專利名稱：一種梅花莖尖染色體制片方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物染色體制片方法，具體涉及梅花莖尖染色體制片方法。
背景技術(shù)：
梅花(Primus mume Sieb. et Zucc.)是重要的觀賞花木，其遺傳育種方面的研究發(fā)展迅速。然而由于梅花染色體小，其染色體層面的研究極其局限。經(jīng)過現(xiàn)有文獻(xiàn)記載，梅的染色體數(shù)目據(jù)國外Okabe (1927，1929)報道是2n = 16， Μ。Oginuma等(1987,1989)發(fā)表是2n = 16。在國內(nèi)，主要是黃哲(1989)首次對梅花的染色體進(jìn)行了研究；黃燕文，包滿珠等(19%)對野梅、果梅和花梅染色體的數(shù)目及形態(tài)進(jìn)行了研究；林盛華、褚孟嫄(1999)對梅花染色體進(jìn)行了研究，鑒定梅品種資源的倍數(shù)性，為梅分類起源和遺傳育種提供細(xì)胞學(xué)依據(jù)。他們所采用的主要是涂片法和壓片法，其技術(shù)體系中存在一些問題各個處理時間不確定，制片技術(shù)耗時等；同時，取材受限于早春梅花發(fā)葉之前，取材時間短，時間受限。另外，染色壓片技術(shù)所制的的染色體標(biāo)本，尤其是卡寶染色，一方面由于染色，破壞了染色體結(jié)構(gòu)，無法進(jìn)行更高層次的熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)，另一方面，在實(shí)驗(yàn)初期的低溫掀片過程中，會損失大量分裂相，不利于實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。因此，只能用于常規(guī)觀察及初步核型分析，無法通過熒光原位雜交進(jìn)行精確核型分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種梅花莖尖染色體制片方法。本發(fā)明提供的梅花生長點(diǎn)染色體制片方法，其為選取梅花一年生枝條頂端生長點(diǎn)或經(jīng)修剪后新發(fā)出的頂端生長點(diǎn)最內(nèi)側(cè)的長度為0. 5 1. Ocm的部分，依次進(jìn)行卡諾固定液固定、前低滲處理、纖維素酶和果膠酶的酶解、后低滲處理，將處理后的頂端生長點(diǎn)進(jìn)行火焰干燥法制片。其中，所述的所述的火焰干燥法制片包括如下步驟切取莖尖基部，解剖針搗碎， 平攤于載玻片上，用鑷子剔除雜質(zhì)，滴卡諾固定液，載玻片置于酒精燈火焰上方，待載玻片上卡諾固定液燃燒，移開載玻片，直至載玻片干燥。其中，取材時間優(yōu)選為上午9:00 11:00。其中，前低滲處理溶液優(yōu)選為0. 075mol/L的KCl，處理時間優(yōu)選為30min。其中，用纖維素酶和果膠酶的酶溶液常溫酶解Ih 池，其中，所述酶溶液中，纖維素酶的濃度為2. 0 2. 5 %，果膠酶的濃度為2. 0 2. 5%。其中，用ddH20進(jìn)行后低滲處理，處理時間30min。本發(fā)明采用火焰法制片，省去預(yù)處理過程，直接固定，提高制片效率，拉長了染色體長度。此外，更重要的是解決了取材受限于早春的問題。本發(fā)明通過早春修剪梅花枝條， 獲得生長旺盛的生長點(diǎn)，用于制片。本發(fā)明還明確了各個處理環(huán)節(jié)的時間控制，找到了最佳的梅花染色體制片技術(shù)?？朔艘酝拿坊ㄈ旧w制片技術(shù)在處理時間過于籠統(tǒng)，操作性不強(qiáng)的問題。同時，火焰干燥法沒有染色和壓片過程，這樣在熒光原位雜交過程中避免了染色體結(jié)構(gòu)遭到破壞，并免去了低溫掀蓋玻片過程，能夠完好保存所有分裂相，保證良好的分裂相用于后期雜交實(shí)驗(yàn)。


圖 1圖 2圖 3圖 4
