專利名稱：肺炎克雷伯菌核酸檢測試劑盒(pcr-熒光探針法)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒，特別是涉及利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae, KP)的試劑盒。試劑盒通過對樣本中的肺炎克雷伯菌進(jìn)行檢測，可廣泛應(yīng)用于肺炎克雷伯菌感染的輔助診斷。
背景技術(shù)：
肺炎克雷伯菌是臨床上最常見的革蘭陰性桿菌，是引起醫(yī)院獲得性泌尿系統(tǒng)感染、醫(yī)院獲得性肺炎和腹腔感染的重要病原體。同時(shí)，肺炎克雷伯菌也是社區(qū)獲得性感染如社區(qū)獲得性肺炎的潛在病原體。肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae, KP)廣泛分布于自然界及人和動(dòng)物的胃腸道內(nèi)，是臨床標(biāo)本中常見的細(xì)菌，當(dāng)機(jī)體抵抗力降低時(shí)，便經(jīng)呼吸道進(jìn)入肺內(nèi)而引起大葉或小葉融合性實(shí)變，可引起典型的原發(fā)性肺炎。肺炎克雷伯菌也能引起各種肺外感染，包括腸炎和腦膜炎(嬰兒)、泌尿道感染(兒童和成人)及敗血癥。典型的肺炎克雷伯桿菌肺炎常發(fā)生于中老年男性、長期飲酒的慢性支氣管肺病患者，有較典型的臨床表現(xiàn)和X線征象，結(jié)合痰培養(yǎng)結(jié)果，不難診斷。但在有嚴(yán)重原發(fā)疾病基礎(chǔ)上的發(fā)病者，臨床表現(xiàn)多不典型，診斷較為困難。凡在原有疾病過程中出現(xiàn)高熱、白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞增多，X線胸片上出現(xiàn)新的浸潤病灶，而青霉素治療無效者應(yīng)考慮本病。連續(xù)2次或2次以上痰培養(yǎng)陽性，或胸腔積液、血培養(yǎng)陽性可以確診。多數(shù)敗血癥患者的白細(xì)胞總數(shù)明顯增多，嗜中性粒細(xì)胞增高；但血液病患者或用抗代謝藥物者白細(xì)胞數(shù)可不增加，或反有減少。利用PCR方法可以直接檢測病毒核酸，靈敏度更高。2008年I月，F(xiàn)DA通過第一個(gè)利用多重PCR方法，基于Luminex xTAG 技術(shù)，檢測包括呼吸道合胞病毒在內(nèi)的多種呼吸道病毒核酸檢測試劑盒(xTAG RVP試劑盒)[Mahony，J.，S.Chong,et al.(2007)." Development of a respiratory virus panel test for detectionof twenty human respiratory viruses by use of multiplex PCR and a fluidmicrobead-based assay." J Clin Microbiol 45(9):2965-70]，該方法主要是在提取病毒核酸RNA或/和DNA后，經(jīng)混合逆轉(zhuǎn)錄，再使用14對病毒特異引物進(jìn)行多重PCR ;擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)處理，與含有tag序列的21對引物再進(jìn)行多重靶特異引物延伸(TSPE)反應(yīng)；其后，TSPE產(chǎn)物與標(biāo)記有ant1-tag序列的帶不同突光微球反應(yīng),通過Luminex 100流式細(xì)胞檢測儀進(jìn)行檢測，記錄并分析得到結(jié)果。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是上世紀(jì)90年代中期基于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)發(fā)展起來的。實(shí)時(shí)熒光PCR只要加入模板和特異性引物即可實(shí)現(xiàn)在同一反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行PCR反應(yīng)，中途不需加入任何試劑，在處理大量樣品時(shí)易于操作，有助于減少殘余污染，設(shè)置了 UNG酶+dUTP防污染措施有效地防范了 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，避免假陽性結(jié)果，提高臨床診斷依據(jù)的可靠性，并已在多個(gè)領(lǐng)域得到應(yīng)用。與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)(終點(diǎn)檢測)相比，實(shí)時(shí)定量監(jiān)測方法具有如下優(yōu)點(diǎn):實(shí)現(xiàn)了低拷貝數(shù)靶多核苷酸的分析，特異性和精確度更強(qiáng)、自動(dòng)化程度更高以及污染的可能性更小等優(yōu)點(diǎn)，而且實(shí)時(shí)熒光PCR可以得到更高的靈敏度，與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)(終點(diǎn)檢測)技術(shù)相比，操作更簡單，耗時(shí)更少，只需2小時(shí)即可完成全部檢測。
本發(fā)明設(shè)計(jì)的試劑盒通過對KP核酸進(jìn)行直接檢測和研究，有利于加深對這種病毒的認(rèn)識，不僅對于了解患病程度、預(yù)測、評價(jià)治療效果有十分重要意義，而且使得病毒感染發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)入量化階段，為新藥的研究與試用提供極為重要的研究手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測肺炎克雷伯菌的試劑盒(下面簡稱KP試劑盒)，該試劑盒包括:(I) DNA提取液；PCR檢測試劑:KP PCR反應(yīng)液Α、ΚΡPCR反應(yīng)液B ;質(zhì)控品:陰性質(zhì)控品、KP陽性質(zhì)控品，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。