǎn)標(biāo)記抗克百威抗體用 0. 02mol/L、ρΗ7· 0的PBS稀釋100倍、200倍和50倍后等體積混合。先用甲醇配置含烯效唑、氯氰菊酯和克百威標(biāo)樣各lmg/mL的母液，再用0. 02mol/ L、pH7. 0 PBS稀釋成分別含烯效唑、氯氰菊酯和克百威標(biāo)樣標(biāo)樣10 10_Vg/mL的混合標(biāo)樣系列，同樣條件下以待測(cè)樣品和目標(biāo)分析物空白代替標(biāo)樣，設(shè)置樣品和空白對(duì)照。分別在IOOPL標(biāo)樣、待測(cè)樣品和空白對(duì)照溶液中加入等體積的所述量子點(diǎn)標(biāo)記抗體混合液，在室溫下混合反應(yīng)約10 15min。反應(yīng)平衡后在235nm激發(fā)波長下掃描(見圖1 所示)或分別檢測(cè)M5nm、625nm和705nm附近的最大特征熒光強(qiáng)度。優(yōu)化反應(yīng)介質(zhì)、反應(yīng)物濃度比、反應(yīng)溫度和時(shí)間、激發(fā)波長與熒光發(fā)射波長等相關(guān)條件，選擇量子點(diǎn)標(biāo)記抗體與對(duì)應(yīng)目標(biāo)分析物免疫反應(yīng)速度快、敏感性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、量子點(diǎn)標(biāo)記抗體用量少、空白對(duì)照體系熒光強(qiáng)度(Ftl)與含對(duì)應(yīng)目標(biāo)分析物體系的熒光強(qiáng)度(Fs) 比值高、背景干擾少的條件組合。在此基礎(chǔ)上，依據(jù)FcZFs (量子點(diǎn)標(biāo)記抗體熒光淬滅的程度)與對(duì)應(yīng)目標(biāo)分析物濃度在一定范圍內(nèi)成正比的規(guī)律以及各樣品的FcZFs，計(jì)算樣品中烯效唑、氯氰菊酯和克百威的含量，對(duì)待測(cè)樣品中的烯效唑、氯氰菊酯和克百威進(jìn)行定性定量快速檢測(cè)，從而建立烯效唑、氯氰菊酯和克百威的量子點(diǎn)標(biāo)記抗體多組分非競爭均相免疫分析技術(shù)。
二、量子點(diǎn)標(biāo)記抗藥物抗體多組分非競爭均相免疫分析技術(shù)實(shí)施例2
將熒光發(fā)射波長為545nm、625nm、705nm的高效水溶性量子點(diǎn)采用碳二亞胺法(Greg Τ. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2ed 2008, p495_496)與抗氯霉素抗體、抗己烯雌酚抗體、抗克倫特羅抗體共價(jià)偶聯(lián)，分別制備熒光發(fā)射波長約為M5nm的量子點(diǎn)標(biāo)記抗氯霉素抗體、熒光發(fā)射波長約為625nm的量子點(diǎn)標(biāo)記抗己烯雌酚抗體和熒光發(fā)射波長約為 705nm的量子點(diǎn)標(biāo)記抗克倫特羅抗體，經(jīng)超濾純化后的量子點(diǎn)標(biāo)記抗體用pH8. 3、含0. 5g/L 疊氮化鈉和lmol/L甜菜堿的0. 05mol/L硼酸鹽緩沖液溶解定容至1 μ moL/L, 4°C保存?zhèn)溆谩?臨用前分別將所述量子點(diǎn)標(biāo)記抗氯霉素抗體、量子點(diǎn)標(biāo)記抗己烯雌酚抗體和量子點(diǎn)標(biāo)記抗克倫特羅抗體用0. 02mol/L、pH7. 0的PBS稀釋100倍、200倍和50倍后等體積混合。先用甲醇配置含氯霉素、己烯雌酚和克倫特羅標(biāo)樣各lmg/mL的母液，再用 0. 02mol/L、pH7. 0 PBS稀釋成分別含氯霉素、己烯雌酚和克倫特羅標(biāo)樣1 10_Vg/mL的混合標(biāo)樣系列，同樣條件下以待測(cè)樣品和目標(biāo)分析物空白代替標(biāo)樣，設(shè)置樣品和空白對(duì)照。分別在IOOPL標(biāo)樣、待測(cè)樣品和空白對(duì)照溶液中加入等體積的所述量子點(diǎn)標(biāo)記抗體混合液，在室溫下混合反應(yīng)約10 15min。反應(yīng)平衡后在235nm激發(fā)波長下掃描(見圖2 所示)或分別檢測(cè)M5nm、625nm和705nm附近的最大特征熒光強(qiáng)度。優(yōu)化反應(yīng)介質(zhì)、反應(yīng)物濃度比、反應(yīng)溫度和時(shí)間、激發(fā)波長與熒光發(fā)射波長等相關(guān)條件，選擇量子點(diǎn)標(biāo)記抗體與對(duì)應(yīng)目標(biāo)分析物免疫反應(yīng)速度快、敏感性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、量子點(diǎn)標(biāo)記抗體用量少、空白對(duì)照體系熒光強(qiáng)度(Ftl)與含對(duì)應(yīng)目標(biāo)分析物反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度 (Fs)比值高、背景干擾少的條件組合。