‘黃綠萼’ 一年生枝條生長點(diǎn)40倍鏡檢(火焰干燥法)。 ‘扣子玉蝶’ 一年生枝條生長點(diǎn)40倍鏡檢(火焰干燥法)。 ‘扣子玉蝶’ 一年生枝條生長點(diǎn)，100倍油鏡鏡檢(壓片法)。 ‘黃綠萼’ 一年生枝條生長點(diǎn)100倍油鏡鏡檢(壓片法)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1梅花品種(‘黃綠萼’)，于早上9:00，取一年生植株頂端生長點(diǎn)。直接使用卡諾固定液，低溫4°C固定20h ；固定后，用蒸餾水潤洗，吸水紙吸干，轉(zhuǎn)移至0. O75mol/LKC1溶液中，進(jìn)行前低滲30min;將前低滲處理后的頂端生長點(diǎn)用蒸餾水潤洗，吸水紙吸干，再用纖維素酶和果膠酶的酶溶液(纖維素酶0. 25g，果膠酶0. 25g，蒸餾水IOg)進(jìn)行酶解lh50min ； 酶解后，用蒸餾水潤洗，吸水紙吸干，使用ddH20進(jìn)行后低滲，低滲時間為30min ；切取莖尖基部，解剖針搗碎，平攤于載玻片上，將雜質(zhì)用鑷子剔除，滴固定液，于酒精燈上烤片。后在光學(xué)顯微鏡下觀察。鏡檢效果在40倍顯微鏡的情況下，有20%的細(xì)胞分裂相，染色體清晰可見，可以計數(shù)，長度適宜，這些細(xì)胞位置分布較為均勻。經(jīng)計數(shù)，梅花染色體2n = 16(圖1)。實(shí)施例2梅花品種(‘扣子玉蝶’)，于早上11:00，取修剪后發(fā)出的新梢的頂端生長點(diǎn)。直接使用卡諾固定液，低溫4°C固定20h ；固定后，用蒸餾水潤洗，吸水紙吸干，轉(zhuǎn)移至0. 075mol/ LKCl溶液中，進(jìn)行前低滲30min ；將前低滲處理后的頂端生長點(diǎn)用蒸餾水潤洗，吸水紙吸干，再用纖維素酶和果膠酶的酶溶液(纖維素酶0. 25g，果膠酶0. 25g，蒸餾水IOg)進(jìn)行酶解lh50min;酶解后，用蒸餾水潤洗，吸水紙吸干，使用ddH20進(jìn)行后低滲，低滲時間為 30min ；切取莖尖基部，解剖針搗碎，平攤于載玻片上，將雜質(zhì)用鑷子剔除，滴固定液，于酒精燈上烤片。后在光學(xué)顯微鏡下觀察。鏡檢效果在40倍顯微鏡的情況下，有20%的細(xì)胞分裂相，染色體清晰可見，可以計數(shù)，長度適宜，這些細(xì)胞位置分布較為均勻。經(jīng)計數(shù)，梅花染色體2n = 16(圖2)。比較例1梅花品種(‘黃綠萼’)，一年生植株頂端生長點(diǎn)，于早上9:00取材。使用飽和對二氯苯暗處理池；用蒸餾水潤洗，吸水紙吸干，轉(zhuǎn)移至卡諾固定液，低溫4°C固定20h;固定后，用蒸餾水潤洗，吸水紙吸干，轉(zhuǎn)移至0. O75mol/LKC1溶液中，進(jìn)行前低滲30min ；將前低滲處理后的頂端生長點(diǎn)用蒸餾水潤洗，吸水紙吸干，再用纖維素酶和果膠酶的酶溶液(纖維素酶0. 25g，果膠酶0. 25g，蒸餾水IOg)進(jìn)行酶解lh50min ；酶解后，用蒸餾水潤洗，吸水紙吸干，使用lmol/L鹽酸，于60°C恒溫水浴lOmin，進(jìn)行解離；解離后，用蒸餾水潤洗，吸水紙吸干，使用ddH20進(jìn)行后低滲，低滲時間為30min ；卡寶品紅溶液染色I(xiàn)Omin ；切取莖尖基部，解剖針搗碎，平攤于載玻片上，平攤面積盡量大，降低細(xì)胞重疊性，壓片后在光學(xué)顯微鏡下觀察。鏡檢效果在100倍顯微鏡的情況下，有50%的細(xì)胞分裂相，染色體分散良好，便于計數(shù)，長度適宜，這些細(xì)胞位置分布較為均勻。經(jīng)計數(shù)，梅花染色體2η = 16 (圖3)。比較例2梅花品種(‘扣子玉蝶’)，一年生植株頂端生長點(diǎn)，于早上9:00取材。使用飽和對二氯苯暗處理池；用蒸餾水潤洗，吸水紙吸干，轉(zhuǎn)移至卡諾固定液，低溫4°c固定20h ；固定后，用蒸餾水潤洗，吸水紙吸干，轉(zhuǎn)移至0. O75mol/LKC1溶液中，進(jìn)行前低滲30min ；將前低滲處理后的頂端生長點(diǎn)用蒸餾水潤洗，吸水紙吸干，再用纖維素酶和果膠酶的酶溶液(纖維素酶0. 25g，果膠酶0. 