為了解決上述任務(wù)，本發(fā)明的具體技術(shù)路線為:(I)針對肺炎克雷伯菌保守序列設(shè)計(jì)能夠與靶多核苷酸結(jié)合的寡核苷酸引物和寡核苷酸探針。(2)寡核苷酸探針標(biāo)記熒光發(fā)生基團(tuán)，使所說的熒光發(fā)生基團(tuán)與被擴(kuò)增的靶多聚核苷酸間接結(jié)合。(3)適宜于RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和熒光檢測體系。核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系包括耐熱DNA聚合酶、UDG酶、2’ -脫氧核苷三磷酸、能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第一條鏈結(jié)合的正向引物、能 夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引物、能夠與靶多聚核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針、含有鎂離子的緩沖液。(4)從待測樣本中提取DNA，加入前述的反應(yīng)體系中，直接PCR擴(kuò)增。(5)確定熒光發(fā)生基團(tuán)所產(chǎn)生的熒光量，分析循環(huán)擴(kuò)增后產(chǎn)生的熒光量以確定靶多核苷酸的存在。本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，其中試劑盒的KP PCR反應(yīng)液A由對應(yīng)的PCR反應(yīng)Buffer、正向引物、反向引物、寡核苷酸探針、純水組成，其特征在于用于靶多核苷酸擴(kuò)增的正向和反向引物的序列分別是5 ’ -GCGCGCACCTATTGTGTTG-3，(SEQ ID NO:1)和5’-TCGCTGTGCTTGTCATCCTT-3’ (SEQ ID NO:2)。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，KP PCR反應(yīng)液中用于靶多核苷酸擴(kuò)增和監(jiān)測體系的寡核苷酸探針的序列是5’X-CCGTCTACACCCGGGCGCC-Y 3’ (SEQ ID NO:3)，其中X/Y表示熒光標(biāo)記檢測體系，包括能夠與靶多核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，PCR檢測試劑中的KP PCR反應(yīng)液B包含UNG酶、熱啟動(dòng)Taq酶和dNTPs。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系由(a)耐熱DNA聚合酶、(b)UDG酶、(c) 2’-脫氧核苷三磷酸、(d)能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第一條鏈結(jié)合的正向引物、(e)能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引物、(f)能夠與靶多聚核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針、(g)含有鎂離子的緩沖液組成。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，陽性質(zhì)控品的建立技術(shù)路線為:使用引物5，-GCGCGCACCTATTGTGTTG-3’ (SEQ ID NO:1)和引物 5，-TCGCTGTGCTTGTCATCCTT-3，(SEQID NO:2)定性擴(kuò)增病毒核酸，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后克隆至PMD18-T載體中，陽性克隆測序確定目的片段是否正確插入并確定插入方向，提取重組質(zhì)粒PMD18-T-KP質(zhì)粒并利用紫外分光光度計(jì)測定A260，對KP-DNA進(jìn)行定量以制備相應(yīng)的陽性質(zhì)控品；其特征還在于陽性質(zhì)控品包含下列序列或80%同源的核苷酸序列:GCGCGCACCTATTGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGA。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，其中陰性質(zhì)控品為生理鹽水、正常人或其它病毒感染者的咽拭子，鼻咽分泌物或痰液樣本。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，其中陽性質(zhì)控品為重組質(zhì)粒pMD18-T-KP或KP陽性的咽拭子，鼻咽分泌物或痰液樣本，用于實(shí)際檢測中的質(zhì)量控制。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，用DNA提取試劑進(jìn)行陰性質(zhì)控品、待測樣本(咽拭子，鼻咽分泌物或痰液)的DNA提取，DNA提取試劑除本發(fā)明提及的方法外，還可以使用其它成熟的DNA提取方法和試劑盒。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，將提取的DNA和陽性質(zhì)控品加入到含有KP PCR反應(yīng)液A和KP PCR反應(yīng)液B的KP-PCR反應(yīng)管中，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，使用熒光定量PCR檢測儀進(jìn)行檢測。