專利名稱：調(diào)節(jié)細胞微絲動態(tài)新機制的發(fā)現(xiàn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明屬于基礎(chǔ)生命科學(xué)，生物化學(xué)，細胞生物學(xué)，分子生物學(xué)，腦科學(xué)，肌肉科學(xué)，神經(jīng)細胞骨架學(xué)和神經(jīng)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)學(xué)等多個領(lǐng)域，創(chuàng)新性地揭示了細胞微絲動態(tài)變化的新機理和神經(jīng)細胞形成及工作的最新原理。
背景技術(shù)：
:細胞微絲的動態(tài)和神經(jīng)細胞軸突及肌肉細胞的形成和功能，細胞分裂以及細胞運動等有密切的關(guān)系。通常認為，細胞內(nèi)微絲的形成和功能間接地被微絲結(jié)合蛋白(成核蛋白Arp2/3復(fù)合物,絲切蛋白cofilin等)的磷酸化影響,但微絲動態(tài)的基本機理仍然不清楚。還沒有關(guān)于既直接磷酸化肌動蛋白也以其磷酸化機理影響微絲動態(tài)的激酶的報道。模式生物秀麗線蟲和哺乳動物的神經(jīng)系統(tǒng)在形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)上是相似的；一個保存性基因在秀麗線蟲和哺乳動物的不同實驗系里能表達相同的功效。秀麗線蟲的unc-51基因編碼一個從線蟲到人類的進化上具有保存性的絲/蘇氨酸蛋白激酶，是神經(jīng)形成所必須的；這個基因的突變引起線蟲的神經(jīng)形成及運動的欠缺和短粗體形。揭示unc-51基因所編碼的蛋白激酶的底物和其生物化學(xué)功能的意義是重要的
發(fā)明內(nèi)容
: 本發(fā)明的目的在于揭示unc-51基因所編碼的蛋白激酶的重要底物和其生物化學(xué)功能，弄清楚神經(jīng)細胞形成的分子機理，為神經(jīng)和肌肉疾病的治療提供嶄新的原理和方法。本發(fā)明的內(nèi)容為:(I)首次揭示肌動蛋白既能和UNC-51激酶結(jié)合，更能作為此激酶的底物被磷酸化肌動蛋白和UNC-51激酶的結(jié)合如圖1，圖2和圖5所示。圖1是把表達UNC-51激酶蛋白的人胚腎HEKs293細胞的溶胞產(chǎn)物用于免疫印跡后的結(jié)果，這圖顯示在被轉(zhuǎn)染的HEKs293細胞內(nèi)，UNC-51激酶蛋白結(jié)合著肌動蛋白。圖2的體外酶聯(lián)免疫吸附測定結(jié)果顯示，來自秀麗線蟲及兔肌的肌動蛋白都能夠結(jié)合UNC-51激酶蛋白。圖5是激光掃描熒光共焦顯微鏡的圖像，這圖像顯示在非州綠猴腎細胞(C0S-7)質(zhì)基質(zhì)中，帶紅色熒光的顆粒狀UNC-51蛋白激酶和帶綠色螢光的顆粒狀肌動蛋白結(jié)合產(chǎn)生了顆粒狀的黃色熒光。圖3顯示UNC-51激酶在體外能夠磷酸化來自兔肌的肌動蛋白并自我磷酸化，ATP和GTP均可作為磷酸供體。圖4顯示秀麗線蟲和兔肌的肌動蛋白的絲氨酸被UNC-51激酶磷酸化。(2)首次揭示UNC-51蛋白激酶活性能輸送顆粒狀微絲到細胞質(zhì)基質(zhì)中去和圖6中無激酶活性的UNC-51突變蛋白(K39M)在細胞核周圍形成的積聚體相t匕，圖5顯示，過量表達UNC-51激酶蛋白(紅色)的C0S-7細胞中，UNC-51激酶活性能輸送粒狀肌動蛋白到細胞質(zhì)基質(zhì)中去。(3)首次揭示UNC-51蛋白激酶活性能夠誘導(dǎo)成神經(jīng)細胞瘤NlEl 15細胞變成多分枝的神經(jīng)性細胞
圖7顯示，UNC-51激酶活性能誘導(dǎo)成神經(jīng)細胞瘤N1E115細胞成為分叉神經(jīng)似的細胞。圖8表示UNC-51激酶活性通過對細胞內(nèi)肌動蛋白的磷酸化和運送顆粒狀肌動蛋白到細胞質(zhì)基質(zhì)中，誘導(dǎo)神經(jīng)軸突形成的模型。


:圖1肌動蛋白和UNC-51激酶的體內(nèi)結(jié)合圖2肌動蛋白和UNC-51激酶的體外結(jié)合圖3UNC-51激酶在體外磷酸化肌動蛋白并自我磷酸化圖4UNC-51激酶在體外磷酸化秀麗線蟲和兔肌的肌動蛋白的絲氨酸圖5UNC-51激酶活性能輸送粒狀肌動蛋白到細胞質(zhì)基質(zhì)中去圖6無激酶活性的UNC-51突變蛋白(K39M)和肌動蛋白在細胞核周圍形成積聚體圖7UNC-51激酶活性能誘導(dǎo)成神經(jīng)細胞瘤NlEl 15細胞成為分叉神經(jīng)似的細胞圖8UNC-51激酶活性通過對細胞內(nèi)肌動蛋白的磷酸化和輸送粒狀肌動蛋白誘導(dǎo)神經(jīng)軸突形成的模型
