專利名稱：豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體膠體金快速檢測試紙條的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體膠體金快速診斷試紙條，屬于一種新的動物診斷試劑，主要用于診斷豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的動物；應用于畜牧獸醫(yī)學領域。
背景技術：
ItMMi^Bf ^^-π Π: (Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS) 由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染引起，主要特征為懷孕母豬發(fā)生流產、早產和死胎等嚴重的繁殖障礙以及仔豬與育肥豬的呼吸道疾病。PRRS是上世紀80年代后期暴發(fā)的一種新的傳染性疾病，于1987年首發(fā)于北美地區(qū)，在隨后的幾年內，便迅速地在歐、美大陸的許多國家流行，隨后又蔓延至亞洲的一些國家，成世界范圍內的大流行，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失。我國自1995年底暴發(fā)此病，并迅速傳播至全國各地，成為我國規(guī)?；B(yǎng)豬場引發(fā)繁殖障礙的主要疫病之一。近年來PRRS呈持續(xù)性感染，并導致繼發(fā)性感染增加，嚴重威脅了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。
目前豬繁殖與呼吸綜合征病毒病檢測主要采用的技術方法有ELISA、反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術、免疫熒光技術、熒光RT-PCR、環(huán)介導逆轉錄等溫檢測(RT-LAMP)、基因芯片以及病毒的分離鑒定等。比較快速準確的技術是ELISA和熒光 RT-PCR，但這2種技術都需要特殊的儀器設備，并且檢測時間都在2小時以上，檢測成本昂貴，不便于適時和快速診斷。這些限制了豬繁殖與呼吸綜合征病毒病的預防控制，因此研制出一種特異性強、靈敏度高、簡單易行的診斷方法迫在眉睫。發(fā)明內容
發(fā)明涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體膠體金抗體快速檢測試紙條的制備方法，該方法是利用基因工程表達豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp9蛋白，利用免疫學抗原抗體能特異性結合原理，膠體金標記抗原與抗體結合，快速檢測豬血液或血清中與病毒復制相關抗體；該測試紙條可廣泛用于臨床豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測；與其他病毒無交叉反應，與ELISA、中和試驗兩種方法檢測的符合率分別為95. 3%和93. 12%。與ELISA 相比，重組抗原免疫膠體金具有明顯的優(yōu)勢安全性好，無需培養(yǎng)病毒本身，避免了因操作病毒造成的病毒擴散；可以大批量制備，工藝簡單，生產成本低廉；抗原成分穩(wěn)定均一， 操作簡便省力，不用儀器，檢測結果特異性高，重復性好。整個實驗僅需15分鐘。操作簡便、快速、準確、靈敏度高、直觀、結果容易判定。
本發(fā)明的技術方案是這樣實現的一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體膠體金快速診斷試紙條，其特征在于試紙條由樣品墊(1)、結合墊O)、硝酸纖維素膜(3)、吸收墊(4) 依次粘附在不吸水的支撐薄片( 上；其中結合墊( 上包被有膠體金標記的豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp9重組蛋白；硝酸纖維素膜(3)上分別包被SPA構成的檢測線T線(6)和抗Nsp9蛋白單克隆抗體IgG構成的質控線C線(7)。
