專利名稱：枸杞多糖提取物中枸杞多糖的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測方法，具體是枸杞多糖提取物中枸杞多糖的檢測方法。背景技術(shù)：
枸杞多糖是一種由酸性雜多糖與多肽或蛋白質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合多糖，具有抗菌、抗腫瘤、抗衰老的功效，同時也是枸杞子降血糖、降血壓、降脂、抗炎等的活性物質(zhì)。枸杞多糖具有分子量大、結(jié)構(gòu)組成極為復(fù)雜的特點(diǎn)，主要由半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、甘露糖等單糖復(fù)合組成。2010版中華人民共和國藥典用硫酸苯酚顯色，紫外分光光度法測定吸光值，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定枸杞多糖結(jié)果，結(jié)果以葡萄糖計。該法為枸杞子中藥材質(zhì)量鑒別項(xiàng)下檢測方法，對于判斷枸杞子質(zhì)量優(yōu)劣具有適宜性。但是，枸杞多糖提取物涉及到提取、純化、濃縮與干燥等工藝過程，從外觀上無法象枸杞子一樣判斷其真實(shí)來源。因此，簡單地采用上述藥典中方法檢測枸杞多糖提取物中枸杞多糖的含量，不具備科學(xué)性，不能識別摻假形象，如摻兌葡萄糖、麥芽糊精等。前期我們通過市場上的枸杞多糖提取物樣品進(jìn)行了檢測，充分證明了這一點(diǎn)。采用硫酸苯酚法顯色，枸杞多糖中6種單糖在紫外分光光度計下吸光值差別較大，因此用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算枸杞多糖含量是欠科學(xué)的，嚴(yán)格地講應(yīng)該用枸杞多糖純品來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，但是制備枸杞多糖純品非常復(fù)雜，且性質(zhì)不穩(wěn)定，不能長期貯存，所以通過分析單糖組成，采用本法檢測枸杞多糖含量更具有簡便性、科學(xué)性。曰

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對現(xiàn)有檢測方法中所存在的問題而提出的一種枸杞多糖提取物中枸杞多糖的檢測方法，本方法是對現(xiàn)有方法的改良，也是對現(xiàn)有方法的完善。本方法是將枸杞多糖提取物進(jìn)行水解、衍生轉(zhuǎn)化為可供氣相色譜分析的樣品，檢測其單糖組成，根據(jù)單糖組成配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，用硫酸苯酚進(jìn)行顯色反應(yīng)，用紫外分光光度計測定吸光值，從而計算出枸杞多糖含量；通過對本方法進(jìn)行方法學(xué)考察，檢測結(jié)果具有良好的重復(fù)性與準(zhǔn)確性，回收率大于80%，RSD值小于10% ；靈敏度高，適宜于枸杞多糖提取物中枸杞多糖的定性、定量分析。本檢測方法包括兩大部分，第一部分為單糖組成分析，步驟包括a e ；第二部分為在第一部分基礎(chǔ)上，根據(jù)單糖組成，配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用硫酸苯酚法進(jìn)行顯色，在紫外分光光度計下測定吸光值，測定枸杞多糖含量，步驟包括f i。具體檢測步驟如下
a.氣相色譜法對照品溶液的制備
內(nèi)標(biāo)溶液精密稱取赤蘚醇約ang，用吡啶溶解定容到10ml，混勻備用； 混合單糖貯備液精密稱取葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖各約 10mg，用吡啶溶解定容到IOml，混勻備用。b.對照品溶液的檢測 ①色譜條件
氣相色譜儀Agilent 6890N
色譜柱DB - 1701毛細(xì)管色譜柱，30mX0. 32mmX0. 25 μ m進(jìn)樣口條件載氣為氮?dú)?，純度大?9. 999% ；溫度250°C ；分流模式，分流比20:1 柱溫箱條件初溫190°C，保持5min，以8°C /min升到260°C 柱參數(shù)恒流模式，流速1. 5ml/min
檢測器條件氫火焰檢測器，溫度260°C，H2流量30ml/min，Air流量350ml/min，尾吹氣氮?dú)饬髁?5ml/min
理論塔板數(shù)以赤蘚醇計不低于5000。②檢測方法
在混合單糖貯備液中加入赤蘚醇內(nèi)標(biāo)溶液0. 1ml，混勻，加入IOmg鹽酸羥胺，充分振蕩溶解，于90°C水浴反應(yīng)30min，取出，冷卻到室溫，加入Iml無水醋酸酐，于90°C水浴?；磻?yīng)30 min，取出冷卻后真空濃縮蒸干，殘渣加入Iml氯仿溶解，進(jìn)行氣相色譜分析，自動進(jìn)樣器進(jìn)樣，進(jìn)樣量lul，得出對照品色譜圖。c.供試品的制備
