專利名稱：一種指甲/趾甲毒物分析的前處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對(duì)證物鑒定分析的前處理方法，尤其涉及一種應(yīng)用在司法毒物鑒定中對(duì)指甲/趾甲鑒定的前處理方法。
背景技術(shù)：
指甲/趾甲的中毒藥物分析正成為輔助其他生物檢材證據(jù)的有力的一支，并有望在一些以往難以解決的涉毒藥物事(案)件中發(fā)揮其有力的作用。包埋于指甲/趾甲內(nèi)的毒藥物需經(jīng)前處理過(guò)程將其釋放以供儀器分析。陳航等人在2003年03期《法醫(yī)學(xué)雜志》上發(fā)表的“指(趾)甲在濫用藥物分析中的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用展望” 一文中，羅列了包括酸水解、堿消化和醇浸提在內(nèi)的常用的指甲處理中水解/消化處理的辦法。堿消化法通過(guò)熱堿徹底破壞組織及細(xì)胞結(jié)構(gòu)，會(huì)完全釋放其內(nèi)包埋的毒藥物，高溫和強(qiáng)堿環(huán)境會(huì)使得不穩(wěn)定化合物分解。酸水解法能疏松組織結(jié)構(gòu)，但由于大多數(shù)毒藥物為堿性，酸性環(huán)境的質(zhì)子化效應(yīng)能幫助包埋于組織內(nèi)的目標(biāo)物進(jìn)入提取液。指甲中存在大量原膠原構(gòu)成的膠原層級(jí)，原膠原結(jié)構(gòu)遇酸可迅速變性而交聯(lián)沉積，維持固化形態(tài)。因此，酸水解后的指甲橫斷面層級(jí)結(jié)構(gòu)較之未處理指甲更為明顯，內(nèi)外表面也較未處理前更為緊密。原膠原交聯(lián)沉積后形成致密的網(wǎng)反而阻止其中包埋毒藥物的釋放。甲醇浸提依靠指甲組織的溶脹效應(yīng)和甲醇本身對(duì)毒藥物的溶解性進(jìn)行提取，如電鏡所見(jiàn):由于溶脹效應(yīng)內(nèi)外表面均有一定的開(kāi)裂，橫斷面的層級(jí)結(jié)構(gòu)也由于溶脹效應(yīng)產(chǎn)生的力而被破壞。但其耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，難以適應(yīng)于需要快速獲取結(jié)果的法庭科學(xué)領(lǐng)域。綜合目前常用處理方法，對(duì)指甲/趾甲分析的前處理過(guò)程大多套用毛發(fā)分析前處理過(guò)程。由于毛發(fā)與指甲/趾甲組成和結(jié)構(gòu)方面的不同，簡(jiǎn)單的方法套用并不能保障方法的合理性和適用性。同時(shí)，指甲/趾甲分析的前處理過(guò)程大多采用酸、堿處理或有機(jī)溶劑浸泡等傳統(tǒng)方法來(lái)達(dá)到提取效果，此類方法在不同條件下分別存在雜質(zhì)影響多，對(duì)酸堿、熱不穩(wěn)定的目標(biāo)化合物不適合，釋放、提取效率低等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有檢驗(yàn)指甲/趾甲的前處理方法中存在的問(wèn)題，提供一種全新的指甲/趾甲毒物分析的全處理方法，改善可指甲/趾甲的微觀結(jié)構(gòu)，大幅度提高了釋放效率，避免了傳統(tǒng)的酸堿等劇烈化學(xué)方法可能對(duì)指甲/趾甲中毒藥物的影響。為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，提供一種指甲/趾甲毒物分析的前處理方法，包括以下順序步驟:步驟1:將待檢驗(yàn)指甲/趾甲和撞子一同置于研磨容器內(nèi)，將密封好的研磨容器置于低于-150°C的環(huán)境下研磨；步驟2:將研磨過(guò)的待檢驗(yàn)指甲/趾甲和萃取劑混合形成混合物，所形成混合物利用超聲波進(jìn)行萃取。在上述提供的前處理方法中，其中所述研磨前還包括預(yù)冷處理，所述預(yù)冷處理時(shí)間優(yōu)選控制在2 10分鐘之間。