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，其特征還在于試劑盒檢測機(jī)理為有一條兩端標(biāo)記有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的特異性熒光探針與目標(biāo)序列上游弓I物和下游弓I物之間的序列配對，熒光基團(tuán)連接在探針的5’末端，淬滅基團(tuán)則在3’末端，當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅基團(tuán)接近而被淬滅；在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的5’外切酶活性將探針進(jìn)行酶切，使得熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離；隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增力口，釋放出來的熒光基團(tuán)不斷積累，熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，針對肺炎克雷伯菌檢測中的特殊性，反應(yīng)體系中引物最終濃度為0.4umol/ml,探針最終濃度為0.2umol/ml。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，針對肺炎克雷伯菌檢測中的特殊性，反應(yīng)體系中引物Mg2+最終濃度為3mM。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，針對肺炎克雷伯菌檢測中的特殊性，反應(yīng)體系中最終引物退火溫度為55攝氏度。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，研制出用于肺炎克雷伯菌核酸檢測的試劑盒，其中KP試劑盒檢測標(biāo)本的靈敏度至少可達(dá)到1.0X 102copies/ml。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn):①靈敏度更高；②全封閉反應(yīng)，提取DNA后，直接用于RT-PCR檢測，避免了污染發(fā)生設(shè)置了 UNG酶+dUTP防污染措施有效地防范了 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，避免假陽性結(jié)果，提高臨床診斷依據(jù)的可靠性；④檢測速度快，整個(gè)過程僅需2小時(shí)；⑤操作簡單，可控性強(qiáng)，可進(jìn)行大批量樣品檢測，有利于產(chǎn)業(yè)化。


圖1顯示KP試劑盒檢測肺炎克雷伯菌的條件設(shè)置。圖2顯示KP試劑盒檢測肺炎克雷伯菌時(shí)不同濃度樣本的擴(kuò)增曲線，三個(gè)標(biāo)本的Ct值均小于27，擴(kuò)增曲線為S形，均能夠判定為陽性。圖3顯示KP試劑盒五個(gè)陰性標(biāo)本的擴(kuò)增曲線，均不具S形特征，能夠判定為陰性。
圖4顯示KP試劑盒兩個(gè)陰性標(biāo)本的擴(kuò)增曲線，與熒光檢測閾值線沒有交點(diǎn)，能夠判定為陰性。圖5顯示陽性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線。圖示擴(kuò)增曲線為S型曲線，且CT值< 27，說明檢測體系有效擴(kuò)增了肺炎克雷伯菌核酸。圖6顯示陰性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線。圖示擴(kuò)增曲線為較平直的折線，與熒光檢測閾值線沒有交點(diǎn)，且曲線不呈S型，說明檢測過程中沒有肺炎克雷伯菌核酸的污染。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例1:肺炎克雷伯菌的KP試劑盒檢測方法(I)標(biāo)本采集、運(yùn)送和保存由臨床醫(yī)師根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行標(biāo)本采集?？蓹z測的標(biāo)本包括，咽拭子，鼻咽分泌物或痰液。采集方法如下:①咽拭子:用棉拭子取咽部分泌物，將棉拭子置入無菌玻璃管，密封送檢；②鼻咽分泌物:負(fù)壓下吸取鼻咽分泌物，密封送檢；③人痰液標(biāo)本:無菌采集指導(dǎo)病患從呼吸道深部咳出痰(不可含有唾液)，裝于40ml無菌塑膠容器，蓋上容器蓋子，密封送檢。標(biāo)本可立即用于測試，也可以保存于_70°C待測，保存期為6個(gè)月。標(biāo)本運(yùn)送采用0°C冰壺(2)標(biāo)本處理咽拭子，鼻咽分泌物(鼻咽分泌物處理步驟同2、3、4)1.加滅菌生理鹽 水1.5ml到無菌玻璃管，充分震蕩搖勻，擠干棉拭子，立即離心；或置4°C冰箱過夜；2.12，OOOrpm離心5分鐘；去上清，沉淀加滅菌生理鹽水Iml混勻，12，OOOrpm離心5分鐘；3.去上清，沉淀中加入50 μ I DNA提取液充分混勻，100°C恒溫處理10± I分鐘；4.12，OOOrpm 離心 5 分鐘，備用。痰液1.痰液中加入4倍體積的4% NaOH溶液，混勻后室溫或65水浴30分鐘；2.用槍頭或吸管混勻后吸取Iml至1.5ml離心管中，5，OOOrpm離心5分鐘；3.去上清，留沉淀及液體約20 μ 1，加入Iml I XPBS,混勻后12，OOOrpm離心5分鐘；4.去上清，沉淀中加入50 μ I DNA提取液充分混勻，100°C恒溫處理10± I分鐘；5.12，OOOrpm 離心 5 分鐘，備用。(3)核酸提取取出陰性質(zhì)控品和處理過的標(biāo)本，8，OOOrpm離心數(shù)秒，吸50 μ I至0.5ml滅菌離心管中，加入50 μ I DNA提取液充分混勻，100°C恒溫處理10± I分鐘。12，OOOrpm離心5分
鐘，備用。提取后的核酸樣品可直接用于后續(xù)PCR檢測或于_20°C保存。若保存一個(gè)月以上，最好存于_70°C。DNA提取試劑除本發(fā)明提及的方法外，還可以使用其他成熟的DNA提取方法和試劑。(4) RT-PCR 檢測取5ul上述核酸溶液加入至PCR反應(yīng)液中，8000rpm離心數(shù)秒，熒光定量PCR上機(jī)。PCR反應(yīng)條件設(shè)置為:50°C 2分鐘，I個(gè)循環(huán)；95°C 15分鐘，I個(gè)循環(huán)；94°C 15秒一55°C45秒(收集熒光)，40個(gè)循環(huán)。保存文件，運(yùn)行(參見附圖1);設(shè)探針檢測模式設(shè)置為:Reporter Dye:FAM, Quencher Dye:N0NE, Passive Reference:N0NE。