25g，蒸餾水IOg)進(jìn)行酶解lh50min ；酶解后，用蒸餾水潤洗，吸水紙吸干，使用lmol/L鹽酸，于60°C恒溫水浴lOmin，進(jìn)行解離；解離后，用蒸餾水潤洗，吸水紙吸干，使用ddH20進(jìn)行后低滲，低滲時間為30min ；卡寶品紅溶液染色I(xiàn)Omin ；切取莖尖基部，解剖針搗碎，平攤于載玻片上，平攤面積盡量大，降低細(xì)胞重疊性，壓片后在光學(xué)顯微鏡下觀察。鏡檢效果在100倍顯微鏡的情況下，有40%的細(xì)胞分裂相，染色體分散好，便于計數(shù)，長度適宜，這些細(xì)胞位置分布較為均勻。經(jīng)計數(shù)，梅花染色體2n = 16(圖4)。使用染色壓片法進(jìn)行染色體制片，所得分裂相清晰，能夠滿足傳統(tǒng)核型分析軟件的要求。但對于精確核型分析，無法使用染色壓片標(biāo)本進(jìn)行熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)。而火焰法無染色及壓片過程，能夠較好的滿足熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)要求，不破壞染色體結(jié)構(gòu)，不損失良好分裂相。同時，省去預(yù)處理、解離過程，使實(shí)驗(yàn)效率大大提高，并能得出與染色壓片法相同效果的細(xì)胞分裂相。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種梅花生長點(diǎn)染色體制片方法，其為選取梅花一年生枝條頂端生長點(diǎn)或經(jīng)修剪后新發(fā)出的頂端生長點(diǎn)最內(nèi)側(cè)的長度為0. 5 1. Ocm的部分，依次進(jìn)行卡諾固定液固定、前低滲處理、纖維素酶和果膠酶的酶解、后低滲處理，將處理后的頂端生長點(diǎn)進(jìn)行火焰干燥法制片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制片方法，其特征在于，所述的火焰干燥法制片包括如下步驟切取頂端生長點(diǎn)基部，解剖針搗碎，平攤于載玻片上，用鑷子剔除雜質(zhì)，滴卡諾固定液， 將載玻片置于酒精燈火焰上方，待載玻片上卡諾固定液燃燒，移開載玻片，直至載玻片干O
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制片方法，其特征在于，其中取材時間為上午9:00 11:00。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制片方法，其特征在于，前低滲處理溶液為0.075mol/L的 KCl，處理時間為30min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制片方法，其特征在于，其中用纖維素酶和果膠酶的酶溶液常溫酶解Ih 2h，其中，所述酶溶液中，纖維素酶的濃度為2. 0 2. 5%，果膠酶的濃度為 2. 0 2. 5%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制片方法，其特征在于，用ddH20進(jìn)行后低滲處理，處理時間 30mino
全文摘要
本發(fā)明公開了一種梅花生長點(diǎn)染色體制片方法，其為選取梅花一年生枝條頂端生長點(diǎn)或經(jīng)修剪后新發(fā)出的頂端生長點(diǎn)最內(nèi)側(cè)的長度為0.5～1.0cm的部分，依次進(jìn)行卡諾固定液固定、前低滲處理、纖維素酶和果膠酶的酶解、后低滲處理，將處理后的頂端生長點(diǎn)進(jìn)行火焰干燥法制片。本發(fā)明采用火焰法制片，省去預(yù)處理、解離、染色壓片過程，直接固定，提高制片效率，拉長了染色體長度。此外，更重要的是，所得制片能夠用于熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)，同時解決了取材受限于早春的問題。
文檔編號G01N1/28GK102564821SQ20111040692
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者張啟翔, 楊冰潔, 羅樂, 陳晶鑫 申請人:北京林業(yè)大學(xué)