在上述提供的前處理方法中，其中所述研磨過(guò)程中撞子球磨的時(shí)間為1~5分鐘，碰撞頻率為:3~15 S—1。研磨過(guò)程循環(huán)進(jìn)行2飛次，優(yōu)選循環(huán)2次研磨過(guò)程。在上述提供的前處理方法中，其中所述超聲波的頻率為30~40ΚΗz。在上述提供的前處理方法中，其中所述萃取時(shí)環(huán)境溫度為10~30°C。在上述提供的前處理方法中，其中所述萃取處理的時(shí)間為1~2小時(shí)。在上述提供的前處理方法中，其中所述萃取劑為甲醇、甲酸、乙醚、乙腈、乙酸銨、乙酸乙酯、氯仿中的一種或多種混合物，或者根據(jù)實(shí)際需求配置的萃取溶劑。其中，優(yōu)選的萃取液是乙腈和乙酸銨/甲酸以70:30的體積比所組成的混合物，所述乙酸銨/甲酸由20mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸所組成。本發(fā)明提供的指甲/趾甲毒物分析的前處理方法，將冷凍研磨和超聲波技術(shù)應(yīng)用在對(duì)指甲/趾甲的前處理中，能提高前處理過(guò)程的釋放效率，并保證前處理過(guò)程中毒藥物穩(wěn)定性，避免了傳統(tǒng)酸堿等化學(xué)處理方法對(duì)指甲/趾甲中毒藥物的影響。


圖1是冷凍研磨后指甲結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微鏡圖。圖2是超聲波處理后的指甲結(jié)構(gòu)掃描電子顯微鏡圖。圖3是酸水解處理后的指甲結(jié)構(gòu)掃描電子顯微鏡圖。圖4是甲醇浸泡處理后的指甲結(jié)構(gòu)掃描電子顯微鏡圖。圖5是剪刀絞碎的指甲顆粒超聲波處理前的掃描電子顯微鏡圖。圖6是剪刀絞碎的指甲顆粒超聲波處理后的掃描電子顯微鏡圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種指甲/趾甲毒物分析的前處理方法，包括:(1)將待檢驗(yàn)指甲/趾甲和撞子一同置于研磨容器內(nèi)，將密封好的研磨容器置于低于-150°C的環(huán)境下研磨；(2)將研磨過(guò)的待檢驗(yàn)指甲/趾甲和萃取劑混合形成混合物，所形成混合物利用超聲波進(jìn)行萃取。冷凍研磨是使用特制冷凍研磨儀進(jìn)行的樣品處理技術(shù)，其處理過(guò)程為將樣品裝入密閉的研磨容器浸入液氮，以電磁為動(dòng)力，帶動(dòng)撞子在液氮溫度環(huán)境下對(duì)樣品粉碎研磨。由于，樣品在低溫下變脆而更易研磨，同時(shí)低溫下的樣品中所含的組成信息和生物活性得到較好保留。超聲波處理是指使用超聲波清洗儀對(duì)樣品進(jìn)行處理的技術(shù)，藉由超聲波發(fā)生器及換能器使得儀器水槽中的液體流動(dòng)而產(chǎn)生頻率大于20KHz的機(jī)械縱波，其產(chǎn)生的巨大能量可用于多種樣品處理。以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的指甲/趾甲毒物分析的前處理方法做進(jìn)一步說(shuō)明，以便更好理解本發(fā)明創(chuàng)造的內(nèi)容，但實(shí)施例的內(nèi)容并不限制本發(fā)明創(chuàng)造要求保護(hù)的范圍。樣品采集
由于指甲和趾甲材質(zhì)、結(jié)構(gòu)及其他性質(zhì)相同，故本實(shí)施例中僅以指甲作為檢驗(yàn)對(duì)象。指甲收集來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室無(wú)指甲疾病、無(wú)藥物濫用史的健康志愿人員，使用潔凈鋼制指甲鉗取其日常指甲，修剪碎片收集于潔凈的離心管中，避光常溫儲(chǔ)存。樣品毒物分析的前處理方法