(5)結(jié)果分析分析條件設(shè)置:根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值(用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整，Start值可以在3 15、End值可設(shè)在5 20，調(diào)整陰性對照的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線)，點(diǎn)擊Analysis自動(dòng)獲得分析結(jié)果，在Report界面察看結(jié)果。(6)結(jié)果判定如果檢測樣品的擴(kuò)增曲線無對數(shù)增長期或Ct值> 38，可判樣品為肺炎克雷伯菌陰性(參見附圖2和附圖3)；如果檢測樣品Ct值< 38，且曲線有明顯的對數(shù)增長期，可判樣品為肺炎克雷伯菌陽性(參見附圖4)。實(shí)施例2:肺炎克雷伯菌核酸檢測試劑盒中質(zhì)控品的配制及使用肺炎克雷伯菌核酸檢測試劑盒中質(zhì)控品包括陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，用于臨床試驗(yàn)中質(zhì)量控制，KP陽性質(zhì)控品離心后直接加樣上機(jī)，陰性質(zhì)控品操作方法同待檢樣本。質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn):要求在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足以下條件——陽性質(zhì)控品為陽性(參見附圖5)、陰性質(zhì)控品為陰性(參見附圖6);否則，結(jié)果無效，需重新檢測。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
序列表
<110〉中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司
<120〉肺炎克雷伯菌核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)
<140>
<141>
<160>5
<210> I <211〉 19 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉
<223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。
<400> I
gcgcgcacctattgtgttg<210〉 2
<211〉20
<212>DNA <213〉人工序列 <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。
<400>2
tcgctgtgcttgtcatcctt
<210> 3 <211> 19 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉
<223>根據(jù)特定核苷 酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的探針。
權(quán)利要求
1.一種實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法檢測肺炎克雷伯菌的試劑盒，該試劑盒包括:(1)DNA提取液；PCR檢測試劑:KP PCR反應(yīng)液A、KP PCR反應(yīng)液B ;質(zhì)控品:陰性質(zhì)控品、KP陽性質(zhì)控品，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其中KP PCR反應(yīng)液A由對應(yīng)的PCR反應(yīng)Buffer、正向引物、反向引物、寡核苷酸探針、純水組成，其特征在于用于靶多核苷酸擴(kuò)增的正向和反向引物的序列分別是5 ’ -GCGCGCACCTATTGTGTTG-3，和5’ -TCGCTGTGCTTGTCATCCTT-3’ ； 靶多核苷酸擴(kuò)增和監(jiān)測體系的寡核苷酸探針的序列是5’ X-CCGTCTACACCCGGGCGCC-Y3’，其中X/Y表示熒光標(biāo)記檢測體系，包括能夠與靶多核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于陰性質(zhì)控品為生理鹽水、正常人或其它病毒感染者的咽拭子，鼻咽分泌物或痰液樣本。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，陽性質(zhì)控品為重組質(zhì)粒pGEM-T-KP或KP陽性的咽拭子，鼻咽分泌物或痰液樣本，其特征還在于陽性質(zhì)控品包含下列序列或80%同源的核苷酸序列:GCGCGCACCTATTGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于RT-PCR反應(yīng)酶系包含耐熱DNA聚合酶、UDG酶和dUTP。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于反應(yīng)體系中引物最終濃度為0.4umol/ml，探針最終濃度為0.2umol/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于反應(yīng)體系中引物Mg2+最終濃度為3mM。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于反應(yīng)體系中最終引物退火溫度為55攝氏度。
全文摘要
本發(fā)明涉及實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒，特別是涉及利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，KP)的試劑盒。試劑盒通過對樣本中的肺炎克雷伯菌進(jìn)行檢測，可廣泛應(yīng)用于肺炎克雷伯菌感染的輔助診斷。
文檔編號G01N21/64GK103160574SQ201110412000
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月9日
發(fā)明者李明, 肖湘文, 高秀潔, 陳華云, 程鋼, 何蘊(yùn)韶 申請人:中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司