專利名稱：功能食品中氯霉素殘留的hplc-ms-ms檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種功能性食品中氯霉素殘留的檢測方法。
背景技術(shù)：
改革開放以來，功能性食品行業(yè)作為21世紀的朝陽產(chǎn)業(yè)愈來愈呈現(xiàn)出勃勃生機，功能性食品也逐漸走進了廣大人民群眾的生活，對促進機體健康、改善亞健康、祛除疾病等方面發(fā)揮了重要作用。動物源性功能性食品如:鈣粉、奶粉、蛋白粉和蜂蜜等的生產(chǎn)制備多以畜牧、水產(chǎn)動物產(chǎn)品和半成品為原料，而氯霉素因其對革蘭陽性、陰性細菌均有抑制作用，且對后者的作用較強，其中對傷寒桿菌、流感桿菌、副流感桿菌和百日咳桿菌的作用比其他抗生素強，對立克次體感染如斑疹傷寒也有效，因此廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療家畜及水產(chǎn)品的細菌感染性疾病，這就有可能使家畜及水產(chǎn)品中有氯霉素殘留。氯霉素對人體的毒害作用主要包括:①主抑制骨髓造血機能。可引起血小板減少性紫殿、粒細胞缺乏癥、再生障礙性貧血、溶血性等，多數(shù)在長期或多次用藥的過程中發(fā)生。癥狀有二:一為可逆的各類血細胞減少，其中粒細胞首先下降，這一反應(yīng)與劑量和療程有關(guān)，一旦發(fā)現(xiàn)，及時停藥，可以恢復(fù)。二是不可逆的再生障礙性貧血，雖然少見，但死亡率高，此反應(yīng)屬于變態(tài)反應(yīng)，與劑量療程無直接關(guān)系。②氯霉素也可產(chǎn)生胃腸道反應(yīng)和二重感染。③新生兒與早產(chǎn)兒劑量過大可發(fā)生循環(huán)衰竭(灰嬰綜合征)。④可引起視神經(jīng)炎、視力障礙、多發(fā)性神經(jīng)炎、神經(jīng)性耳聾以及嚴重失眠。有時發(fā)生中毒性精神病，主要表現(xiàn)為幻視、幻聽、定向力喪失、精神失常等。少數(shù)患者可出現(xiàn)皮疹及血管神經(jīng)性水腫等過敏反應(yīng)，但都比較輕微。據(jù)報道，氯霉素在組織中的殘留濃度能超過lmg/kg，對食用者威脅很大。已有I例兒童服用2mg氯霉素和老年婦女使用氯霉素眼膏后死亡的報道。發(fā)達國家對氯霉素檢出限的要求越來越嚴格，對氯霉素殘留的要求是不得檢出，檢出限量歐盟由原來的10 μ g/kg改為I μ g/kg,繼而又降至0.1 μ g/kg,比原標準要求提高了 100倍；美國FDA規(guī)定的檢出限也由原來的5 μ g/kg降為0.3 μ g/kg,且目前正在研究應(yīng)用更為靈敏的方法，可使檢出限值達0.1 μ g/kg。而因為氯霉素殘留超標而被國外查處的事件報道屢見不鮮。美國食品藥品管理局(FDA) 2011年6月11日宣布，從費城一個集散中心查獲64大桶，價值3萬2千美元從中國進口的蜂蜜。這些蜂蜜含有一種烈性的抗生素(氯霉素)，可能導(dǎo)致人重病或死亡。近年來各種關(guān)于氯霉素殘留的檢測方法不斷涌現(xiàn)，大致可分為三大類:第一類是生物測定法，第二類是理化分析法，第三類是兼有生物和化學(xué)的酶聯(lián)免疫檢測法。功能性食品中成分比較復(fù)雜，大多含有多種不同成分，這就給檢測其中的氯霉素殘留帶來困難。目前，功能性食品中氯霉素殘留檢測尚未有文獻報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種功能食品中氯霉素殘留的HPLC-MS-MS檢測方法。