稱取10 mg枸杞多糖提取物樣品于安瓿瓶中，加入2 ml2 mol/L的三氟乙酸，封管后置于120°C干燥箱中水解，池后取出冷卻，離心后取上清液，真空濃縮至干，得枸杞多糖水解產(chǎn)物，置于干燥箱中備用。在上述備用的枸杞多糖水解產(chǎn)物中，加入IOmg鹽酸羥胺及Iml無水吡啶，加入內(nèi)標(biāo)溶液0. Iml ；充分振蕩溶解，于90°C水浴反應(yīng)30min，取出，冷卻到室溫，加入Iml無水醋酸酐，于90°C水浴?；磻?yīng)30min，取出冷卻后真空濃縮蒸干，殘渣加入Iml氯仿溶解，得供試品溶液。d.供試品的檢測
取上述待測供試品溶液Iml，置自動進(jìn)樣器樣品瓶中，在與對照品溶液檢測相同的色譜條件下自動進(jìn)樣分析，得出供試品圖譜。e.檢測結(jié)果分析
將供試品檢測出的色譜圖與對照品色譜圖進(jìn)行比對，對色譜峰進(jìn)行確認(rèn)、定性；以赤蘚醇對應(yīng)的譜峰作為內(nèi)標(biāo)，并根據(jù)相應(yīng)峰面積用內(nèi)標(biāo)法計算出各單糖的含量。f.硫酸苯酚法對照品溶液的制備
根據(jù)步驟f中檢測出的枸杞多糖中單糖組成及含量，按組成比例分別精確稱取6種單糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)共約12mg至IOOml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻得每毫升含糖 0. 12mg的糖對照品溶液。g.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
精密吸取溶液0. Iml, 0. 2ml, 0. 4ml, 0. 6ml, 0. 8ml，lml，分別置于IOml具塞比色管中， 加水補(bǔ)至anl，加入5%苯酚溶液1ml，搖勻，迅速加入濃硫酸5ml，搖勻，置沸水浴中煮沸 15min，取出冷卻至室溫，以相應(yīng)試劑為空白，490nm波長處測定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，糖對照品溶液不同的稀釋濃度C為橫坐標(biāo)，繪制糖對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線C=kA+b。h.供試品溶液的制備
稱取枸杞多糖提取物樣品約0. 25g，于150ml具塞錐形瓶中，精密加入蒸餾水20ml，超聲溶解，取Iml溶液于50ml離心管中，加入無水乙醇19ml使溶液含醇量為95%，渦旋混勻， 于離心機(jī)中，以9600轉(zhuǎn)/分，離心15分鐘，棄去上清液，殘渣加水溶解，定容至100ml，作為供試品溶液備用。
i.供試品的檢測
精密吸取供試品溶液1ml，加水至anl，照g步驟中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下的方法，自“加入5%苯酚溶液Iml ”起，依上述方法測定吸光度A1,從糖對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出吸光度A1所對應(yīng)的供試品溶液中糖的濃度，并依式
權(quán)利要求
1.枸杞多糖提取物中枸杞多糖的檢測方法，其特征在于包括下述步驟a.氣相色譜法對照品溶液的制備內(nèi)標(biāo)溶液精密稱取赤蘚醇約ang，用吡啶溶解定容到10ml，混勻備用；混合單糖貯備液精密稱取葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖各約 10mg，用吡啶溶解定容到10ml，混勻備用；b.對照品溶液的檢測①色譜條件氣相色譜儀Agilent 6890N色譜柱DB - 1701毛細(xì)管色譜柱，30mX0. 32mmX0. 25 μ m進(jìn)樣口條件載氣為氮?dú)?，純度大?9. 999% ；溫度250°C ；分流模式，分流比20:1柱溫箱條件初溫190°C，保持5min，以8°C /min升到260°C柱參數(shù)恒流模式，流速1. 5ml/min檢測器條件氫火焰檢測器，溫度260°C，H2流量30ml/min，Air流量350ml/min，尾吹氣氮?dú)饬髁?5ml/min理論塔板數(shù)以赤蘚醇計不低于5000 ；②檢測方法在混合單糖貯備液中加入赤蘚醇內(nèi)標(biāo)溶液0. 1ml，混勻，加入IOmg鹽酸羥胺，充分振蕩溶解，于90°C水浴反應(yīng)30min，取出，冷卻到室溫，加入Iml無水醋酸酐，于90°C水浴?；磻?yīng)30 min，取出冷卻后真空濃縮蒸干，殘渣加入Iml氯仿溶解，進(jìn)行氣相色譜分析，自動進(jìn)樣器進(jìn)樣，進(jìn)樣量lul，得出對照品色譜圖；c.