在此基礎(chǔ)上，依據(jù)FcZFs (反映量子點(diǎn)標(biāo)記抗體熒光淬滅的程度)與對(duì)應(yīng)目標(biāo)分析物濃度在一定范圍內(nèi)成正比的規(guī)律以及各樣品的FcZFs，計(jì)算樣品中氯霉素、己烯雌酚和克倫特羅的含量，對(duì)待測(cè)樣品中的氯霉素、己烯雌酚和克倫特羅進(jìn)行定性定量快速檢測(cè)，從而建立氯霉素、己烯雌酚和克倫特羅的量子點(diǎn)標(biāo)記抗體多組分非競爭均相免疫分析技術(shù)。不同濃度氯霉素與量子點(diǎn)標(biāo)記抗氯霉素抗體熒光強(qiáng)度變化的關(guān)系曲線，如圖3所示，F(xiàn)cZFs與氯霉素的濃度在一定范圍內(nèi)成正比。
權(quán)利要求
1.一種小分子有機(jī)物的量子點(diǎn)標(biāo)記抗體多組分非競爭均相免疫分析方法，其特征在于以激發(fā)波長寬、熒光量子效率高、熒光發(fā)射波長不同且互不干擾、穩(wěn)定性好、表面具有活性羧基的不同核殼結(jié)構(gòu)水溶性量子點(diǎn)作為納米熒光探針，采用碳二亞胺法標(biāo)記抗不同目標(biāo)分析小分子有機(jī)物的抗體；將不同量子點(diǎn)標(biāo)記抗體用磷酸鹽緩沖液稀釋配置混合溶液，加入含對(duì)應(yīng)目標(biāo)分析物的混合標(biāo)樣，在均相體系中同時(shí)發(fā)生多種免疫反應(yīng)，同樣條件下以待測(cè)樣品和目標(biāo)分析物空白代替標(biāo)樣，設(shè)置樣品和空白對(duì)照反應(yīng)體系；將達(dá)到平衡的反應(yīng)體系在同一激發(fā)波長下直接進(jìn)行熒光掃描或多波長檢測(cè)，分別計(jì)算空白對(duì)照體系中各量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的特征熒光強(qiáng)度Ftl與標(biāo)樣體系中各對(duì)應(yīng)量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的特征熒光強(qiáng)度Fs之比值；在條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，依據(jù)FcZFs與對(duì)應(yīng)目標(biāo)分析物的濃度在一定范圍內(nèi)呈正比的規(guī)律以及待測(cè)樣品體系的FcZFs,計(jì)算待測(cè)樣品中各目標(biāo)分析物的含量，建立高靈敏度快速檢測(cè)多種目標(biāo)分析小分子有機(jī)物的量子點(diǎn)標(biāo)記抗體非競爭多組分均相免疫分析方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述小分子有機(jī)物的量子點(diǎn)標(biāo)記抗體多組分非競爭均相免疫分析方法，其特征在于所述高效水溶性量子點(diǎn)在200 350nm范圍內(nèi)用同一波長激發(fā)光激發(fā)，發(fā)射半峰寬小于30nm、互不干擾的特征熒光，不同量子點(diǎn)的最大熒光波長的間隔>50nm，熒光量子效率高于60%。
全文摘要
小分子有機(jī)物的量子點(diǎn)標(biāo)記抗體多組分非競爭均相免疫分析方法，涉及小分子有機(jī)物的量子點(diǎn)標(biāo)記抗體多組分非競爭均相免疫分析技術(shù)。以熒光發(fā)射波長不同的高效水溶性量子點(diǎn)標(biāo)記抗不同目標(biāo)分析物的抗體。將不同的量子點(diǎn)標(biāo)記抗體分散于磷酸鹽緩沖液中，加入含對(duì)應(yīng)目標(biāo)分析物的標(biāo)樣溶液混勻進(jìn)行非競爭均相免疫反應(yīng)。將反應(yīng)平衡后的各標(biāo)樣、樣品及空白對(duì)照體系分別在同一波長紫外光激發(fā)下直接進(jìn)行熒光掃描或多波長檢測(cè)，依據(jù)空白對(duì)照體系的特征熒光強(qiáng)度與標(biāo)樣體系的特征熒光強(qiáng)度的比值大小與對(duì)應(yīng)目標(biāo)分析物的濃度在一定范圍內(nèi)呈正比的規(guī)律，建立高靈敏度快速檢測(cè)多種目標(biāo)分析小分子有機(jī)物的量子點(diǎn)標(biāo)記抗體多組分非競爭均相免疫分析技術(shù)。
文檔編號(hào)G01N33/542GK102495205SQ20111039938
公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月6日
發(fā)明者馮大和, 劉曙照, 徐科 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)