將取得的指甲樣品用十二烷基磺酸鈉溶液清洗3次，用去離子水震蕩，丙酮溶液沖洗。分別采用下列不同方法對(duì)清洗過(guò)的指甲進(jìn)行分析前處理。并將下述各種方法處理后的指甲殘片(或殘留物)及 機(jī)械剪碎和冷凍球磨后的指甲粉末，放于通風(fēng)櫥內(nèi)潔凈表面于常溫下干燥。干燥后的各樣品置于已鋪導(dǎo)電膠樣品臺(tái)上固定，用噴金鍍膜儀噴金，置于掃描電鏡工作倉(cāng)中，盡量設(shè)定短的工作距離，在高真空環(huán)境下觀察并作相應(yīng)記錄。實(shí)施例1
根據(jù)研磨管的大小取一定量待檢驗(yàn)指甲和不銹鋼撞子置入研磨管中(指甲用量在5飛Omg之間)，并用配套的蓋子密封，將密封好的研磨管置于冷凍研磨儀中，并加入液氮。預(yù)冷3飛分鐘后，球磨2分鐘，撞子的碰撞頻率控制在315^之間，并且循環(huán)研磨過(guò)程2 3次。將研磨得到的指甲粉末和LOmL由乙腈、乙酸銨和甲酸所組成的混合萃取劑中(萃取液中各物質(zhì)的配比為:乙腈:20mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸溶液=70 30 v/v)，將萃取液和指甲混合物置于20±3°C的恒溫環(huán)境下，用頻率為40KHz的超聲波，超聲處理I小時(shí)。對(duì)照實(shí)驗(yàn)I
將待檢驗(yàn)指甲機(jī)械剪碎，浸泡在ImL 10%氫氧化鈉溶液中，在80°C下保溫20分鐘。對(duì)照實(shí)驗(yàn)2
將采集到指甲機(jī)械剪碎，浸泡在0.lmol/L鹽酸中，在45°C下保溫18小時(shí)。對(duì)照實(shí)驗(yàn)3
將采集到指甲機(jī)械剪碎，浸泡在2mL的HPLC級(jí)甲醇中，在40°C下保溫24小時(shí)。對(duì)照實(shí)驗(yàn)4
將待檢驗(yàn)指甲機(jī)械剪碎，浸泡在1.0mL由乙腈、乙酸銨和甲酸所組成的混合萃取劑中(萃取液中各物質(zhì)的配比為:乙腈:20mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸溶液=70 30 v/v)，將萃取液和指甲混合物置于20±3°C的恒溫環(huán)境下，用頻率為40KHz的超聲波，超聲處理I小時(shí)。觀察經(jīng)過(guò)上述各方法處理后得到的溶液體系，發(fā)現(xiàn)實(shí)施例1的指甲樣品溶液體系中，可見(jiàn)白色粉末彌散于整個(gè)溶液體系中，指甲粉末懸濁在溶液中，久置緩慢沉降。對(duì)照實(shí)驗(yàn)I的指甲樣品在熱堿中迅速被消解，整個(gè)溶液呈明黃色，左右晃動(dòng)溶液有類似晃動(dòng)膠水感覺(jué)。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)2 4的指甲樣品溶液體系中，溶液底部存有微白色至透明碎片，整個(gè)液體澄清透明。干燥上述各方法處理后的指甲樣品，并通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察指甲表面情況。圖1和圖2分別是實(shí)施例1中冷凍研磨后指甲粉末結(jié)構(gòu)超聲波處理前后的掃描電子顯微鏡圖(放大倍數(shù)分別為X 1200和X 1200)。從圖中可以觀察到，冷凍研磨后的指甲粉末大小約為10 μ m，指甲粉末呈球形。超聲波處理后，微觀上仍基本保持球形，無(wú)粉末碎裂成更小的片段或球狀結(jié)構(gòu)展開(kāi)痕跡。對(duì)照實(shí)驗(yàn)I的指甲碎片，在堿消化后指甲顯微結(jié)構(gòu)被完全破壞，將產(chǎn)生膠狀溶液體系鋪展吹干后呈現(xiàn)土壤狀。