所述的結合墊(2)上包被的膠體金標記的豬繁殖與呼吸病毒Nsp9蛋白的制備方法如下(1)首先利用基因工程菌原核表達Nsp9蛋白，所制備抗原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp9蛋白，且為病毒特有蛋白，這就決定了試紙條的特異性；
(2)將純化的PRRSV Nsp9蛋白制備金標抗原，用0. IM碳酸鉀調膠體金的PH值至8. 2， 按IOOug /毫升膠體金加入Nsp9蛋白，磁力攪拌器混勻30分鐘，加BSA至終濃度為1%，靜置1小時。40C 13000rpm離心30分鐘，棄上清，沉淀用標記洗滌保存液洗滌兩次，用十分之一初始膠體金體積的洗滌保存液重懸沉淀，4°C備用。(3)將結合墊浸泡于封閉液即2% BSA、0. 5%吐溫-20、2. 5%蔗糖、0. 05%疊氮鈉、 0. OlM PBS中30分鐘，37°C烘干；然后將制備好的金標抗原均勻噴涂于結合墊上，每毫升鋪 20平方厘米，凍干、保存。所述的硝酸纖維素膜(3)上包被有葡萄球菌蛋白A(SPA)構成的檢測線T線(6) 是選用一種能夠與IgG分子Fc片段特異性結合的蛋白(SPA)噴涂于檢測線上，用包被緩沖液將SPA稀釋到50ug/ml，調整機器劃線為T線，即為檢測線靠近結合墊，距結合墊一端約 5mm ο所述的PRRSV Nsp9單抗2D6 (IgG1)構成的質控線C線(7)是以I3RRSV Nsp9蛋白作為抗原，免疫小鼠，利用雜交瘤技術制備抗PRRSV Nsp9單克隆抗體，得到細胞株2D6，并獲得純化的抗體，用包被緩沖液將單抗稀釋到50-100ug/ml，調整機器劃線為C線，即為對照線靠近吸收墊，距吸收墊端約3mm;兩線距離5-8mm，在硝酸纖維素膜NC膜上的質控線上， 可與金標抗原結合，以此檢驗試紙條的有效性。所述的試紙條的檢測方法是樣品血清中抗PRRSV Nsp9抗體先和膠體金標記的 Nsp9抗原結合，由于毛細管作用，反應復合物沿包被膜向前泳動，若樣品中有PRRSV抗體， 到達檢測線時遇到包被在硝酸纖維素膜上的SPA，就會形成金標抗原-抗體-SPA復合物，從而凝集在檢測線上，形成特異性的紅色沉淀線，沒有和抗體結合的金標抗原則會直接通過檢測線，富集在質控線上形成紅色沉淀線，即判為陽性結果，若樣品中無PRRSV Nsp9抗體， 反應復合物到達檢測線時遇到SPA就不會形成復合物，反應復合物通過檢測線，富集在質控線上，形成紅色沉淀，即判為陰性結果。本發(fā)明的優(yōu)點是
1、具有生物安全性，其所使用的金標抗原為基因工程菌表達的重組病毒蛋白，不含豬繁殖與呼吸綜合征病毒，因此不存在散毒的危險。2、特異性強，膠體金試紙條金標抗原能夠特異性的與PRRSV Nsp9抗體結合，檢測線上的SPA能夠與IgG分子Fc片段特異性結合，為捕獲抗原，二者提高了檢測的敏感性和特異性。3、其可快速檢測即10-15分鐘；不需特殊儀器設備，可用于現場操作；操作簡單， 一步完成，無需專業(yè)人員操作；檢測成本低；儲存方便。


圖1為本發(fā)明所涉及的PRRSV重組蛋白。圖2為本發(fā)明試紙條的結構模式圖。圖3為本發(fā)明試紙條結果判定示意圖。
具體實施方式
下面結合具體實例對本發(fā)明做詳細說明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
實施例1表達豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp9蛋白制備l、Nsp9基因7817 - 8657nt的擴增參照PRRSV BJ-4序列，設計并合成1對引物，擴增Nsp9基因的部分片段(7817 - 8657nt)。
上游引物下劃線為HindIII序列，下游引物下劃線為BioI序列；PCR反應條件為，94°C 熱啟動5分鐘，94°C變性60秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，最后72°C延伸10分鐘， 擴增產物為840bp，經瓊脂糖電泳；1. 2Nsp9基因片段在pMD-18T中的克隆將擴增產物利用膠回收試劑盒回收，利用T-A原理，與PMD-18T載體連接，轉化DH5ci感受態(tài)大腸桿菌，涂布于氨芐青霉素的LB片板，12小時后挑取典型白色單菌落培養(yǎng)，提質粒DNA。通過HindIII和XhoI雙酶切鑒定，命名為pMD-Nsp9 ;1. 3Nsp9基因在pET_28a中的克隆原核表達載體pET-28a是上游帶有His標簽的高效表達載體，用HindIII和BioI雙酶切重組質粒pMD-Nsp9,插入片段840bp,回收其中840bp,用HindIII和XhoI雙酶切ρΕΤ48ει， 與帶有相同粘端的Nsp9基因判斷連接，轉化大腸桿菌BL21感受態(tài)菌，卡娜青霉素抗性篩選，挑取單菌落少量培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，小提質粒DNA，通過限制性內切酶鑒定重組質粒， 得到重組克隆命名為pET-28a-Nsp9。
