專利名稱：β-呋喃果糖苷酶酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種β -呋喃果糖苷酶酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
β -呋喃果糖苷酶(EC 3. 2. 1. 26),也稱轉(zhuǎn)化酶，主要來源于酵母。催化下列反應(yīng)， 蔗糖+水- 葡萄糖+果糖
該酶與蜂蜜中天然存在的蔗糖轉(zhuǎn)化酶催化產(chǎn)物相同，因此，不法分子常常在蜂蜜生產(chǎn)加工過程中非法使用呋喃果糖苷酶，以廉價(jià)的糖漿添加此酶假冒蜂蜜。如果在人工糖漿中添加此酶，可以用同位素分析法檢測(cè)，但是，若在C3糖(如甜菜糖)中加入此酶，則同位素分析法難以檢測(cè)出來。蜂蜜是一種天然產(chǎn)品，根據(jù)GB/T 18796—2005蜂蜜國家標(biāo)準(zhǔn)，蜂蜜中不得添加或混入任何糖類、代糖類物質(zhì)。假蜂蜜對(duì)社會(huì)造成了巨大危害。首先，蜂蜜造假使得蜂農(nóng)收入下降，從事養(yǎng)蜂的人越來越少；其二，隨著蜜蜂群的減少，整個(gè)生態(tài)環(huán)境也面臨巨大壓力， 帶來的直接后果是農(nóng)產(chǎn)品減產(chǎn)；第三，對(duì)蜂蜜產(chǎn)品行業(yè)的健康發(fā)展也造成了很大打擊，假蜂蜜生產(chǎn)企業(yè)獲利豐厚，真蜂蜜生產(chǎn)企業(yè)虧損累累。更為嚴(yán)重的是，消費(fèi)者花了三四倍的價(jià)錢買到的卻是假貨，損害了廣大消費(fèi)者的權(quán)益。出口蜂蜜造假，嚴(yán)重?fù)p害我國商品在國際市場(chǎng)的形象。蜂蜜中除了糖與水，還有礦物質(zhì)、維生素、膠體物質(zhì)、蛋白質(zhì)和氨基酸、芳香物質(zhì)及其他成分每100克蜂蜜中含有1200 1500微克乙酞膽堿，0. 0. 4%的抑菌素， 還含有松屬素類黃酮物質(zhì)、色素、激素等有效物質(zhì)和一些不明成分的物質(zhì)等。蜂蜜的價(jià)值與這些物質(zhì)密切相關(guān)，而假蜂蜜卻僅是糖的替代品，其營養(yǎng)價(jià)值遠(yuǎn)不及蜂蜜。目前，β -呋喃果糖苷酶檢測(cè)方法主要是高效液相色譜法，該方法儀器昂貴，檢測(cè)時(shí)間長，前處理復(fù)雜，不適合高通量、快速檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高靈敏度、能夠快速檢測(cè)蜂蜜中β -呋喃果糖苷酶含量的呋喃果糖苷酶酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題采取的技術(shù)方案
一種β-呋喃果糖苷酶酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其包括β-呋喃果糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)酶液、包被有β -呋喃果糖苷酶鼠單克隆抗體的酶標(biāo)板、樣品稀釋液、β -呋喃果糖苷酶兔多克隆抗體工作液、酶標(biāo)記二抗工作液、底物顯色液、濃縮洗滌液和終止液。所述β -呋喃果糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)酶液的濃度為10U/ml。所述包被有β-呋喃果糖苷酶鼠單克隆抗體的酶標(biāo)板的制備方法為用 5-50mmol/L碳酸緩沖液作為包被液稀釋?duì)?-呋喃果糖苷酶鼠單克隆抗體至2_2(^g/ml，混勻，加到96孔酶標(biāo)板中，每孔ΙΟΟμΙ，40C反應(yīng)14-16小時(shí)，然后倒掉孔中溶液，用所述濃縮洗滌液洗板4次，拍干，每孔加入150μ1封閉液，37°C封閉1小時(shí)，倒掉孔中溶液，濃縮洗滌液洗板4次，每孔加入200μ1保護(hù)劑，反應(yīng)1-2小時(shí)，倒掉保護(hù)劑，拍干，真空干燥，裝入鋁箔袋
真空密封保存。所述保護(hù)劑為8% (w/w)酶穩(wěn)定劑M。所述樣品稀釋液是在lOmmol/L pH7_10的碳酸鹽緩沖液中加入1% (w/w)小牛血清、0.05% (w/w) Tween-20 和 0. 01% (w/w)疊氮鈉制成。所述β -呋喃果糖苷酶兔多克隆抗體工作液是在封閉液中加入與所述封閉液質(zhì)量比為1:2000-5000的β-呋喃果糖苷酶兔多克隆抗體制成。所述酶標(biāo)記二抗工作液是在封閉液中加入與所述封閉液質(zhì)量比為1:5000-10000 的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體制成。所述封閉液是在0. lmol/L pH7. 2-7. 4磷酸緩沖液中加入5% (w/w)的小牛血清和 0. 05% (w/w) Tween-20 制成。所述底物顯色液包括A底物顯色液和B底物顯色液，所述A底物顯色液是由20mg TMB加IOml無水乙醇，充分震蕩溶解后加雙蒸水定容至IOOml制成，所述B底物顯色液是由 0. 47g 檸檬酸、1. 84g Na2HPO4. 12Η20，0· 75% (w/w)的過氧化氫尿素 0. 64ml，ρΗ5· 0-5. 4， 雙蒸水定容至IOOml制成，使用時(shí)所述A底物顯色液和B底物顯色液質(zhì)量比1 :1混合；所述濃縮洗滌液是在0. lmol/L pH7. 2-7. 4的磷酸鹽緩沖液中加入0. 05% (w/w) Tween-20和 0. 01% (w/w)的疊氮鈉制成；所述終止液為1. Omol/L的硫酸。本發(fā)明采用上述技術(shù)方案取得的有益效果是本發(fā)明試劑盒采用雙抗夾心ELISA 方法測(cè)定蜂蜜樣品中β “呋喃果糖苷酶的含量，劑量_反應(yīng)曲線的線性相關(guān)系數(shù)> 0. 980， R2=O. 9993，靈敏度為10U/KG，符合國家ELISA檢測(cè)質(zhì)量要求。本試劑盒板內(nèi)變異系數(shù)(CV%) 小于10%，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，精密度良好。本發(fā)明試劑盒的優(yōu)點(diǎn)是樣品處理簡單，檢測(cè)快速，檢測(cè)時(shí)間僅為2. 5小時(shí)，靈敏、準(zhǔn)確和高通量，為檢測(cè)蜂蜜造假提供了有效的手段。


圖1為本發(fā)明試劑盒的β -呋喃果糖苷酶劑量_反應(yīng)曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 抗體的制備與純化 1. 1鼠單克隆抗體的制備
選取健康的8周齡雌性BALB/C小鼠進(jìn)行β-呋喃果糖苷酶免疫，免疫劑量以β-呋喃果糖苷酶計(jì)每次50-100μβ/只，每次免疫間隔兩周，免疫5次。第一次免疫將免疫原β-呋喃果糖苷酶與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑注射，采用頸背部皮下多點(diǎn)注射，2-4次免疫將免疫原與等量的弗氏不完全佐劑混合制成乳化劑注射，采用頸背部皮下多點(diǎn)注射， 最后一次，不加佐劑進(jìn)行腹部加強(qiáng)免疫。最后一次免疫3天后取小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，制備雜交瘤細(xì)胞。篩選陽性細(xì)胞株，經(jīng)數(shù)次亞克隆，直至細(xì)胞株達(dá)到全陽性， 穩(wěn)定分泌呋喃果糖苷酶抗體后，進(jìn)行細(xì)胞凍存。培養(yǎng)該細(xì)胞株，注入致敏的小鼠腹腔， 收集腹水。經(jīng)辛酸_硫酸銨沉淀，葡萄球菌蛋白A-S印arose CL-4B柱純化，透析、凍干后保存。1.2兔多克隆抗體的制備選用健康的2公斤左右的新西蘭大白兔為免疫動(dòng)物，免疫劑量以β-呋喃果糖苷酶計(jì) 350μδ/只/次，頸背部皮下多點(diǎn)注射，每次免疫間隔為兩周，免疫六次。第一次免疫將抗原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，二到六次免疫將抗原與等量的弗氏不完全佐劑混合制成乳化劑。三免后開始監(jiān)測(cè)血清抗體效價(jià)。六免后7-10天頸動(dòng)脈采血，分離血清。經(jīng)硫酸銨沉淀，葡萄球菌蛋白A-S印arose CL-4B柱純化、透析、凍干后保存。實(shí)施例2 試劑盒的組建
本發(fā)明的ELISA試劑盒包括鼠抗β -呋喃果糖苷酶單克隆抗體包被的酶標(biāo)板，兔抗 β -呋喃果糖苷酶多克隆抗體、酶標(biāo)記二抗工作液、β “呋喃果糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液、 底物顯色液、濃縮洗滌液和終止液。2. 1酶標(biāo)板的包被
用棋盤法確定最適包被濃度，用包被液(5-50mmol/L碳酸緩沖液)稀釋步驟1. 1中所得單克隆抗體至2-2(^g/ml混勻，加到96孔酶標(biāo)板中，每孔ΙΟΟμΙ，4°C 14-16小時(shí)。倒掉孔中溶液，濃縮洗滌液洗板4次，拍干。每孔加入150μ1封閉液，37°C 1小時(shí)，倒掉孔中溶液，濃縮洗滌液洗板4次。每孔加入200μ1保護(hù)劑，反應(yīng)1-2小時(shí)。倒掉保護(hù)劑，拍干，真空干燥， 裝入鋁箔袋真空密封保存。2. 2所用試劑的配制