圖3是酸水解處理后的指甲結(jié)構(gòu)掃描電子顯微鏡圖，從左到右分別顯示了指甲的外表面、橫斷面和內(nèi)表面，放大倍數(shù)分別為X160、X600和X 150。圖4是甲醇浸泡處理后的指甲結(jié)構(gòu)掃描電子顯微鏡圖，從左到右分別顯示了指甲的外表面、橫斷面和內(nèi)表面，放大倍數(shù)分別為X160、X1200和X160。對(duì)照實(shí)驗(yàn)2和對(duì)照實(shí)驗(yàn)3的指甲碎片，經(jīng)酸水解或醇浸泡后，指甲的外表面粗糙，多處表層結(jié)構(gòu)翻起。指甲內(nèi)表面的波紋狀結(jié)構(gòu)被破壞或消失，其中醇處理過(guò)后的指甲內(nèi)表面可見(jiàn)開(kāi)裂。酸水解后指甲的內(nèi)部層級(jí)式的結(jié)構(gòu)較正常指甲更為明顯且略顯緊致，醇浸泡后的層級(jí)結(jié)構(gòu)模糊難以辨認(rèn)。圖5和圖6分別是剪刀絞碎的指甲顆粒超聲波處理前后的掃描電子顯微鏡圖，放大倍數(shù)依次是X98和X98。從圖中看到，對(duì)比實(shí)驗(yàn)4的指甲碎片使用剪刀機(jī)械性絞碎，指甲顆粒大小約為直徑1mm，經(jīng)超聲處理后球形的顆粒呈被擊碎狀展開(kāi)。實(shí)施例1中，將指甲冷凍研磨成為約為ΙΟμπι類球形顆粒粉末，有效的增大指甲粉末的比表面積，更多的比表面積意味著與提取溶劑更多的接觸，大幅度增加了指甲中毒藥物進(jìn)入提取溶劑的機(jī)會(huì)，使釋放效率增高。由于指甲為保護(hù)指端不受傷害而存在的致密及微弧形結(jié)構(gòu)，使其質(zhì)地較為堅(jiān)硬，難以使用普通剪刀絞碎至足夠小顆粒。使用剪刀機(jī)械性絞碎指甲時(shí)，每份指甲平均花費(fèi)10分鐘絞碎至Imm左右顆粒且極為費(fèi)力，冷凍研磨約花費(fèi)同樣的時(shí)間下提高指甲粉末比表面積約100倍。此外，機(jī)器研磨可保證顆粒大小的均勻，同時(shí)低溫能有效保證處理過(guò)程中指甲內(nèi)毒藥物的穩(wěn)定性。超聲波處理產(chǎn)生的空泡效應(yīng)能將指甲的組織間隙撕開(kāi)形成一空泡，此空泡會(huì)隨周圍介質(zhì)的振動(dòng)而瞬間被周圍的液體或氣體填充。如果被填充的是液體，則由于強(qiáng)大的吸引力造成液體撞擊指甲組織面兒產(chǎn)生大量的固液物質(zhì)交換。如果被填充的是氣體，由氣體的膨脹效應(yīng)能產(chǎn)生較大的切向力促使更多組織間隙被拉開(kāi)。對(duì)依靠死細(xì)胞和角蛋白的堆積力層疊起來(lái)的指甲結(jié)構(gòu)，空泡效應(yīng)與機(jī)械效應(yīng)產(chǎn)生的較大的切相力，足以撕裂組織間隙造成顆粒被擊碎展開(kāi)的情形。組織間隙被撕開(kāi)而增大的表面積和空泡效應(yīng)，使得固液物質(zhì)交換釋放效率的增高。超聲波處理帶來(lái)的熱效應(yīng)將包埋于指甲內(nèi)部的毒藥物分子運(yùn)動(dòng)加速，有利于溶解入提取溶劑，但同時(shí)易造成超聲水槽內(nèi)的水溫過(guò)高，對(duì)溫度敏感的毒藥物會(huì)產(chǎn)生破壞作用，影響冷凍研磨帶來(lái)的低溫優(yōu)勢(shì)。故本實(shí)施例1中超聲波處理的環(huán)境溫度控制在20±3°C的恒溫環(huán)境下。綜上所述，本發(fā)明將冷凍研磨與超聲波技術(shù)結(jié)合使用在指甲檢材的前處理中，與傳統(tǒng)的前處理方法相比，改善了指甲的微觀結(jié)構(gòu)，大大提高了釋放效率，避免了酸堿等劇烈化學(xué)方法可能對(duì)指甲中毒藥物的影響。