具體實施方式
:1UNC_51蛋白激酶和肌動蛋白結(jié)合的測定用細胞溶解 緩沖液溶解表達UNC-51蛋白激酶的HEK293細胞，得到的溶胞產(chǎn)物的上清用于免疫印跡。利用親和層析法從以上溶胞產(chǎn)物的上清純化得到UNC-51蛋白激酶。運用固相酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)分析肌動蛋白和UNC-51蛋白激酶的體外結(jié)合。2激酶活性的測定在含有50μΜ末端放射性表記的腺苷三磷酸[Υ-32Ρ]-ΑΤΡ或者鳥苷三磷酸[Y -32Pl-GTP的Ifepes激酶緩沖反應(yīng)液(pH7.4)中，進行了 UNC-51蛋白激酶磷酸化肌動蛋白的反應(yīng)。用6.5%的SDS-PAGE和X-線膠片放射自顯影法分析測定了激酶活性。薄層纖維素板(TLC)上的雙向分離電泳法用于磷酸化絲氨酸的同定。3激光掃描熒光共焦顯微鏡的觀察DAPI用于細胞核染色，TexasRed和FITC分別用于UNC-51和肌動蛋白的染色。ZeiSSLSM510共焦顯微鏡被用于細胞觀察和記錄。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了 UNC-51的激酶活性能夠直接地磷酸化肌動蛋白并和細胞微絲一起以粒狀構(gòu)造分布到細胞質(zhì)基質(zhì)。UNC-51是第一個既磷酸化肌動蛋白也直接地影響微絲構(gòu)造和分布的激酶。其關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)為:在試管內(nèi)的生化實驗中，UNC-51的激酶活性直接地磷酸化非肌肉細胞肌動蛋白，肌肉細胞肌動蛋白和秀麗線蟲肌動蛋白，在試管內(nèi)和在活體內(nèi)的生化實驗中，UNC-51結(jié)合非肌肉細胞肌動蛋白，肌肉細胞肌動蛋白或秀麗線蟲肌動蛋白。
2.在活體內(nèi)的生化實驗中，UNC-51和細胞微絲一起成為粒狀構(gòu)造和運輸粒狀構(gòu)造微絲到細胞質(zhì)基質(zhì)。
纖維狀微絲+UNC-51+ATP(GTP)—磷酸化粒狀微絲+ADP (⑶P)
3.上記二項要求的技術(shù)原理在生命科學(xué)，腦科學(xué)，腫瘤科學(xué)，計算機科學(xué)，宇宙科學(xué)，交通科學(xué)，醫(yī)學(xué)，藥學(xué)和制藥學(xué)，中藥科學(xué)，各種疾病的治療法，醫(yī)療技術(shù)以及所有其他方面的應(yīng)用和推廣。
全文摘要
神經(jīng)細胞是一種由軸突，樹突和細胞體構(gòu)成的重要極性細胞。軸突的形成是神經(jīng)細胞分化形成的形態(tài)指標。細胞骨架的動態(tài)變化是軸突形成所必須的。由肌動蛋白聚合而成的微絲是重要的細胞骨架之一，其動態(tài)變化的分子機理還不清楚。本研究首次發(fā)現(xiàn)，從秀麗線蟲到哺乳動物具有保守性的UNC-51蛋白激酶既能結(jié)合又能磷酸化肌動蛋白，而且能使微絲形成顆粒狀分布并輸送顆粒狀微絲到細胞質(zhì)基質(zhì)中去；UNC-51蛋白激酶還能把N1E115神經(jīng)瘤細胞誘導(dǎo)變成分叉神經(jīng)狀細胞；無激酶活性的UNC-51突變體(K39M)蛋白則與微絲一起在細胞核周圍形成積聚體構(gòu)造物，不能誘導(dǎo)N1E115細胞成為分叉神經(jīng)狀細胞。根據(jù)以上發(fā)現(xiàn)結(jié)果，提出以下模型UNC-51蛋白激酶通過直接地磷酸化肌動蛋白和輸送顆粒狀微絲到細胞質(zhì)基質(zhì)中的分子機理來調(diào)節(jié)細胞骨架的動態(tài)變化，進而調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞軸突的形成和功能。
文檔編號G01N33/573GK103160569SQ20111040776
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月9日
發(fā)明者田懷澤, 李素云, 田華希 申請人:彩虹天健康科技研究(北京)有限責(zé)任公司