樣品稀釋液是在lOmmol/L pH7_10的碳酸鹽緩沖液中加入1% (w/w)小牛血清、0. 05% (w/w) Tween-20 和 0. 01% (w/w)疊氮鈉制成。封閉液是在0. lmol/L pH7. 2-7. 4磷酸緩沖液中加入5%(w/w)的小牛血清和0. 05% (w/w) Tween-20 制成。β -呋喃果糖苷酶兔多克隆抗體工作液是在封閉液中加入與所述封閉液質(zhì)量比為 1:2000-5000的β-呋喃果糖苷酶兔多克隆抗體制成。酶標(biāo)記二抗工作液是在封閉液中加入與所述封閉液質(zhì)量比為1:5000-10000的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體制成。底物顯色液包括A底物顯色液和B底物顯色液，所述A底物顯色液是由20mg TMB 加IOml無水乙醇，充分震蕩溶解后加雙蒸水定容至100ml制成，所述B底物顯色液是由 0. 47g檸檬酸、1. 84g Na2HPO4. 12Η20，0· 75% 的過氧化氫尿素0. 64ml，ρΗ5. 0-5. 4，雙蒸水定容至100ml制成，使用時(shí)所述A底物顯色液和B底物顯色液質(zhì)量比1 :1混合。濃縮洗滌液是在0. lmol/L ρΗ7· 2-7. 4的磷酸鹽緩沖液中加入0. 05% (w/w) Tween-20和0. 01% (w/w)的疊氮鈉制成。終止液為1. Omol/L的硫酸。實(shí)施例3蜂蜜樣品中β-呋喃果糖苷酶檢測(cè) 3. 1.樣品前處理
準(zhǔn)確稱取一定量蜂蜜樣品，加入3倍重量樣品稀釋液，50-80°C恒溫水浴5-10分鐘，取出，冷卻至室溫備用。3. 2試劑盒檢測(cè)
(1)取出包被好的酶標(biāo)板，每孔加入ΙΟΟμΙ標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，37°C孵育40分鐘。(2)洗板倒掉孔內(nèi)溶液，每孔加入洗滌液200-300μ1，倒掉洗滌液，反復(fù)3_4次， 將酶標(biāo)板拍干。
(3)加入ΙΟΟμΙ多抗工作液，37°C孵育40分鐘。(4)濃縮洗滌液洗板。(5)加入ΙΟΟμΙ酶標(biāo)二抗工作液，37°C孵育40分鐘。(6)濃縮洗滌液洗板。(7)加入ΙΟΟμΙ顯色液，37°C孵育10分鐘。(8)加入50μ1終止液終止反應(yīng)。(9)用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm和595nm波長吸光值(OD)值。3. 3結(jié)果分析
獲得的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品450nm OD值減去本底595nm OD值，以β -呋喃果糖苷酶濃度為縱坐標(biāo)，以減去本底的標(biāo)準(zhǔn)品OD值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算樣品450nm OD值減去本底595nm OD值，利用回歸方程計(jì)算樣品中β-呋喃果糖苷酶含量。實(shí)施例4 試劑盒靈敏度實(shí)驗(yàn)
準(zhǔn)確稱取一定量的封蓋蜜，加入3倍重量的樣品稀釋液，加入不同劑量β -呋喃果糖苷酶的標(biāo)準(zhǔn)液，配制成每公斤蜂蜜分別含0、5、10、20、40、80單位的β -呋喃果糖苷酶的標(biāo)準(zhǔn)品，用上述ELISA試劑盒的使用方法檢測(cè)，每個(gè)濃度設(shè)三個(gè)重復(fù)，結(jié)果見表1。表1標(biāo)準(zhǔn)品OD值測(cè)定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種β-呋喃果糖苷酶酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于其包括β-呋喃果糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)酶液、包被有β-呋喃果糖苷酶鼠單克隆抗體的酶標(biāo)板、樣品稀釋液、β-呋喃果糖苷酶兔多克隆抗體工作液、酶標(biāo)記二抗工作液、底物顯色液、濃縮洗滌液和終止液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呋喃果糖苷酶酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述 β -呋喃果糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)酶液的濃度為10U/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呋喃果糖苷酶酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述包被有β-呋喃果糖苷酶鼠單克隆抗體的酶標(biāo)板的制備方法為用5-50mmol/L碳酸緩沖液作為包被液稀釋?duì)?