同時(shí)整個(gè)前處理過(guò)程控制一定的溫度，可保證毒藥物的穩(wěn)定性。冷凍研磨聯(lián)合超聲波前處理技術(shù)更適用于指甲中毒藥物分析的需要。以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種指甲/趾甲毒物分析的前處理方法，其特征在于，包括以下順序步驟: 步驟1:將待檢驗(yàn)指甲/趾甲和撞子一同置于研磨容器內(nèi)，將密封好的研磨容器置于低于-150°c的環(huán)境下研磨； 步驟2:將研磨過(guò)的待檢驗(yàn)指甲/趾甲和萃取劑混合形成混合物，所形成混合物利用超聲波進(jìn)行萃取。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述前處理方法，其特征在于，所述研磨前還包括預(yù)冷處理，所述預(yù)冷處理時(shí)間為2 10分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述前處理方法，其特征在于，所述研磨過(guò)程中撞子球磨的時(shí)間為Γ5分鐘，碰撞頻率為3 15s—1。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述前處理方法，其特征在于，所述研磨過(guò)程循環(huán)進(jìn)行2飛次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述前處理方法，其特征在于，所述超聲波的頻率為3(Γ50ΚΗζ。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述前處理方法，其特征在于，所述萃取時(shí)環(huán)境溫度為1(T30°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述前處理方法，其特征在于，所述萃取處理的時(shí)間為f2小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述前處理方法，其特征在于，所述萃取劑為甲醇、甲酸、乙醚、乙腈、乙酸銨、乙酸乙酯、氯仿中的一種或多種混合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述前處理方法，其特征在于，所述萃取液為乙腈和乙酸銨/甲酸以70:30的體積比所組成的混合物，所述乙酸銨/甲酸由20mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸所組成。
全文摘要
本發(fā)明提供一種指甲/趾甲毒物分析的前處理方法，包括(1)將待檢驗(yàn)指甲/趾甲和撞子一同置于研磨容器內(nèi)，將密封好的研磨容器置于低于-150℃的環(huán)境下研磨；(2)將研磨過(guò)的待檢驗(yàn)指甲/趾甲和萃取劑混合形成混合物，所形成混合物利用超聲波進(jìn)行萃取。本發(fā)明提供的指甲/趾甲毒物分析的前處理方法，將冷凍研磨和超聲波技術(shù)應(yīng)用在對(duì)指甲/趾甲的前處理中，能提高前處理過(guò)程的釋放效率，并保證前處理過(guò)程中毒藥物穩(wěn)定性，避免了傳統(tǒng)酸堿等化學(xué)處理方法對(duì)指甲/趾甲中毒藥物的影響。
文檔編號(hào)G01N1/28GK103175716SQ20111042924
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2011年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月20日
發(fā)明者陳航, 向平, 孫其然, 沈敏 申請(qǐng)人:司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所