2、pET-28a-Nsp9的誘導表達將含有重組質粒的新鮮大腸桿菌(BL-21)單菌落在 LB培養(yǎng)基中37°C振蕩培養(yǎng)過夜，次日按體積比轉接5ml新鮮培養(yǎng)基，37°C繼續(xù)培養(yǎng)， 當菌液0D600值達0. 6-0. 8時，加入無菌IPTG溶液，使其終濃度為lmmol/L。誘導3_4小時后停止培養(yǎng)，取Iml離心收集菌體，PBS (pH7. 4)洗滌，用50 μ 1 PBS懸浮菌體，與10 μ 1 5XSDS上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)， 分離膠的丙烯酰胺濃度為12%，將只含載體的大腸桿菌同樣誘導做為陰性對照，0. 25%考馬斯亮蘭染色；經鑒定后，大量搖菌，離心沉淀菌體，超聲破碎后經電洗脫得到高純度的重組蛋白，于-80°C保存?zhèn)溆谩?br> 實施例2抗PRRSV Nsp9蛋白單克隆抗體的制備1、動物免疫選擇6-8周齡健康Balb/C小鼠以弗氏完全佐劑乳化純化的PRRSV Nsp9 蛋白，每只小鼠腹腔注射IOOyg左右，14d后以弗氏不完全佐劑乳化蛋白腹腔注射 100 μ g,最后一次加強免疫時，直接腹腔注射100 μ g純化的蛋白，融合前3 4d尾靜脈注射50 μ g純化的蛋白。
2、細胞融合取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0混合于融合管內，以300g離心10 min,棄去上清，振蕩細胞，使兩種細胞盡量混合均勻，然后60s內緩慢滴加預熱的 PEG-4000溶液，再緩慢加入無血清的1640培養(yǎng)基終止融合，靜置后再以1 000 r/min離心10 min，棄去上清后加入HAT培養(yǎng)基，使細胞懸浮并混勻，于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，第14d開始換液并開始檢測篩選
3、雜交瘤細胞的篩選和克隆化克隆的篩選采用間接ELISA，用純化的PRRSV Nsp9蛋白作為包被抗原。對所獲陽性雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清進行篩選；將ELISA篩選的陽性雜交瘤細胞進行克隆化，將檢出的陽性孔再次克隆和亞克隆，直到所有的孔都為陽性。通過三次細胞克隆最終獲得雜交瘤細胞株2D6，抗體亞型為IgGl。4、抗體的純化將得到的細胞株注射到Balb/C小鼠腹腔內，一周后收取腹水，用 IgG純化柱子純化得到的單克隆抗體。實施例3金標抗原的制備
1、膠體金顆粒制備將氯化金配制成0.01%水溶液，取IOOml煮沸2min后，邊攪拌邊加入檸檬酸三鈉2ml，煮沸至溶液顏色變成酒紅色后，繼續(xù)煮沸至適宜濃度0D535 = 0.9312，冷卻后加入雙蒸餾水恢復到原體積，置4°C保存；
2、將待標記PRRSVNsp9蛋白倍比稀釋，分別取100 μ 1加入Iml膠體金中，IOmin后加入10% NaCl 100 μ L, 4°C靜止lh。取膠體金顏色沒有發(fā)生改變的最高稀釋倍數為準，按測得的最小蛋白濃度的比例將純化的PRRSV Nsp9蛋白加至pH 8. 0的膠體金溶液中，邊加邊攪拌，室溫靜置30 min;加入10%牛血清白蛋白(BSA)，使其在溶液中的終濃度為1 %，室溫靜置15 min;4°C、8 778Xg離心30 min，吸去上清，用重懸液I (含BSA等)懸浮至原體積，4°C、8 778 Xg離心30 min，去上清，沉淀用重懸液II (含蔗糖、BSA、吐溫-20等)1/5 體積懸起，4°C保存?zhèn)溆谩嵤├?免疫血清的制備