-呋喃果糖苷酶鼠單克隆抗體至2-2(^g/ml，混勻，加到96孔酶標(biāo)板中，每孔100μ1，4 反應(yīng)14-16小時(shí)，然后倒掉孔中溶液，用所述濃縮洗滌液洗板4次，拍干，每孔加入150μ1封閉液，37°C封閉1小時(shí)，倒掉孔中溶液，濃縮洗滌液洗板4次，每孔加入200μ1 保護(hù)劑，反應(yīng)1-2小時(shí)，倒掉保護(hù)劑，拍干，真空干燥，裝入鋁箔袋真空密封保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的呋喃果糖苷酶酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述保護(hù)劑為8% (w/w)酶穩(wěn)定劑Μ。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呋喃果糖苷酶酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述樣品稀釋液是在10mmol/L pH7_10的碳酸鹽緩沖液中加入1% (w/w)小牛血清、0. 05% (w/w) Tween-20 和 0. 01% (w/w)疊氮鈉制成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呋喃果糖苷酶酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述β-呋喃果糖苷酶兔多克隆抗體工作液是在封閉液中加入與所述封閉液質(zhì)量比為 1:2000-5000的β-呋喃果糖苷酶兔多克隆抗體制成。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呋喃果糖苷酶酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)記二抗工作液是在封閉液中加入與所述封閉液質(zhì)量比為1:5000-10000的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體制成。
8.根據(jù)權(quán)利要求3或6或7所述的β-呋喃果糖苷酶酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述封閉液是在0. lmol/L pH7. 2-7. 4磷酸緩沖液中加入5% (w/w)的小牛血清和0. 05% (w/w) Tween-20 制成。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呋喃果糖苷酶酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述底物顯色液包括A底物顯色液和B底物顯色液，所述A底物顯色液是由20mg TMB加IOml無水乙醇，充分震蕩溶解后加雙蒸水定容至IOOml制成，所述B底物顯色液是由0. 47g檸檬酸、1. 84g Na2HPO4. Iffl20,0. 75% (w/w)的過氧化氫尿素 0. 64ml, ρΗ5· 0-5. 4，雙蒸水定容至 IOOml制成，使用時(shí)所述A底物顯色液和B底物顯色液質(zhì)量比1 :1混合；所述濃縮洗滌液是在 0. lmol/L pH7. 2-7. 4 的磷酸鹽緩沖液中加入 0. 05% (w/w) Tween-20 和 0. 01% (w/w)的疊氮鈉制成；所述終止液為1. 0mol/L的硫酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種β-呋喃果糖苷酶酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其包括β-呋喃果糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)酶液、包被有β-呋喃果糖苷酶鼠單克隆抗體的酶標(biāo)板、樣品稀釋液、β-呋喃果糖苷酶兔多克隆抗體工作液、酶標(biāo)記二抗工作液、底物顯色液、濃縮洗滌液和終止液。本發(fā)明試劑盒采用雙抗夾心ELISA方法測(cè)定蜂蜜樣品中β-呋喃果糖苷酶的含量，劑量-反應(yīng)曲線的線性相關(guān)系數(shù)＞0.980，R2=0.9993，靈敏度為10U/KG，符合國家ELISA檢測(cè)質(zhì)量要求。本試劑盒板內(nèi)變異系數(shù)(CV%)小于10%，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，精密度良好。本發(fā)明試劑盒的優(yōu)點(diǎn)是樣品處理簡單，檢測(cè)快速，檢測(cè)時(shí)間僅為2.5小時(shí)，靈敏、準(zhǔn)確和高通量，為檢測(cè)蜂蜜造假提供了有效的手段。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102495211SQ20111040337
公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月7日
發(fā)明者史延茂, 吳萌, 李君華, 閆靜輝, 陳英珠, 齊穎穎 申請(qǐng)人:河北省科學(xué)院生物研究所