本發(fā)明的檢測方法概述如下:一種功能食品中氯霉素殘留的HPLC-MS-MS檢測方法，包括如下步驟:(I)稱取Ig試樣，精確至0.0lg，置于50mL離心管中，加入15 μ L濃度為0.4 μ g/mL的氘代氯霉素作內(nèi)標溶液，加入15mL乙酸乙酯0.45mL氫氧化銨，5g無水硫酸鈉，勻質(zhì)提取30s,以4000r/min離心5min,上清液轉(zhuǎn)移至IOOmL雞心瓶中；(2)取第二個50mL離心管，加入15mL乙酸乙酯和0.45mL氫氧化銨作為洗滌液，洗滌步驟(I)勻質(zhì)操作時用的刀頭10s，洗滌液移入所述IOOmL雞心瓶中，再向第二個50mL離心管中加入15mL乙酸乙酯和0.45mL氫氧化銨，用玻璃棒攪拌第二支離心管中的殘渣后，于鏇潤振蕩器上潤旋提取lmin,超聲波提取5min,以4000r/min離心5min,上清液合并至所述IOOmL雞心瓶中；(3)向第二支離心管的殘渣中再加入15mL乙酸乙酯，于漩渦振蕩器上渦旋提取lmin,超聲波提取5min,以4000r/min離心5min,將上清液至所述IOOmL雞心瓶中，在45°C旋轉(zhuǎn)濃縮至干；(4)將所述雞心瓶中的殘渣用ImL水溶解，超聲5min，加入3mL正己烷渦旋混合30s,靜置分層，棄掉上層的正己烷，再加3mL正己烷渦旋混合30s，靜置分層，移取水相于1.5mL的離心管中，以10000r/min離心5min，過0.2 μ m濾膜后，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定；(5)精確稱取氯霉素標準品IOmg于IOOmL容量瓶中，用色譜甲醇超聲溶解定容至刻度，為標準儲備液；將所述標準儲備液用色譜甲醇分別稀釋，配成0.1 μ g/mL, 0.2 μ g/mL, 0.4 μ g/mL, 0.8 μ g/mL和I μ g/mL的溶液；分別注入高效液相色譜_串聯(lián)質(zhì)譜測定；得到標準曲線；(6)將步驟(4)獲得的檢驗數(shù)據(jù)通過標準曲線計算待測樣品中氯霉素濃度；HPLC測定條件:a)色譜柱:XTerra MS C18,150mmX 2.1mm, 3.5 μ m。b)流動相及梯度洗脫條件:0-6分鐘流動相乙腈從20 %到90 %，流動相水從80 %到10 % ；6-8分鐘流動相乙腈從90 %到20 %，流動相水由10 %到80 % ；8-15分鐘流動相乙腈保持20%不變，流動相水保持80%不變；c)進樣量:5yL;d)柱溫:35°C ;e)流速:0.2mL/min ；MS/MS參考條件a)電離方式:電噴霧電離，負離子(ES1-)；b)毛細管電壓:3.0OkV ；c)離子源溫度:110°C ;d)錐孔氣:氮氣，50L/Hr ；e)脫溶劑氣:氮氣，700L/Hr，溫度400°C ；f)碰撞氣:IS氣；
g)掃描模式:多反應(yīng)檢測(MRM)模式。本發(fā)明的有益效果是=HPLC-MS-MS技術(shù)靈敏度高，選擇性和特異性好，不僅可對樣品中低濃度的多藥物殘留進行定性確認，克服樣品基質(zhì)干擾，而且能夠有效排除假陽性，進行功能性食品中殘留物準確的定量分析。本發(fā)明的方法準確度好、精度高、線性良好，且便于開展功能性食品中氯霉素殘留含量的測定。為以后功能性食品中獸藥殘留監(jiān)測提供了有效的技術(shù)支撐。


圖1為實施例1的氯霉素標準品液相色譜質(zhì)譜圖。圖2為實施例1的樣品液相色譜質(zhì)譜圖。