收集單抗制備時免疫小鼠血清作為抗PRRSV Nsp9高免血清，于-80°C保存?zhèn)溆?。實施? SPA的獲得
葡萄球菌蛋白A(SPA)購置于sigma公司，將SPA配成50ug/ml，保存?zhèn)溆?。實施?試紙條的研制
1、試紙條的組成用噴膜機將膠體金標記蛋白復合物噴涂在膠體金結合墊上，將SPA蛋白和抗PRRSV Nsp9蛋白單抗2D6間隔4mm噴在硝酸纖維膜NCM上，分別作為檢測帶和質控帶，將包被好的NCM放入含3% BSA的PBS中，過夜，封閉其余蛋白結合位點，倒掉封閉液，用PBS，洗2次，每次5min，37°C干燥Ih備用，將硝酸纖維膜、膠體金結合墊、樣品墊、吸水墊等一次粘在PVC板上，S卩，將玻璃纖維連接在NCM上，邊緣并附著在NCM上；棉漿墊附著在玻璃纖維上，與NCM銜接；吸水濾紙板連接在NCM下端，邊緣并附著在NCM上， 將粘好的PVC材料切成60mm長、4mm寬的試紙條，即制成豬繁殖與呼吸綜合征病毒膠體金抗體快速檢測試紙條，將試紙條密封于鋁箔袋中，4°C保存；
2、所述的硝酸纖維素膜(3)上包被有SPA構成的檢測線T線(6)是選用基因工程菌表達的重組金黃色葡萄球菌蛋白A，將其噴涂于檢測線上，用包被緩沖液將SPA稀釋到 20-50ug/ml，調整機器劃線為T線，即為檢測線靠近結合墊，距結合墊端約5mm。3、所述的小鼠抗PRRSV Nsp9單抗IgG構成的質控線C線(7)是以雜交瘤技術獲得的針對PRRSV Nsp9單個表位的細胞株分泌的抗體，用包被緩沖液將其稀釋到50-100ug/ ml，調整機器劃線為C線，即為對照線靠近吸收墊，距吸收墊端約3mm ；兩線距離5_8mm，在硝酸纖維素膜NC膜上的質控線上，可與金標抗抗原結合，以此檢驗試紙條的有效性。4、所述該紙條的檢測方法是樣品血清中抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp9抗體先和膠體金標記的Nsp9蛋白結合，由于毛細管作用，反應復合物沿包被膜向前泳動，若樣品中有相應抗體，到達檢測線時遇到包被在硝酸纖維素膜上的SPA，就會形成金標抗原-Nsp9 抗體-SPA復合物，從而凝集在檢測線上，形成特異性的紅色沉淀線；沒有和抗體結合的金標抗原則會直接通過檢測線，富集在質控線上形成紅色沉淀線，即判為陽性結果。若樣品中無豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp9抗體，樣品到達檢測線時遇到SPA就不會形成金標抗原_Nsp9抗體-SPA復合物，不會形成紅色沉淀線，而只富集在質控線上，形成紅色沉淀，即判為陰性結果。
實施例7膠體金試紙條的應用 1、本發(fā)明試紙條的使用方法(1)樣品制備臨床采集待檢動物血清用于檢測。
(2)檢測取出試紙條，室溫平衡20分鐘，將待檢血清滴入試紙條檢測窗口中，取出，平放，靜置10-15分鐘，判定結果。
(3)結果判定當時紙條只出現肉眼可見的紫紅色質控線，沒有出現肉眼可見的紫紅色檢測線，判為陰性，記為“一”；當試紙條出現肉眼可見的紫紅色質控線，同時出現肉眼可見的紫紅色檢測線，判為陽性，記為“ + ” ；檢測線顏色深度與待檢抗體水平成正比，顏色越深說明待檢血清滴度越高，質控線無條帶則判為試紙條失效。
實施例8試紙條敏感性特異性測定 1、試紙條的敏感性試驗將PRRSV Nsp9蛋白免疫的小鼠血清作為檢測陽性血清，用于試紙條敏感性檢測試驗， 將陽性血清滴度稀釋到2560倍，用試紙條進行檢測，結果當稀釋度為160倍以上時試紙條檢測為陰性，稀釋度為80倍以下時試紙條檢測為陽性，結果見表權利要求
1.一種豬繁殖與呼吸綜合征毒病抗體膠體金快速診斷試紙條，其特征在于試紙條由樣品墊(1)、結合墊(2)、硝酸纖維素膜(3)、吸收墊(4)依次粘附在不吸水的支撐薄片(5) 上；其中結合墊(2)上包被有膠體金標記的重組PRRSV Nsp9蛋白；硝酸纖維素膜(3)上分別包被有葡萄球菌蛋白A(SPA)構成的檢測線T線(6)和PRRSV Nsp9蛋白單克隆抗體 ZDe(IgG1)構成的質控線C線(J)。