供試品的制備稱取10 mg枸杞多糖提取物樣品于安瓿瓶中，加入aiil2 mol/L的三氟乙酸，封管后置于120°C干燥箱中水解，池后取出冷卻，離心后取上清液，真空濃縮至干，得枸杞多糖水解產(chǎn)物，置于干燥箱中備用；在上述備用的枸杞多糖水解產(chǎn)物中，加入IOmg鹽酸羥胺及Iml無水吡啶，加入內(nèi)標(biāo)溶液0. Iml ；充分振蕩溶解，于90°C水浴反應(yīng)30min，取出，冷卻到室溫，加入Iml無水醋酸酐， 于90°C水浴?；磻?yīng)30min，取出冷卻后真空濃縮蒸干，殘渣加入Iml氯仿溶解，得供試品溶液；d.供試品的檢測取上述待測供試品溶液Iml，置自動進(jìn)樣器樣品瓶中，在與對照品溶液檢測相同的色譜條件下自動進(jìn)樣分析，得出供試品圖譜；e.檢測結(jié)果分析將供試品檢測出的色譜圖與對照品色譜圖進(jìn)行比對，對色譜峰進(jìn)行確認(rèn)、定性；以赤蘚醇對應(yīng)的譜峰作為內(nèi)標(biāo)，并根據(jù)相應(yīng)峰面積用內(nèi)標(biāo)法計算出各單糖的含量；f.硫酸苯酚法對照品溶液的制備根據(jù)步驟f中檢測出的枸杞多糖中單糖組成及含量，按組成比例分別精確稱取6種單糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)共約12mg至IOOml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻得含糖0. 12mg/ml 的糖對照品溶液；g.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作精密吸取溶液0. Iml，0. 2ml，0. 4ml，0. 6ml，0. 8ml，Iml，分別置10 ml具塞比色管中，加水補(bǔ)至2ml，加入5%苯酚溶液Iml，搖勻，迅速加入濃硫酸5ml，搖勻，置沸水浴中煮沸15分鐘，取出冷卻至室溫，以相應(yīng)試劑為空白，490nm波長處測定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)， 糖對照品溶液不同的稀釋濃度C為橫坐標(biāo)，繪制糖對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線C=kA+b ；h.供試品溶液的制備稱取枸杞多糖提取物樣品約0. 25g，于150ml具塞錐形瓶中，精密加入蒸餾水20ml，超聲溶解，取Iml溶液于50ml離心管中，加入無水乙醇19ml使溶液含醇量為95%，渦旋混勻， 于離心機(jī)中，以9600轉(zhuǎn)/分，離心15分鐘，棄去上清液，殘渣加水溶解，定容至IOOml，作為供試品溶液備用；i.供試品的檢測精密吸取供試品溶液1ml，加水至anl，照g步驟中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下的方法，自“加入5%苯酚溶液1ml”起，依上述方法測定吸光度A1, 從糖對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出吸光度A1所對應(yīng)的供試品溶液中糖的濃度，并依式X%=c::=.02 *100%計算出枸杞多糖含量；其中C 按標(biāo)準(zhǔn)曲線C=kA+b計算出的濃度，g/L ； M 取樣量，go
全文摘要
枸杞多糖提取物中枸杞多糖的檢測方法，其步驟為⑴制備6種單糖的對照品溶液；⑵將對照品溶液制備成可供氣相色譜分析的試樣，檢測對照品溶液，得出對照品色譜圖和標(biāo)準(zhǔn)曲線；⑶制備供試品；⑷在與對照品相同的色譜條件下對供試品進(jìn)行檢測，得出供試品色譜圖；⑸將供試品檢測出的色譜圖與對照品色譜圖進(jìn)行比對，計算出每種單糖含量；⑹根據(jù)單糖含量配制6種單糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；⑺供試品用紫外分光光度計測定吸光值，計算枸杞多糖含量；本方法通過測定枸杞多糖的單糖組成，可以鑒別枸杞多糖的真?zhèn)危徊捎脝翁腔旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，相對于以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，克服了各種單糖顯色程度不一致導(dǎo)致的誤差，結(jié)果更客觀準(zhǔn)確。
文檔編號G01N30/88GK102495167SQ201110408470
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月9日
發(fā)明者嚴(yán)玲, 余小玲, 劉源才, 孫細(xì)珍, 左剛, 張繼斌, 李先芝, 許銀 申請人:勁牌有限公司