具體實施例方式下面通過實例對本發(fā)明做進一步的描述，這些描述并不是對本發(fā)明內(nèi)容進一步的限定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，對本發(fā)明內(nèi)容所做的等同替換或相應(yīng)的改進，仍屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。實施例1一種功能性食品中氯霉素殘留的HPLC-MS-MS檢測方法，包括如下步驟:(以營養(yǎng)聞隹丐沖劑為待測樣品)(I)稱取Ig高鈣沖劑為試樣，精確至0.0lg，置于50mL聚丙烯離心管中，加入15 μ L濃度為0.4 μ g/mL的氘代氯霉素作內(nèi)標溶液，加入15mL乙酸乙酯0.45mL氫氧化銨，5g無水硫酸鈉,勻質(zhì)提取30s,以4000r/min離心5min,上清液轉(zhuǎn)移至IOOmL雞心瓶中；(2)取第二個50mL離心管，加入15mL乙酸乙酯和0.45mL氫氧化銨作為洗滌液，洗滌步驟(I)勻質(zhì)操作時用的刀頭10s，洗滌液移入所述IOOmL雞心瓶中，再向第二個50mL離心管中加入15mL乙酸乙酯和0.45mL氫氧化銨，用玻璃棒攪拌第二支離心管中的殘渣后，于鏇潤振蕩器上潤旋提取lmin,超聲波提取5min,以4000r/min離心5min,上清液合并至所述IOOmL雞心瓶中；(3)向第二支離心管的殘渣中再加入15mL乙酸乙酯，于漩渦振蕩器上渦旋提取lmin,超聲波提取5min,以4000r/min離心5min,將上清液至所述IOOmL雞心瓶中，在45°C旋轉(zhuǎn)濃縮至干；(4)將所述雞心瓶中的殘渣用ImL水溶解，超聲5min，加入3mL正己烷渦旋混合30s,靜置分層，棄掉上層的正己烷，再加3mL正己烷渦旋混合30s，靜置分層，移取水相于1.5mL的離心管中，以10000r/min離心5min，過0.2 μ m濾膜后，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定；(5)精確稱取氯霉素標準品IOmg于IOOmL容量瓶中，用色譜甲醇超聲溶解定容至刻度，為標準儲備液；將所述標準儲備液用色譜甲醇分別稀釋，配成0.1 μ g/mL, 0.2 μ g/mL, 0.4 μ g/mL, 0.8 μ g/mL和I μ g/mL的溶液；分別注入高效液相色譜_串聯(lián)質(zhì)譜測定；得到標準曲線；(6)將步驟(4)獲得的檢驗數(shù)據(jù)通過標準曲線計算待測樣品中氯霉素濃度；HPLC測定條件:
f)色譜柱:XTerra MS C18,150mmX 2.1mm，3.5 μ m。g)流動相及梯度洗脫條件:0-6分鐘流動相乙腈從20 %到90 %，流動相水從80 %到10 % ；6-8分鐘流動相乙腈從90 %到20 %，流動相水由10 %到80 % ；8-15分鐘流動相乙腈保持20%不變，流動相水保持80%不變；h)進樣量:5 μ L ；i)柱溫:35°C ;j)流速:0.2mL/min ；MS/MS參考條件h)電離方式:電噴霧電離，負離子(ES1-)；i)毛細管電壓:3.0OkV ；j)離子源溫度:110°C ;k)錐孔氣:氮氣，50L/Hr ；

I)脫溶劑氣:氮氣，700L/Hr，溫度400°C ；m)碰撞氣:IS氣；η)掃描模式:多反應(yīng)檢測(MM)模式。表I各種化合物的離子對和電壓
權(quán)利要求
1.一種功能食品中氯霉素殘留的HPLC-MS-MS檢測方法，其特征是包括如下步驟: (1)稱取Ig試樣，精確至0.0lg,置于50mL離心管中，加入15 μ L濃度為0.4 μ g/mL的氣代氯霉素作內(nèi)標溶液，加入15mL乙酸乙酯、0.45mL氫氧化銨，5g無水硫酸鈉，勻質(zhì)提取30s,以4000r/min離心5min,上清液轉(zhuǎn)移至IOOmL雞心瓶中； (2)取第二個50mL離心管，加入15mL乙酸乙酯和0.45mL氫氧化銨作為洗滌液，洗滌步驟(I)勻質(zhì)操作時用的刀頭10s，洗滌液移入所述IOOmL雞心瓶中，再向第二個50mL離心管中加入15mL乙酸乙酯和0.45mL氫氧化銨，用玻璃棒攪拌第二支離心管中的殘渣后，于漩潤振蕩器上潤旋提取Imin,超聲波提取5min,以4000r/min離心5min,上清液合并至所述IOOmL雞心瓶中； (3)向第二支離心管的殘渣中再加入15mL乙酸乙酯，于漩渦振蕩器上渦旋提取lmin，超聲波提取5min,以4000r/min離心5min,將上清液至所述IOOmL雞心瓶中，在45°C旋轉(zhuǎn)濃縮至干； (4)將所述雞心瓶中的殘渣用ImL水溶解，超聲5min，加入3mL正己烷渦旋混合30s，靜置分層，棄掉上層的正己燒，再加3mL正己燒潤旋混合30s,靜置分層,移取水相于1.5mL的離心管中，以10000r/min離心5min，過0.2μπι濾膜后，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定； (5)精確稱取氯霉素標準品IOmg于IOOmL容量瓶中，用色譜甲醇超聲溶解定容至刻度，為標準儲備液；將所述標準儲備液用色譜甲醇分別稀釋，配成0.1 μ g/mL, 0.2 μ g/mL,.0.4 μ g/mL, 0.8 μ g/mL和I μ g/mL的溶液；分別注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定；得到標準曲線； (6)將步驟(4)獲得的檢驗數(shù)據(jù)通過標準曲線計算待測樣品中氯霉素濃度； HPLC測定條件:a)色譜柱:XTerraMS C18,1 SOmmX 2.1mm, 3.5 μ m。
b)流動相及梯度洗脫條件: 0-6分鐘流動相乙腈從20%到90%，流動相水從80%到10% ； 6-8分鐘流動相乙腈從90%到20%，流動相水由10%到80% ； 8-15分鐘流動相乙腈保持20%不變，流動相水保持80%不變； c)進樣量:5yL; d)柱溫:35°C；e)流速:0.2mL/min ； MS/MS參考條件 a)電離方式:電噴霧電離，負離子(ES1-)； b)毛細管電壓:3.0OkV ；c)離子源溫度:110°C; d)錐孔氣:氮氣，50L/Hr； e)脫溶劑氣:氮氣，700L/Hr，溫度400°C； f)石並撞氣:気氣； g)掃描模式:多反應(yīng)檢測(MRM)模式。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種功能食品中氯霉素殘留的HPLC-MS-MS檢測方法，包括如下步驟稱取試樣，加入氘代氯霉素作內(nèi)標溶液，加入乙酸乙酯、氫氧化銨、無水硫酸鈉，勻質(zhì)提取，離心，上清液轉(zhuǎn)移至雞心瓶中；將雞心瓶中上清液濃縮至干；用水溶解，超聲，加入正己烷渦旋混合，靜置分層，棄掉上層的正己烷，再加正己烷渦旋混合，靜置分層，移取水相于離心管中，離心，過濾膜后，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定；另精確稱取氯霉素標準品用色譜甲醇超聲溶解定容，配成不同濃度的溶液；經(jīng)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定；得到標準曲線；將獲得的檢驗數(shù)據(jù)通過標準曲線計算待測樣品中氯霉素濃度；本發(fā)明的方法準確度好、精度高、線性良好。
文檔編號G01N30/88GK103175929SQ20111042919
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月20日
發(fā)明者趙曉娟, 李星芝, 王俊全 申請人:天津天獅生物發(fā)展有限公司, 天獅集團有限公司, 天津天獅生命源有限公司