2.根據權利要求1所述的一種豬繁殖與和呼吸綜合征病毒病抗體膠體金快速診斷試紙條，其特征在于所述的結合墊(2)上包被的膠體金標記的PRRSV Nsp9蛋白制備方法如下(A)首先制備PRRSVNsp9抗原，利用基因克隆技術從PRRSV基因組中克隆出Nsp9基因片段，將其連到pET-28a中，構成pET-28a-Nsp9載體，將載體轉化到大腸桿菌BL-21中， 表達Nsp9蛋白，并將其純化，-80°C保存?zhèn)溆茫琍RRSV Nsp9蛋白只與抗Nsp9抗體結合，這就決定了試紙條的特異性；(B)選用純化發(fā)的PRRSVNsp9蛋白標記膠體金，制備金標抗抗原，用0. IM碳酸鉀調膠體金的PH值至8. 2，按IOOug抗原/毫升膠體金加入Nsp9蛋白，磁力攪拌器混勻30分鐘， 加BSA至終濃度為1%，靜置1小時，4°C 13000rpm離心30分鐘，棄上清，沉淀用保存液洗滌兩次，用十分之一初始膠體金體積的洗滌保存液重懸沉淀，4°C備用；(C)將結合墊浸泡于封閉液即2%BSA、0. 5%吐溫-20,2. 5%蔗糖、0. 05%疊氮鈉、0. OlM PBS中30分鐘，37°C烘干；然后將制備好的金標抗體均勻噴涂于結合墊上，每毫升鋪20平方厘米，凍干、保存。
3.根據權利要求1所述的一種豬繁殖與呼吸綜合癥毒病抗體膠體金快速診斷試紙條， 其特征在于所述的硝酸纖維素膜(3)上包被有葡萄球菌蛋白A (SPA)構成的檢測線T線(6) 是選用一種能夠與IgG分子Fc片段特異性結合的蛋白(SPA)噴涂于檢測線上，用包被緩沖液將SPA稀釋到50ug/ml，調整機器劃線為T線，即為檢測線靠近結合墊，距結合墊一端約 5mm ο
4.根據權利要求1所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征毒病抗體膠體金快速診斷試紙條， 其特征在于所述的PRRSV Nsp9單抗ZDe(IgG1)構成的質控線C線(7)是以PRRSV Nsp9蛋白作為抗原，免疫小鼠，利用雜交瘤技術制備抗PRRSV Nsp9單克隆抗體，得到細胞株2D6， 并獲得純化的抗體，用包被緩沖液將單抗稀釋到50-100ug/ml，調整機器劃線為C線，即為對照線靠近吸收墊，距吸收墊端約3mm ；兩線距離5-8mm，在硝酸纖維素膜NC膜上的質控線上，可與金標抗原結合，以此檢驗試紙條的有效性。
5.一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒抗體病膠體金快速診斷試紙條，其特征在于所述的試紙條的檢測方法是樣品血清中抗PRRSV Nsp9抗體先和膠體金標記的Nsp9抗原結合，由于毛細管作用，反應復合物沿包被膜向前泳動，若樣品中有PRRSV抗體，到達檢測線時遇到包被在硝酸纖維素膜上的SPA，就會形成金標抗原_抗體-SPA復合物，從而凝集在檢測線上， 形成特異性的紅色沉淀線，沒有和抗體結合的金標抗原則會直接通過檢測線，富集在質控線上形成紅色沉淀線，即判為陽性結果，若樣品中無PRRSV Nsp9抗體，反應復合物到達檢測線時遇到SPA就不會形成復合物，反應復合物通過檢測線，富集在質控線上，形成紅色沉淀，即判為陰性結果。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征毒病抗體膠體金快速診斷試紙條，其特征在于試紙條由樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸收墊依次粘附在不吸水的支撐薄片上；其中結合墊上包被有膠體金標記的PRRSVNsp9蛋白；硝酸纖維素膜上分別包被有葡萄球菌蛋白A(SPA)構成的檢測線T線和PRRSVNsp9單克隆抗體2D6構成的質控線C線。其利用免疫學抗原抗體能特異性結合原理，膠體金標記抗原與相應抗體結合，這種抗原抗體結合物再與葡萄球菌蛋白A(SPA)結合，形成抗原-抗體-SPA結合物在硝酸纖維素膜(NC膜)上出現顏色反應，可以肉眼觀察；具有簡單、快速、敏感和特異性好等特點。并且價格低廉，適用于基層或臨床檢測豬繁殖與呼吸綜合征毒病抗體。具有特異性強、靈敏度高、操作簡單和診斷快速的顯著優(yōu)點，可用于豬繁殖與呼吸綜合征毒病的快速診斷。
文檔編號G01N33/531GK102495216SQ201110423389
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月16日 優(yōu)先權日2011年12月16日
發(fā)明者丁壯, 張曉東, 楊建新, 母連志, 郭育培, 黃志強 申請人:吉林大學